CN111000835A - 一种刺甘草查耳酮的医药新用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种刺甘草查耳酮的医药新用途。勃起功能障碍被视为心血管或外周血管病变的先兆或身体健康状况的晴雨表，严重影响患者身心健康和男女双方性生活的质量。磷酸二酯酶5(PDE5)属超家族酶，PDE5抑制剂主要用于治疗勃起功能障碍，目前已有多种药物(如伟哥)上市。本发明发现，刺甘草查耳酮对磷酸二酯酶5具有较强的抑制活性，具备开发成磷酸二酯酶5抑制剂进而用于制备治疗勃起功能障碍药物的前景。

Description

一种刺甘草查耳酮的医药新用途
技术领域
本发明涉及已知化合物的新用途，具体涉及甘草中已知化合物的新用途，更具体地涉及一种刺甘草查耳酮的医药新用途。
背景技术
勃起功能障碍(ED)被视为心血管或外周血管病变的先兆或身体健康状况的晴雨表，严重影响患者身心健康和男女双方性生活的质量(参考文献：方丹波等，勃起功能障碍治疗进展，现代实用医学2019年6月)。
磷酸二酯酶5(PDE5)属超家族酶，PDE5抑制剂主要用于治疗勃起功能障碍，目前已有多种药物(如伟哥)上市。勃起由性刺激引发，性刺激使阴茎海绵体细胞释放NO，NO进入平滑肌内皮细胞激活鸟苷酸环化酶，此酶催化合成第二信使cGMP，cGMP可激活Ga+离子通道，使血管平滑肌舒张，血液进入阴茎，阴茎充血，从而阴茎勃起。PDE5是一种胞内酶，是阴茎海绵体组织中含量最高的磷酸二酯酶，可催化降解cGMP为GMP。PDE5抑制剂能够降低PDE5的活性，使胞内cGMP的浓度增加，从而引发和维持阴茎勃起(参考文献：王林啸等，磷酸二酯酶5抑制剂的研究进展，中国药物化学杂志2017年10月)。
天然产物一直是防病、治病药物的主要来源，在神经退行性疾病治疗方面有悠久的历史和坚实的基础。尽管人工合成的药物在药物研发中占有相当大的比重，但是临床上应用的很多药物都是直接或间接来源于天然产物。天然产物依然是治疗重大疾病的药物或先导化合物的主要源泉之一。因此，从天然产物中寻找高效低毒且选择性强的PDEs活性抑制成分越来越受到科学家的重视(参考文献：磷酸二酯酶天然抑制剂的研究进展，中草药2018年10月)。
甘草为豆科甘草属植物干燥的根和根茎，是我国重要的大宗药材之一。现代科学研究证实:甘草除具有镇痛、止咳、抗炎、抗溃疡、抗变态反应等作用外，还有增强机体免疫、抗肿瘤、抗氧化和抗病毒的功能，尤其对艾滋病、乙肝、带状疱疹及SARS病毒等方面作用更显著。甘草的的丰富药理作用与其种类和数量丰富的化学成分有直接的关系。先后从甘草属植物中提取、分离、鉴定了200多种化学成分，涉及甘草属植物10个种。其中最重要并已证实具有生物活性的成分主要是甘草酸等三萜皂苷类、黄酮类、香豆素类、多糖、生物碱、氨基酸等(参考文献：甘草生物学及化学成分的研究进展，中草药，2005年11月)。
半甘草异黄酮B、粗毛甘草素C和刺甘草查耳酮为分离自甘草中的3种天然产物。虽然研究表明这三种化合物具有多种药理活性，但是目前还没有见其可以用作PDE5抑制剂的作用报道，也没有见其可以用于治疗勃起功能障碍的报道。
发明内容
本发明第一目的是为了提供一种刺甘草查耳酮用于制备磷酸二酯酶5抑制剂的医药新用途，第二目的是为了提供刺甘草查耳酮在制备治疗勃起功能障碍的药物中的应用。
为了达到上述目的，本发明提供了如下技术方案：
一种刺甘草查耳酮用于制备磷酸二酯酶5抑制剂的医药新用途。刺甘草查耳酮对磷酸二酯酶5具有较强的抑制作用，且呈现明显的浓度依赖性。
一种刺甘草查耳酮在制备治疗勃起功能障碍的药物中的应用。勃起由性刺激引发，性刺激使阴茎海绵体细胞释放NO，NO进入平滑肌内皮细胞激活鸟苷酸环化酶，此酶催化合成第二信使cGMP，cGMP可激活Ga+离子通道，使血管平滑肌舒张，血液进入阴茎，阴茎充血，从而阴茎勃起。PDE5是一种胞内酶，是阴茎海绵体组织中含量最高的磷酸二酯酶，可催化降解cGMP为GMP。PDE5抑制剂能够降低PDE5的活性，使胞内cGMP的浓度增加，从而引发和维持阴茎勃起。具有PDE5抑制活性的刺甘草查耳酮具有开发成抗ED药物的前景。
有益的效果：
本发明发现，刺甘草查耳酮对磷酸二酯酶5具有较强的抑制活性，具备开发成磷酸二酯酶5抑制剂进而用于制备治疗勃起功能障碍药物的前景。
附图说明
图1为不同浓度半甘草异黄酮B对磷酸二酯酶5的抑制作用曲线；
图2为不同浓度粗毛甘草素C对磷酸二酯酶5的抑制作用曲线；
图3为不同浓度刺甘草查耳酮对磷酸二酯酶5的抑制作用曲线。
具体实施方式
一、实验材料
半甘草异黄酮B、粗毛甘草素C和刺甘草查耳酮纯度≥98％。分别使用DMSO配制成线性梯度溶液，在磷酸二酯酶5的抑制作用反应体系中加入2μL，使半甘草异黄酮B、粗毛甘草素C或刺甘草查耳酮在反应体系中的终浓度分别为10、20、50、100、200、500nM。
阳性药物为西地那非，溶液配制方法和添加量同上，在反应体系中的终浓度5nM。
临用前4h配制，溶解混匀后4℃保存。
二、实验方法
磷酸二酯酶5的抑制作用参照中山大学药学院郭谦亮等公开的方法进行(参考文献：玛咖不同提取部位对磷酸二酯酶5抑制作用的谱-效关系研究，中草药2017年2月)。其中，磷酸二酯酶5表达与纯化按文献报道方法进行(Wang H,Liu Y,Huai Q,et al.Multipleconformations ofphosphodiesterase-5:implications for enzyme function and drugdevelopment[J].J Biol Chem,2006,281(30):21469-21479.)。具体如下：
将构建的质粒pET15b-PDE5转化入大肠杆菌菌株(E.coli)BL21-Codonplus中。携带重组质粒的E.coli细胞在含有100μg/mL氨苄青霉素、30μg/mL氯霉素和0.4％葡萄糖的LB培养基(每升培养基含有10g胰蛋白胨、5g酵母提取物和5gNaCl)中，37℃下长到吸光度值(A600nm)为0.7。然后加入0.1mmol/L异丙基-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达，在15℃下继续生长16h。4500r/min离心30min收集细胞，-80℃保存。
大肠杆菌表达的PDE5蛋白分别通过Ni-NTA亲和柱、Q-Sepharose离子交换柱、Sephacryl S300分子筛色谱柱来纯化，待SDS-PAGE电泳显示其纯度不低于90％时用于后续实验。
取1/100纯水稀释的氚代cGMP(20000～30000cpm)4μL，用缓冲液(50mmol/LTrispH8.0、10mmol/L MgCl2、0.5mmol/L二硫苏糖醇)稀释至58μL，然后加入待测药物溶液2μL，设置的溶剂对照组中加入2μLDMSO，混匀。再加入已用缓冲液稀释的水解率约60％的蛋白质溶液(备注：此处蛋白质溶液的浓度需要预实验确定，所谓的水解率约60％指的是在不加PDE5抑制剂的情况下，在该反应体系中，能将约60％的cGMP水解成GMP)40μL，阴性对照A、B组中加入40μL缓冲液，轻轻混匀，在25℃下静置反应15min。最后依次加入0.2mol/LZnSO4200μL和0.2mol/LBa(OH)2溶液200μL终止反应，振荡混合均匀。14000r/min离心5min。取上清液430μL，转移至液闪管中，加入闪烁液2.5mL，振荡混合均匀后用液体闪烁计数仪测定各反应体系单位时间(1min)内的CPM值，按以下公式计算抑制率。试验设三个平行。
Figure BDA0002345611640000031
Figure BDA0002345611640000032
其中，待测药物组cGMP水解量用阴性对照B组CPM值与待测药物组CPM值的差值表示，溶剂对照组cGMP水解量用阴性对照A组CPM值与溶剂对照组CPM值的差值表示。
采用SPSS 19.0分析数据，计量资料以均值±SD表示，并绘制不同浓度药物对磷酸二酯酶5的抑制作用曲线。
三、实验结果
不同浓度半甘草异黄酮B、粗毛甘草素C或刺甘草查耳酮对磷酸二酯酶5的抑制作用如表1和图1～3所示，虽然三种化合物对磷酸二酯酶5的抑制强度存在差异，但是都具有较强的抑制作用，且呈现明显的浓度依赖性。
表1不同浓度化合物对磷酸二酯酶5的抑制率
Figure BDA0002345611640000041
上述试验结果表明，半甘草异黄酮B、粗毛甘草素C或刺甘草查耳酮具备开发成磷酸二酯酶5抑制剂进而用于制备治疗勃起功能障碍药物的前景。

Claims (2)

1.一种刺甘草查耳酮用于制备磷酸二酯酶5抑制剂的医药新用途。
2.一种刺甘草查耳酮在制备治疗勃起功能障碍的药物中的应用。
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CN105232501A (zh) * 2015-11-17 2016-01-13 北京大学 刺甘草査尔酮的新用途

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