CN110997655A - 水溶性三甲氧基苯基吡啶类络合剂及相应的镧系络合物 - Google Patents

水溶性三甲氧基苯基吡啶类络合剂及相应的镧系络合物 Download PDF

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Abstract

本发明涉及式(I)的络合剂
Figure DDA0002379305190000011
其中，Ra、发色团1、发色团2和发色团3如说明书中所定义。本发明还涉及由所述络合剂获得的镧系元素络合物。本发明可用于标记生物分子。

Description

水溶性三甲氧基苯基吡啶类络合剂及相应的镧系络合物
技术领域
本发明涉及水溶性络合剂或配体、从这些络合剂获得的镧系元素络合物以及涉及这些镧系元素络合物用于对分子进行标记并通过时间分辨荧光技术对它们进行检测的用途。本发明描述了包含一个、两个或三个水溶性官能化三甲氧基苯基吡啶类发色团的稳定络合物。
背景技术
在过去20年中，镧系元素络合物的应用在生命科学领域中得到了极大的发展。实际上这些荧光化合物具有感兴趣的光谱特性，这使得它们成为用于对生物分子进行检测的首选标记。这些荧光化合物特别适合与相容的荧光团一起用于进行FRET(
Figure BDA0002379305170000012
共振能量转移)测量，其在研究生物分子之间相互作用中的应用已被几家公司商业开发，包括CisbioBioassays及其
Figure BDA0002379305170000011
产品系列。镧系元素络合物的相对长寿命还使得可以进行时间分辨荧光测量，即，在荧光团的激发之后具有延迟，这使得可限制由于测量介质而引起的荧光干扰。该后述特征在当测量介质变得更接近生物介质(包含许多其荧光可能干扰所研究化合物的荧光的蛋白质)时更加有用。
已经公开了几种镧系元素络合物并且一些已被商业化开发：可以特别提及的是大的多环镧系元素穴状化合物(EP-A-0180492、EP-A-0321353、EP-A-0601113、WO 2001/96877；WO 2008/063721)；包含与二乙撑三胺五酸单元连接的、衍生自香豆素的单元的镧系元素络合物(US 5,622,821)；以及包含吡啶衍生物(US 4,920,195、US 4,761,481)、联吡啶衍生物(US 5,216,134)或三联吡啶衍生物(US 4,859,777、US 5,202,423、US 5,324,825)的那些镧系元素络合物。
荧光镧系元素络合物由三部分组成：
-吸光发色团(天线效应)，
-络合部分，以及
-属于镧系元素组的原子(通常为铕或铽)。
在这一领域工作的团队已经使用了大量的发色团，并且他们的工作已成为许多综述文章的主题：Journal of Luminescence 1997，75，149；Chemical Reviews 2010，110，2729；以及Inorganic Chemistry 2014，53，1854。在这些工作中，少数工作涉及三甲氧基苯基吡啶发色团。在Journal of Luminescence 1997，75，149中，作者描述了三甲氧基苯基吡啶二羧酸衍生物的光物理性质，该衍生物在形式上是在水性环境中不稳定的螯合物。在Analytical Chemistry 2005，77，2643中，作者将该单元引入纳米颗粒以使它们在免疫分析中有用。然而，这些颗粒较大(直径为45nm)，当用荧光探针标记小生物分子时，其是缺点。
申请WO 89/04826涉及包含三个三甲氧基苯基吡啶类发色团的镧系元素络合物的合成。这些络合物属于螯合物组，这使得它们是非常不稳定的络合物，特别是在二价阳离子或EDTA类的络合剂存在下，所述二价阳离子或EDTA类的络合剂用作免疫分析缓冲液中的添加剂。
在申请WO 2005/058877中，作者描述了包含三甲氧基苯基吡啶单元的络合物。已将这些发色团并入各种结构中：
-当将它们并入螯合物中时，它们形成在上述介质(二价阳离子和EDTA)中不稳定的络合物；
-当将发色团整合到三氮杂环壬烷类(TACN)的大环中时，此时络合物是稳定的，但在生物水性介质中具有相当低的溶解度。此外，官能化是不可能直接进行的，并且作者没有描述用于使这些系统官能化的任何过程；
-最后，当将这些发色团并入三氮杂环癸烷类的大环中时，络合物在生物水性介质中仍具有相当低的溶解度。在大环的丙烯链的中间碳上进行官能化，这改变了关于镧系元素原子的对称性，并因此改变了发射光谱的谱线分布。
发明内容
本发明旨在通过提供在EDTA和大多数二价阳离子的存在下稳定且在所有生物介质中可溶的络合物来克服现有技术化合物的缺点，因为本发明的络合物包含阴离子型、阳离子型或两性离子型的水增溶基团以及最后直接取代在三氮杂环壬烷环的乙烯链上的官能化臂，所述三氮杂环壬烷环是特别适合镧系元素原子络合的环并且其符合镧系元素周围的C3类对称。本发明的络合物提供了下述化合物，所述化合物的发射光谱很好地适于它们在FRET实验中的应用，并非常方便地用于对生物分子进行标记。
附图说明
图1至图3分别示出了本发明的代表性络合物的UV光谱、色谱和质谱。
图4至图6分别示出了本发明的代表性络合物的UV光谱、色谱和质谱。
图7至图9分别示出了本发明的代表性络合物的UV光谱、色谱和质谱。
具体实施方式
络合剂
本发明所述的络合剂为式(I)的化合物：
Figure BDA0002379305170000031
其中：
-发色团1、发色团2和发色团3各自表示式(Ia)或式(Ib)的基团：
Figure BDA0002379305170000032
-X1和X2各自表示基团L1-CO-R或L2-G；
-R为基团-OR2或-NH-E；
-Ra为H或基团-(CH2)l-G；
-R1为基团-CO2H或-PO(OH)R3；
-R2为H或(C1-C4)烷基；
-R3为(C1-C4)烷基，优选甲基；任选地由基团-SO3 -取代的苯基，所述基团-SO3 -优选在间位或对位；或苄基；
-L1为直接键合；基团-(CH2)r-，其任选地由选自氧原子、氮原子和硫原子的至少一个原子中断；-CH＝CH-基团；-CH＝CH-CH2-基团；-CH2-CH＝CH-基团；或PEG基团；
-L2为二价连接基团；
-G为反应性基团；
-E为基团-CH2-(CH2)s-CH2-SO3 -或-N+Alk1Alk2Alk3，或磺基甜菜碱；
-l为1至4范围内的整数；
-r为1至6、优选1至3范围内的整数；
-s为0、1或2；
-Alk1、Alk2、Alk3可相同或不同，表示(C1-C6)烷基；
应当理解，式(I)的化合物包含至少一个式(Ia)的基团和至少一个基团L1-CO-R。
“PEG基团”是指式-CH2-(CH2OCH2)y-CH2OCH3的聚乙二醇基团，y是1至5范围内的整数。
“磺基甜菜碱”是指选自以下的基团：
Figure BDA0002379305170000041
R4表示(C1-C6)烷基，优选甲基或乙基，t等于1、2、3、4、5或6，并且优选等于1或2；式-(CH3)2N+-(CH2)3-SO3 -的磺基甜菜碱是优选的。
根据pH，基团-SO3H、-CO2H和-PO(OH)2为去质子化形式或非去质子化形式。因此，这些基团在下文中还指基团-SO3 -、-CO2 -和-PO(OH)O-，反之亦然。
第一优选的络合剂族由式(I)的化合物组成，其中，发色团1表示其中X1是基团L2-G的式(Ia)的基团，发色团2和发色团3(可相同或不同)各自表示其中X2是基团L1-CO-R的式(Ib)的基团。在一个实施方式中，发色团2和发色团3相同。
第二优选的络合剂族由式(I)的化合物组成，其中，发色团1和发色团2(可相同或不同)各自表示其中X1是基团L1-CO-R的式(Ia)的基团，发色团3表示其中X2是基团L2-G的式(Ib)的基团。在一个实施方式中，发色团1和发色团2相同。
在对前两个优选的络合剂族通用的一个实施方式中，Ra是H。
第三优选的络合剂族由式(I)的化合物组成，其中，发色团1、发色团2和发色团3可相同或不同，各自表示其中X1是基团L1-CO-R的式(Ia)的基团；Ra是基团-(CH2)l-G。在一个实施方式中，发色团1、发色团2和发色团3相同。
在这三个优选的族中，优选的亚族是其中络合剂包括一个或多个以下特征的那些：
-R1是基团-CO2H或-P(O)(OH)R3，其中R3是(C1-C4)烷基或苯基；
-L1为直接键合；基团-(CH2)r-，所述基团-(CH2)r-任选地由选自氧原子和硫原子的至少一个原子中断，并且r＝2或3；-CH＝CH-基团；-CH＝CH-CH2-基团；或-CH2-CH＝CH-基团；
-E为基团-CH2-(CH2)s-CH2-SO3 -，s＝0或1；-(CH2)s-N+Alk1Alk2Alk3，Alk1、Alk2、Alk3(可相同或不同)表示(C1-C4)烷基，并且s＝0或1；或者下式的基团：
Figure BDA0002379305170000051
其中，R4是(C1-C4)烷基，并且t是1或2。
在本发明的一个实施方式中，当式(I)的络合剂包含多个基团E时，这些基团中的至多一个表示磺基甜菜碱。
由间隔臂L2携带的反应性基团G使得可以将本发明所述的化合物偶联至希望产生荧光的物质(例如有机分子、肽、蛋白质或核苷酸(RNA、DNA))。用于使两个有机分子缀合的技术基于反应性基团的使用，并且形成本领域技术人员的常识的一部分。这些经典技术描述于例如Bioconjugate Techniques，G.T.Hermanson，Academic Press，2008年第二版，pp.169-211。
典型地，反应性基团是亲电基团或亲核基团，当将其分别引入到合适的亲核基团或亲电基团存在下的情况中时可以形成共价键。包含反应性基团的本发明所述的化合物与携带官能团的有机分子、肽或蛋白质之间的缀合反应使得包含反应性基团的一个或多个原子的共价键的形成。
优选地，反应性基团G是衍生自以下化合物中的一个的基团：丙烯酰胺、活化胺(例如，尸胺或乙二胺)、活化酯、醛、卤代烷、酸酐、苯胺、叠氮化物、氮杂环丙烷、羧酸、重氮烷、卤代乙酰胺、卤化三嗪(例如一氯三嗪、二氯三嗪)、肼(包括酰肼)、亚氨酸酯、异氰酸酯、异硫氰酸酯、马来酰亚胺、磺酰卤、或硫醇、酮、胺、酰卤、琥珀酰亚胺酯、羟基琥珀酰亚胺酯、羟基磺基琥珀酰亚胺酯、叠氮基硝基苯基、叠氮基苯基、3-(2-吡啶基二硫代)丙酰胺基、乙二醛、三嗪、乙炔基团，以及特别是选自于下式基团的基团：
Figure BDA0002379305170000071
其中，w从0至8变化，v等于0或1，Ar是包含1至3个杂原子的饱和或不饱和的5元或6元杂环，所述5元或6元杂环任选地由卤素原子取代。
优选地，反应性基团G是胺(任选地以-NHBoc形式保护)、琥珀酰亚胺酯、卤代乙酰胺、肼、异硫氰酸酯、马来酰亚胺基团或羧酸(任选地以基团-CO2Me、-CO2tBu的形式保护)。在后一种情况下，为了能与亲核物质反应，酸将必须以酯的形式活化。
反应性基团G通过共价键结合到络合剂上，或者通过间隔臂结合到络合剂上，所述间隔臂有利地由二价有机基团构成。因此，间隔臂L2可选自：
-直接键合；
-直链或支链的C1-C20亚烷基基团，所述亚烷基基团任选地含有一个或多个双键或三键；
-C5-C8环亚烷基基团；C6-C14亚芳基基团；
所述亚烷基、环亚烷基或亚芳基基团任选地含有一个或多个杂原子(例如氧、氮、硫、磷)或一个或多个氨基甲酰基或甲酰胺基基团，并且所述亚烷基、环亚烷基或亚芳基基团任选地由1至5个(优选1至3个)C1-C8烷基、C6-C14芳基、磺酸基或氧代基团取代。
-选自下式二价基团的基团：
Figure BDA0002379305170000081
Figure BDA0002379305170000091
其中，n、m、p、q是1至16(优选1至5)的整数，e是1至6(优选1至4)范围内的整数。
优选地，基团-L2-G由反应性基团G和间隔臂L2组成，所述反应性基团G选自羧酸(任选地以基团-CO2Me、-CO2tBu的形式保护)、胺(任选地以-NHBoc形式保护)、琥珀酰亚胺酯、卤代乙酰胺、肼、异硫氰酸酯、马来酰亚胺基团，所述间隔臂L2由含有1至5个碳原子的亚烷基链或选自下式基团的基团组成：
Figure BDA0002379305170000092
其中n、m是1至16、优选1至5的整数，e是1至6、优选1至4范围内的整数，基团G连接至这些二价基团的一端或另一端。
具体实施方式
通过由三氮杂化大环(1,4,7-三氮杂环壬烷，下文中称为TACN)组成的络合剂解决了上述问题，所述三氮杂化大环的氮原子被三甲氧基苯基吡啶类发色团取代，其中4位的甲氧基已被基团O-X1取代，这使得易于引入水增溶官能团。本发明所述的络合剂与镧系元素形成稳定的络合物，并且可以用于制备感兴趣分子的荧光缀合物。本发明所述的镧系元素络合物具有优异的光物理性质，特别是在它们的量子效率、发光寿命和激发光谱方面，其非常适合于在约337nm下的激光激发。本发明的络合物可以包含一个、两个或三个发色团，这允许容易地调节络合物的总亮度以及络合物的尺寸。当络合物包含发色团时，具有很小的空间位阻。三个发色团的存在显著增加了摩尔吸收系数(ε，epsilon)并因此增加了络合物的总亮度，并且络合物在水性介质中的溶解度使得它们非常适合用于生物介质中。最后，由TACN环携带的NH2官能团允许容易地与生物分子生物缀合。特别地，该官能团容易转化成生物学家优选的官能团N-羟基琥珀酰亚胺酯。
络合物
本发明还涉及由上述络合剂络合的镧系元素原子组成的镧系元素络合物，所述镧系元素选自：Eu3+、Sm3+、Tb3+、Gd3+、Dy3+、Nd3+、Er3+。优选地，镧系元素为Tb3+、Sm3+或Eu3+，甚至更优选Tb3+。
这些络合物通过使本发明所述的络合剂与镧系元素盐相接触来制备。因此，在溶剂(与这些盐相容的乙腈、甲醇或其它溶剂)或缓冲液中，1当量络合剂与1至5当量镧系元素盐(处于氯化物、乙酸盐或三氟甲磺酸盐形式的铕、钐或铽)之间在室温下持续几分钟的反应产生相应的络合物。
如上所述，所获得的荧光络合物具有优异的光物理性质，特别是在它们的量子效率、发光寿命和它们的激发光谱方面，这非常适合于在约337nm下的激光激发。此外，它们的发射光谱的谱带分布赋予络合物在具有青色素、荧光素、罗丹明或别藻蓝蛋白型的受体(例如，由Cisbio Bioassays出售的XL665)的FRET应用中非常有利的性质。由于这些络合物在含有大多数二价阳离子(Ca2+、Mg2+等)或EDTA的生物介质中的高稳定性，与现有技术的络合物相比，它们的发光保持优异。
缀合物
含有基团-L2-G本发明所述的络合剂和镧系元素络合物特别适合用于对含有官能团的有机或生物分子进行标记，所述官能团能够与反应性基团反应以形成共价键。因此，本发明还涉及镧系元素络合物用于对感兴趣分子(蛋白质、抗体、酶、激素、RNA、DNA等)进行标记的用途。
本发明还涉及用本发明所述的络合物标记的分子。如果所有有机或生物分子具有能够与反应性基团反应的官能团，则它们可与本发明所述的络合物缀合。特别地，本发明所述的缀合物包含本发明所述的络合物和选自以下的分子：氨基酸、肽、蛋白质、抗体、糖、糖链、核苷、核苷酸(DNA、RNA)、寡核苷酸、酶底物(特别是自杀酶底物，例如苄基鸟嘌呤或苄基胞嘧啶(以名称Snaptag和Cliptag出售的酶底物))、氯烷烃(以名称Halotag出售的酶底物)、辅酶A(以名称ACPtag或MCPtag出售的酶底物)。
合成
下面示意性地描述关于制备本发明所述的络合剂(配体)和络合物的通常策略(方案1：单天线，方案2：双天线以及方案3：三天线)，并且在实验部分中进行更为详细地描述。
Figure BDA0002379305170000111
方案1
从单保护的三氮杂环壬烷大环Boc 1开始，引入将用于连接两个增溶基团E的两个吡啶基单元。除去保护基团Boc，然后将天线(发色团)添加到大环上，从而得到配体3。酯(羧酸酯和次膦酸酯)的水解通常使用碱性条件进行。然后，这使得可以并入镧系元素原子(Ln)，从而形成络合物5。从这些络合物出发，引入了两个增溶官能团E。最后，在由天线(发色团)携带的保护基团Boc脱保护之后，络合物被官能化(7)，使得它们可以缀合在生物分子上。
Figure BDA0002379305170000121
方案2
使用类似的策略获得双天线系统，但是反转引入吡啶基单元和发色团的顺序。此次，首先引入天线，产生化合物8。除去Boc基团后，引入最后的吡啶基单元。其余是相同的，即酯官能团(羧酸酯和次膦酸酯)的水解，镧系元素络合物的形成，两个水增溶官能团E(此次这些官能团由发色团携带)的引入，然后并入官能团，从而产生双天线族13。
Figure BDA0002379305170000131
方案3
对于三天线络合物，由于胺官能团(使得能够引入官能团)直接固定在三氮杂环壬烷大环(TACN)上，因此简化了合成。因此，在第一步中引入三个发色团，随后水解酯官能团(羧酸酯和次膦酸酯)，然后与所期望的镧系元素络合。通过将增溶基团E固定在每个发色团上使络合物变得可溶。在胺脱保护后，该官能团转化为允许生物缀合的反应性官能团。
1)吡啶基模块(block)的制备
以下给出的方案(4-12)描述了三官能吡啶基衍生物的各种合成途径：
-在2位上，络合官能团(羧酸或次膦酸)；
-在4位上，允许引入水溶性基团的官能团(甲酯官能团)或允许引入使得能够并入官能团的官能团(保护的胺官能团和叔丁酯官能团)；
-以及最后，在6位上，甲醇官能团，其被转化为相应的甲磺酸酯，以便能够与TACN环的胺反应。
Figure BDA0002379305170000141
方案4
之前描述了合成子14a-14c的合成(参见申请WO 2013/011236和WO 2014/111661)。从这些合成子开始，通过一系列的三个反应获得一系列化合物17a-17f：Heck反应用于在吡啶衍生物和烯烃之间产生碳-碳键。例如，在专利申请EP-A-2002836中描述了该过程。通过催化氢化还原双键，然后进行甲磺酸化反应，得到化合物17a-17f。或者，保留双键以使体系难以弯曲(stiffen)，并对水增溶基团施加顶端取向(18a-18f)。
Figure BDA0002379305170000142
方案5
按照相同的策略并使用相应的烯烃获得处于叔丁酯形式的化合物21a-21f和22a-22f(方案5)(系列17和系列18的类似物)。
Figure BDA0002379305170000151
方案6
使用相应的烯烃，按照相同的策略获得处于NHBoc形式的化合物25a-25f和26a-26f(方案6)(系列17和系列18的类似物)。
Figure BDA0002379305170000152
方案7
根据类似的策略制备化合物28a-28c(无碳链)(系列25的类似物)。NHBoc基团的引入例如使用在综述文章Tetrahedron Letters 2010，51，4445中描述的方法进行。
Figure BDA0002379305170000161
方案8
通过方案8中描述的方法制备吡啶基衍生物，在所述吡啶基衍生物上在携带官能团(CO2R或NHBoc)的脂族接头和芳环(吡啶)之间的4位插入氧原子。将白屈氨酸29酯化为甲基二酯的形式，然后使用Mitsunobu反应引入具有官能团的接头(过程描述于例如OrganicBiomolecular Chemistry，2012，10，9183)。使用硼氢化钠的单还原允许得到一元醇形式的化合物32a-32c，然后将其转化为相应的甲磺酸化衍生物33a-33c。
Figure BDA0002379305170000162
方案9
4位的甲酯官能团可以直接固定到芳环(吡啶)上。在这种情况下，从首先酯化的市售化合物34开始是有必要的。然后，在m-CPBA存在下氧化吡啶，得到相应的N-氧化物衍生物36。N-氧化物官能团容易与三氟乙酸酐反应，经历重排，水解后得到6位的甲醇官能团。后者在常规条件下被甲磺酸化，得到化合物38。
Figure BDA0002379305170000171
方案10
使用化合物39制备次膦酸酯衍生物类似物44a-44b，所述化合物39首先被酯化，然后转化成次膦酸酯41a-41b。反应顺序的其余部分与用于合成化合物38的反应顺序相同。
Figure BDA0002379305170000172
方案11
根据方案11中描述的反应顺序制备衍生物51a-51b。在该实例中，使用硫代乙醇酸乙酯或硫代乙醇酸叔丁酯引入酯官能团。
Figure BDA0002379305170000181
方案12
根据方案12中描述的合成路线制备次膦酸盐类似物56a-56d。
2)发色团的制备
Figure BDA0002379305170000182
方案13a
根据方案13a-13b和方案14合成发色团。苯酚57以TBDMS的形式被保护。下一步由在OTBDMS的4位上进行选择性锂化组成，随后加入亲电试剂(2-异丙氧基-4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷)。得到化合物59，产率为39％。
Figure BDA0002379305170000191
方案13b
然后经由Suzuki反应将化合物59偶联在吡啶衍生物14a-14c上。该反应的条件产生60a-60c(酸形式)和61a-61c(酯形式)的混合物。应当注意，在该步骤中苯酚的保护基也被除去。在酯化条件下处理该混合物，从而使得能够将系列60转化为系列61。苯酚官能团被烷基化(62)并且醇官能团被甲磺酸化，这产生化合物63a-63c。
Figure BDA0002379305170000192
方案14
当由于合成原因需要胺官能团时，通过用溴丙胺NHBoc将苯酚烷基化而将其引入到发色团上，得到系列64，然后将醇官能团进行甲磺酸化(系列65)。
3)单天线络合物的合成
Figure BDA0002379305170000201
方案15
根据方案15合成单天线络合物。从Boc单保护的TACN大环开始，将吡啶基衍生物(Py)缩合，得到化合物66a-66s。将大环脱保护，并且在配体上引入相应的发色团(Z与Py携带的那些相同)。酯官能团被水解(系列68)并且镧系元素(特别是铕或铽)在不同配体中络合，得到络合物69a-69s。
Figure BDA0002379305170000211
方案16
在系列69a-69s中，通过引入两个水溶性基团E1-E5使化合物可溶于水性介质中：这些基团具有阴离子型性质(磺酸盐，E1和E2)或中性性质(两性离子：磺基甜菜碱，E3)，或阳离子型性质(季铵E4和E5)。
Figure BDA0002379305170000221
方案17
最后，在三氟乙酸存在下除去Boc基团，这产生NH2官能化的本发明的络合物，络合物71a-E1-5-71s-E1-5。
4)双天线络合物的合成
在方案18-方案21中描述了双天线络合物的合成。
Figure BDA0002379305170000231
方案18
合成开始于单保护的TACN与三种发色团(羧酸酯、次膦酸甲酯和次膦酸苯酯)的烷基化反应。除去Boc保护基团，并在TACN的最后烷基化位点引入携带与发色团相同的Z的相应吡啶。
Figure BDA0002379305170000241
方案19
将配体水解并将镧系元素原子引入到大环中，得到系列74。
Figure BDA0002379305170000251
方案20
然后在两个发色团上引入水溶性基团(E1-E5)(方案20)。它们具有阴离子型性质、中性性质或阳离子性质。
Figure BDA0002379305170000261
方案21
最后，在三氟乙酸存在下除去Boc或叔丁基酯基团，得到化合物76a-76af(方案21)。
5)三天线络合物的合成
Figure BDA0002379305170000271
方案22
根据方案22中描述的反应方案合成三天线络合物。各种甲磺酸化吡啶(63a-63c)在单取代的TACN 1b上缩合。得到的配体77a-77c在氢氧化锂的存在下水解，然后与相应的镧系元素盐接触，这得到铕络合物Eu-79a～Eu-79c或铽络合物Tb-79a～Tb-79c。在引入增溶基团E1-E5之后，在三氟乙酸的存在下除去Boc基团，这得到络合物Eu-81a～Eu-81c和Tb-81a～Tb-81c。
为了证明本发明的络合物Eu-81a-E2、Tb-81a-E2、Tb-81a-E4的功效，将它们与包含三甲氧基苯基吡啶天线的现有技术82a和82b的络合物进行比较。测试的结果在实验部分中给出。
Figure BDA0002379305170000281
方案23
Figure BDA0002379305170000291
方案24
将本发明的三个络合物转化为相应的NHS官能化的络合物(方案24)。这三种络合物对于例如蛋白质、尤其是抗体而言是有用的。
实验部分
使用的缩写：
EtOAc：乙酸乙酯
AcOH：乙酸
Boc：叔丁氧羰基
n-BuLi：正丁基锂
CDCl3：氘代氯仿
CHCl3：氯仿
CH(OEt)3：原甲酸乙酯
Cs2CO3：碳酸铯
CuI：碘化铜(I)
DCM/CH2Cl2：二氯甲烷
DIAD：偶氮二甲酸二异丙酯
DMF：二甲基甲酰胺
DIPEA：二异丙基乙胺
DMSO：二甲基亚砜
Et：乙基
ESI+：正模式电喷雾电离
EtOH：乙醇
h：小时
HATU：(邻-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N′,N′-四甲基脲六氟磷酸酯)
HNO3：硝酸
HPLC：高效液相色谱法
H2O：水
H2O2：过氧化氢
H2SO4：硫酸
d：天
K2CO3：碳酸铯
KI：碘化钾
K3PO4：磷酸钾
LC-MS：高效液相色谱-质谱联用
LiOH：氢氧化锂
LnCl3：镧系元素氯化物
m-CPBA：间氯过苯甲酸
Me：甲基
MeCN：乙腈
Me2CO：丙酮
MeOH：甲醇
min：分钟
Ms：甲磺酰基
MsCl：甲磺酰氯(mesyl chloride/methanesulfonyl chloride)
NaBH4：硼氢化钠
NaH：氢化钠
Pd/C：钯炭
Pd(dba)2：双(二亚苄基丙酮)钯(0)
Pd(dppf)Cl2：[双(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯(II)
Pd(OAc)2：乙酸钯(II)
Pd(PPh3)4：四(三苯基膦)钯(0)
Ph：苯基
PhMe：甲苯
PPh3：三苯基膦
mp：熔点
Py：吡啶
Rf：溶剂前沿
Rt：保留时间
RT：室温
TEA/Et3N：三乙胺
TFA：三氟乙酸
THF：四氢呋喃
TBDMSCl：叔丁基二甲基氯硅烷
Ts：对甲苯磺酰基
TSTU：邻-(N-琥珀酰亚胺基)-1,1,3,3-四甲基脲四氟硼酸酯
UPLC-MS：超高效液相色谱-质谱联用
Xphos：2-二环己基膦-2′,4′,6′-三异丙基联苯
色谱
在两个装置上进行分析型和制备型高效液相色谱(HPLC)：
-分析型HPLC：ThermoScientific，P4000四元泵，具有氘灯(190nm-350nm)的UV1000检测器，Waters XBridge C18分析柱，3.5μm，4.6×100mm。
-制备型HPLC：Shimadzu，2个LC-8A泵，Varian ProStar二极管阵列UV检测器，Waters XBridge prep C18制备柱，5μm：19×100mm或50×150mm。
分析用超高效液相色谱(UPLC)在Waters Acquity HClass装置上进行，该装置具有PDA类型的二极管阵列UV检测器或SQD2型的四极简单质量检测器作为检测器。所使用的探针是正模式电喷雾：3.2kV的毛细管电压～30V的锥孔电压(cone voltage)。
在Merck 60硅胶(0.040mm-0.063mm)上进行硅胶柱层析。氧化铝柱层析在Sigma-Aldrich氧化铝(中性，活化，Brochmann I)上进行。
光谱
·核磁共振(NMR)
使用配备有的BBFO测量探针(具有5mm直径的多核，梯度Z和锁场2H)的BrukerAvance 400MHz NanoBay光谱仪(9.4特斯拉磁体)记录NMR光谱(1H、13C和31P)。化学位移(δ)以百万分之一(ppm)表示。使用以下缩略词：
s：单峰；bs：宽单峰；app s：明显单峰(apparent singlet)；d：二重峰；t：三重峰；q：四重峰；m：多重峰；dd：双二重峰；dt：双三重峰；dq：双四重峰；ddd：双二倍二重峰；AB：AB系统。
·质谱(LRMS)
使用配备有Waters XBridge C18柱，3.5μm，4.6×100mm的Waters ZQ 2000单四极多模源ESI/APCI光谱仪或SQD2型单四极质谱记录(LC-MS)质谱。
·高分辨率质谱(HRMS)
使用配备有气动辅助大气压电离源(API)的QStar Elite质谱仪(AppliedBiosystems SCIEX)进行分析。在以下条件下以正电喷雾模式对样品进行电离：电喷雾电压(ISV)：5500V；孔电压(orifice voltage)(OR)：20V；喷雾气体压力(空气)：20psi。用飞行时间(TOF)分析仪获得高分辨率质谱(HRMS)。以具有双重内部校准的三重复进行精确质量的测量。
梯度A
Waters Acquity C18柱，
Figure BDA0002379305170000331
1.7μm，2.1×50mm-A/水0.1％甲酸B/乙腈0.1％甲酸，t＝0min，5％B-t＝0.2min，5％B-t＝5min，100％B-0.6mL·min-1。
梯度B
Waters Xbridge C18柱，5μm，50×150mm-A/水25mM TEAAc pH7 B/乙腈，t＝0min，10％B-t＝19min，60％B-100mL·min-1。
梯度C
Waters Acquity C18柱，
Figure BDA0002379305170000332
1.7μm，2.1×50mm-A/水5mM乙酸铵B/乙腈，t＝0min，5％B-t＝0.2min，5％B-t＝5min，100％B-0.6mL·min-1。
梯度D
Waters Xbridge C18柱，5μm，20×100mm-A/水25mM TEAAc pH7 B/乙腈，t＝0min，5％B-t＝19min，60％B-20mL·min-1。
梯度E
Waters Xbridge C18柱，5μm，20×100mm-A/水25mM TEAAc pH7 B/乙腈，t＝0min，2％B-t＝19min，40％B-20mL·min-1。
梯度F
Waters Xbridge C18柱，5μm，20×100mm-A/水25mM TEAAc pH6 B/乙腈，t＝0min，2％B-t＝19min，40％B-20mL·min-1。
梯度G
Waters Xbridge C18柱，5μm，50×150mm-A/水0.2％TFA B/乙腈，t＝0min，10％B-t＝12min，50％B-80mL·min-1。
梯度H
Waters Xbridge C18柱，5μm，50×150mm-A/水0.2％TFA B/乙腈，t＝0min，30％B-t＝20min，100％B-80mL·min-1。
实施例
化合物1：根据申请WO 2013/011236和WO 2014/111661中描述的过程制备化合物1。
化合物14a-14c：根据申请WO 2013/011236和WO 2014/111661中描述的过程制备化合物14a-14c。
化合物15a：在100mL施兰克(Schlenk)烧瓶中，将化合物14a(440mg，1.5mmol)溶解在无水DMF(10mL)中以得到无色溶液。向反应混合物中一次性加入三(邻甲苯基)膦(91mg，0.3mmol)、Pd(OAc)2(33.7mg，0.15mmol)、TEA(0.314mL，2.252mmol)和随后的丙烯酸甲酯(0.203mL，2.252mmol)。反应在70℃下搅拌5h。通过UPLC-MS(梯度A)监测反应进程。在这段时间之后，反应完成。将反应混合物减压浓缩，在EtOAc(50mL)中稀释，用水(2×50mL)洗涤，然后用NaCl饱和水(50mL)洗涤。有机相用MgSO4干燥，过滤并减压浓缩。使用DCM/MeOH溶剂(梯度为100/0至99/1)，通过硅胶柱层析法纯化粗产物，得到白色粉末形式的化合物15a(233mg，62％)。
mp＝156.4-156.9℃–HPLC梯度A-Rt＝2.03min–[M+H]+，m/z251.9–Rf＝0.41(硅胶，二氯甲烷–甲醇96:4)–HRMS(ESI+)计算值C12H14NO5 +[M+H]+，m/z 252.0866，测量值：252.0868–1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:8.13(s,1H,Py H5),7.67(d,J＝16.2Hz,1H),7.65(s,1H,Py H3),7.19(dd,J＝；16.2Hz,2H,HC＝CH),6.71(d,J＝16.2Hz,1H),4.91(s,2H,CH2 -OH),4.04(s,3H,Py-COOMe),3.85(s,3H,COOMe),3.49(bs,1H,OH)；13C NMR(100MHz,CDCl3)δ:166.20(COOMe),165.24(Py-COOMe),161.59(Py C2),147.97(Py-C＝C),143.74(Py C6),140.92(Py C4),123.77(Py C3),122.08(Py C5),121.86(Py-C＝C),64.68(CH2-OH),53.10(Py-CO2 CH3),52.19(CO2 CH3)。
化合物15b-15f：使用相应的烯烃，根据与用于合成15a的过程相同的过程制备这些化合物。
化合物16a：在50mL烧瓶中，将化合物15a(233mg，0.927mmol)溶解在MeOH(10mL)中以得到无色溶液。向反应混合物中一次性加入10％Pd/C(23.69mg，0.022mmol)。在RT下，将反应在鼓泡的氢气下搅拌2小时。通过UPLC-MS(梯度A)监测反应进程。在这段时间之后，反应完成。将反应混合物通过22μm尼龙过滤器过滤并且蒸发至干，得到白色粉末形式的化合物16a(231mg，98％)。mp＝133.2-136.4℃–HPLC梯度A-Rt＝1.86min–[M+H]+，m/z 253.2–HRMS(ESI+)计算值C12H16NO5 +[M+H]+，m/z 254.1023，测量值：254.1024–1H NMR(400MHz，CDCl3)δ:7.9(s,1H,Py H5),7.41(s,1H,Py H3),4.85(s,2H,CH2 -OH),4.01(s,3H,Py-COOMe),3.69(s,3H,COOMe),3.05(t,J＝7.6Hz,2H,Py-CH2 -CH2),2.71(t,J＝7.6Hz,2H,Py-CH2-CH2 )；13C NMR(100MHz,CDCl3)δ:172.41(COOMe),165.65(Py-COOMe),160.49(Py C2),151.67(Py C4),147.22(Py C6),140.92(Py C3),123.96(Py C3),123.9(Py C5),64.62(CH2-OH),52.91(Py-CO2 CH3),51.91(CO2 CH3),33.97(Py-CH2-CH2 ),30.07(Py-CH2 -CH2)。
化合物16b-16f：根据与用于合成16a的过程相同的过程制备这些化合物。
化合物17a：在100mL烧瓶中，将化合物16a(231mg，0.912mmol)溶解在无水THF(30mL)中以得到无色溶液。将TEA(0.127mL，0.912mmol)和随后的MsCl(72μL，0.912mmol)一次性加入置于冰浴中的反应混合物中。使混合物升温至RT并搅拌15min。通过UPLC-MS(梯度A)监测反应进程。在这段时间之后，反应完成。将反应混合物减压浓缩，在DCM(50mL)中稀释，用水(2×25mL)洗涤，然后用NaCl饱和水(20mL)洗涤。有机相用MgSO4干燥，过滤并减压浓缩，得到白色粉末形式的化合物17a(249mg，82％)。HPLC梯度A-Rt＝3.2min-[M+H]+，m/z332.3–Rf＝0.23(硅胶，二氯甲烷–甲醇98:2)–HRMS(ESI+)计算值C13H18NO7S+[M+H]+，m/z332.0799，测量值：332.0799-1H NMR(400MHz，CDCl3)δ:7.98(s,1H,Py H5),7.54(s,1H,PyH3),5.41(s,2H,CH2 -OMs),4.00(s,3H,Py-COOMe),3.69(s,3H,COOMe),3.16(s,3H,OMs),3.07(t,J＝7.5Hz,2H,Py-CH2 -CH2),2.72(t,J＝7.5Hz,2H,Py-CH2-CH2 )；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ:172.23(COOMe),165.27(Py-COOMe),154.56(Py C2),152.46(Py C4),147.93(PyC6),125.19(Py C3),125.03(Py C5),70.97(CH2 -OMs),53.08(Py-CO2 CH3),51.94(CO2 CH3),38.05(CH2-OSO2 CH3 ),33.87(Py-CH2-CH2 ),30.07(Py-CH2 -CH2)。
化合物17b-17f：根据与用于合成16a的过程相同的过程制备这些化合物。
化合物18a-18f：根据与用于合成17a的过程相同的过程制备这些化合物。
化合物19a-19f：根据与用于合成15a的过程相同的过程制备这些化合物。
化合物20a-20f：根据与用于合成16a的过程相同的过程制备这些化合物。
化合物21a-21f：根据与用于合成17a的过程相同的过程制备这些化合物。
化合物22a-22f：根据与用于合成17a的过程相同的过程制备这些化合物。
化合物23a-23f：使用相应的烯烃，根据与用于合成15a的过程相同的过程制备这些化合物。
化合物24a-24f：根据与用于合成16a的过程相同的过程制备这些化合物。
化合物25a-25f：根据与用于合成17a的过程相同的过程制备这些化合物。
化合物26a-26f：根据与用于合成17a的过程相同的过程制备这些化合物。
化合物27a-27c：根据文章：Tetrahedron Letters 2010，51，4445中描述的过程制备化合物27a-27c。
化合物28a-28c：根据与用于合成17a的过程相同的过程制备这些化合物。
化合物29：这一化合物可商业化获得。
化合物30：根据文章：Dalton Transactions 2010，39，707中描述的过程制备化合物30。
化合物31a-31c：根据文章：Organic Biomolecular Chemistry 2012，10，9183中描述的过程制备化合物31a-31c。
化合物32a-32c：根据文章：Journal of Organic Chemistry 2010，75，7175中描述的过程制备化合物32a-32c。
化合物33a-33c：根据文章：Journal of Organic Chemistry 2010，75，7175中描述的过程制备化合物33a-33c。
化合物34：这一化合物可商业化获得。
化合物35：根据文章：Bioorganic Chemistry 2014，57，148中描述的过程制备化合物35。
化合物36：根据文章：Carbohydrate Research 2013，372，35中描述的过程制备化合物36。
化合物37：根据申请WO 2014/111661中描述的过程制备化合物37。
化合物38：根据与用于合成17a的过程相同的过程制备该化合物。
化合物39：可商业化获得。
化合物40：根据文章：Bioorganic Chemistry 2014，57，148中描述的过程制备化合物40。
化合物41a-41b：使用相应的催化剂，根据申请WO 2014/111661中描述的过程制备化合物41a-41b。
化合物42a-42b：根据与用于合成36的过程相同的过程制备化合物42a-42b。
化合物43a-43b：根据与用于合成37的过程相同的过程制备化合物43a-43b。
化合物44a-44b：根据与用于合成17a的过程相同的过程制备化合物44a-44b。
化合物45：这一化合物可商业化获得。
化合物46：根据文章：Chemistry–A European Journal，2014，20，3610中描述的过程制备化合物46。
化合物47：在RT下将化合物46(0.313g，2.04mmol)溶解在H2SO4(11mL)中，然后将溶液在冰浴中冷却。向该混合物中滴加HNO3(9.7mL)，并将溶液加热至100℃持续2d。将混合物冷却至RT，然后倒入碎冰(100g)中。1h后，用CH2Cl2(3×50mL)萃取水相，合并有机相，用MgSO4干燥，粗产物通过硅胶柱层析法用溶剂混合物(CH2Cl2-AcOH，98/2)纯化，得到白色固体(224mg，56％)。Rf(CH2Cl2/AcOH，98/2)＝0.38；mp：147℃；1H NMR(400MHz，CDCl3，δ):16.49(s,1H,COOH),9.08(s,1H,H3),8.36(s,1H,H5),2.75(s,3H,py-CH3)；13C NMR(101MHz，CDCl3，δ):159.4(COOH),152.4(C6),144.4(C4),138.7(C2),123.1(C5),121.7(C3),18.4(py-CH3)；MS计算值C7H7N2O5 199.036.测量值199.035[M+H]+。
化合物48：在RT下将化合物47(2.9g，14.7mmol)溶于无水MeOH(3mL)中。向该溶液中滴加H2SO4(200μL)，并将溶液加热至65℃持续3d。将溶液冷却至RT并在减压下除去溶剂。向残余物中加入H2O(30mL)并用EtOAc(3×20mL)萃取溶液。合并有机相，用5％碳酸氢钠溶液(2×20mL)洗涤，然后用饱和盐水溶液(20mL)洗涤。在经MgSO4干燥后，过滤并减压除去溶剂，得到化合物48，其用于余下的合成而无需额外纯化(57mg，76％)。1H NMR(400MHz，CDCl3，δ):8.33(d,1H,4J 3.1,H5),8.19(d,1H,4J 3.1,H3),4.02(s,3H,CH 3CO),2.57(s,3H,py-CH3)；13C NMR(100MHz，CDCl3，δ):160.8(COOMe),152.7(C6),142.1(C4),140.5(C2),121.4(C5),119.3(C3),53.8(OCH3),18.3(py-CH3)；MS计算值C8H9N2O5 213.051.测量值213.050[M+H]+。
化合物49：在RT下将三氟乙酸酐(1.48mL，10.8mmol)加入到处于CHCl3(10mL)中的化合物48(114mg，0.54mmol)溶液中。将混合物在惰性气氛中加热至60℃持续5h。在这段时间之后，将反应冷却至RT，并在减压下除去溶剂。向黄色油状物中加入EtOH(3mL)和H2O(3mL)，并将溶液在RT下搅拌2h。减压除去溶剂，用CH2Cl2(3×30mL)萃取水相。合并有机相，经MgSO4干燥并减压蒸发。使用梯度70/30至50/50的己烷/EtOAc溶剂，通过硅胶柱层析纯化残余物，得到化合物49(74mg，65％)。Rf(CH2Cl2/MeOH，95/5)＝0.67；1H NMR(400MHz，CDCl3，δ):8.68(d,1H,4J 2.1,H3),8.37(d,1H,4J 2.1,H5),5.06(s,2H,CH2OH),4.06(s,3H,CH 3CO)；13C NMR(100MHz，CDCl3，δ):164.3(COOMe),163.6(C6),155.3(C4),149.7(C2),116.4(C5),116.3(C3),64.5(CH2OH),29.5(CO2CH3)。
化合物50a：在惰性气氛和RT下，将NaH(17mg，0.708mmol)和硫代乙醇酸乙酯(35μL，0.320mmol)加入到处于无水DMF(1mL)中的化合物49(21.6mg，0.102mmol)的溶液中。将混合物在RT下在惰性气氛中搅拌2h。然后在减压下除去溶剂，并向黄色油状物中加入MeOH(5mL)和H2SO4(200μL)。将溶液在氩下加热至65℃持续72h。减压除去溶剂，向残余物中加入H2O(10mL)，用EtOAc(3×20mL)萃取水性溶液。合并有机相并经MgSO4干燥，过滤并减压浓缩。残余物使用作为洗脱剂的CH2Cl2-MeOH(98/2)，通过硅胶柱层析法纯化残余物，得到化合物50a(8.2mg，25％)。Rf(DCM/MeOH，95/5)＝0.35；1H NMR(400MHz，CDCl3，δ):7.88(d,1H,4J1.9,H5),7.63(d,1H,4J 1.9,H3),4.69(s,2H,CH 2OH),4.02(s,2H,CH2S),3.96(s,3H,CH3CO),3.76(s,3H,CH3CO)；13C NMR(100MHz，CDCl3，δ):170.7(COOMe),166.4(COOMe),163.3(C2),152.3(C4),147.8(C6),121.2(C5),121.1(C3),65.1(CH2OH),53.3(CO2 CH3),48.5(CO2 CH3),33.6(SCH2)。
化合物50b：根据与用于合成50a的过程相同的过程制备化合物50b。
化合物51a：将TEA(12.5μL，0.09mmol)和MsCl(3.5μL，0.045mmol)加入到处于无水THF(2mL)中的化合物50a(8.2mg，0.03mmol)的溶液中。将该溶液在RT下搅拌3.5h。在这段时间之后，在减压下除去溶剂，并将残余物溶解在CH2Cl2(20mL)中。有机相用H2O(3×10mL)洗涤，经MgSO4干燥，过滤并减压除去溶剂，定量得到化合物51a。Rf(DCM/MeOH，95/5)＝0.8；1HNMR(400MHz，CDCl3，δ):7.95(d,1H,4J 1.5,H5),7.52(d,1H,4J 1.5,H3),5.35(s,2H,CH 2OMs),3.98(s,2H,CH2S),3.82(s,2H,COCH3),3.77(s,2H,COCH3),3.14(s,3H,SCH3)。
化合物51b：根据与用于合成51a的过程相同的过程制备化合物51b。
化合物52a-52b：分别根据与用于合成14b和14c的过程相同的过程制备化合物52a-52b。
化合物53a-53b：根据与用于合成46的过程相同的过程制备化合物53a-53b。
化合物54a-54b：根据与用于合成49的过程相同的过程制备化合物54a-54b。
化合物55a-55d：根据与用于合成50a的过程相同的过程制备化合物55a-55d。
化合物56a-56d：根据与用于合成51a的过程相同的过程制备化合物56a-56d。
化合物57：该化合物可商业化获得。
化合物58：将咪唑(6.49g，94.4mmol)和随后的TBDMSCl(9.78g，62.9mmol)加入到处于无水DMF(145mL)中的3,5-二甲氧基苯酚(10g，62.9mmol)的溶液中。将反应混合物在RT下搅拌过夜。向该溶液中加入H2O(50mL)，然后用EtOAc(2×30mL)萃取该溶液。合并有机相，用盐水溶液(20mL)洗涤，用MgSO4干燥，过滤并减压浓缩。以5％的增量使用0/90-85/15的环己烷-EtOAc溶剂梯度，通过硅胶柱层析法纯化粗产物，得到无色油形式的化合物58(15.8g，94％)。HPLC-Rt＝4.19min-[M+H]+，m/z 270.3-1H NMR(300MHz，CDCl3)δ:6.11(s,1H,对),6.03(s,2H,邻),3.75(s,6H,OMe),0.98(s,9H,Si-叔-Bu),0.21(s,6H,Si-Me)
化合物59：在-78℃和氩气下，将2.5M在己烷(26.3mL，65.8mmol)中的n-BuLi滴加至在无水THF(130mL)中的化合物58(15.8g，58.9mmol)溶液中。将反应混合物在RT下搅拌5h，然后冷却至-78℃。向该溶液中滴加在无水THF(32mL)中的2-异丙氧基-4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷(14.4mL，70.6mmol)溶液。将反应混合物在RT下搅拌3h，然后倒入碎冰-H2O混合物(400mL)中。水相用EtOAc(2×50mL)萃取。合并有机相，用盐水溶液(20mL)洗涤，用MgSO4干燥，过滤并减压浓缩。向残余物中加入MeOH(9mL)，并将溶液冷却至4℃过夜。在这段时间之后，白色固体已经结晶。通过过滤收集晶体并干燥，得到白色固体形式的化合物59(8.91g，38％)。HPLC-Rt＝3.80min-[M+H]+，m/z 395.3-1H NMR(300MHz，CDCl3)δ:5.97(s,2H,邻),3.7(s,6H,OMe),1.36(s,12H,B(O-C-diMe)),0.96(s,9H,Si-叔-Bu),0.17(s,6H,Si-Me)；13C NMR(300MHz,CDCl3)δ:164.6；159.4；96.8；83.8；55.9；26.1；25.0；18.6,-4.0。
化合物60a和化合物61a：在50mL施兰克烧瓶中，将化合物14a(440mg，1.5mmol)溶解在丙酮(2mL)和H2O(2.5mL)的混合物中，得到无色溶液。将化合物59(710mg，1.8mmol)、K2CO3(518mg，3.75mmol)和在丙酮(0.5mL)中的Pd(dba)2(1.725mg，3.00μmol)溶液一次性加入到反应混合物中。将反应混合物在65℃下搅拌4h。通过UPLC-MS(梯度A)监测反应进程。在这段反应之后，反应完成，含有化合物60a和化合物61a的混合物。将反应混合物在减压下浓缩，并用于余下的合成而无需额外纯化。HPLC梯度A-Rt＝1.44min-[M+H]+，m/z 304.6。
化合物61a：在250mL烧瓶中，将化合物60a和化合物61a的混合物(458mg，1.5mmol)溶解在MeOH(100mL)中，得到黄色溶液。将H2SO4(0.416mL，4.50mmol)一次性加入到反应混合物中。将反应在回流下搅拌7d，通过UPLC-MS(梯度A)监测反应进程。在这段时间之后，反应是局部的(90％)。减压浓缩反应混合物，然后通过制备型HPLC(梯度G)直接纯化，得到黄色粉末形式的化合物61a(385mg，1.21mmol，80％)。mp＝169.7-174.1℃–HPLC梯度A-Rt＝2.07min-[M+H]+，m/z320.3–HRMS(ESI+)计算值C16H18NO6 +[M+H]+，m/z 320.1129，测量值：320.1127–1H NMR(400MHz，MeOD4)δ:8.22(s,1H,Py H3),8.02(s,1H,Py H5),6.25(s,2H,邻),4.89(s,2H,Py-CH2 -OH),4.05(s,3H,Py-COOMe),3.77(s,6H,OMe)；13C NMR(100MHz，MeOD4)δ:162.95；161.64；158.75；158.68；150.91；141.38；127.81；127.22；105.67；91.95；61.70；54.89；52.54。
化合物62a：在250mL烧瓶中，将化合物61a(354mg，1.11mmol)溶解在无水MeCN(100mL)中，得到黄色溶液。将K2CO3(460mg，3.33mmol)、KI(27.6mg，0.166mmol)和随后的溴乙酸甲酯(0.162mL，1.66mmol)一次性加入至反应混合物。将反应在65℃下搅拌过夜。通过UPLC-MS(梯度A)监测反应进程。在这段时间之后，反应完成。在减压下浓缩反应混合物，在DCM(50mL)中稀释，然后过滤，最后用EtOAc作为洗脱剂通过硅胶柱层析法纯化，得到白色粉末形式的化合物62a(261mg，60％)。mp＝151.1-154.4℃–HPLC梯度A-Rt＝2.58min-[M+H]+，m/z 393.1–Rf＝0.36(硅胶，乙酸乙酯)–HRMS(ESI+)计算值C19H22NO8 +[M+H]+,m/z392.1340,测量值:392.1340–1H NMR(400MHz，CDCl3)δ:8.03(s,1H,Py H3),7.48(s,1H,PyH5),6.24(s,2H,邻),4.87(s,2H,Py-CH2 -OH),4.71(s,2H,O-CH2 -COOMe),3.99(s,3H,Py-COOMe),3.86(s,3H,O-CH2-COOMe),3.73(s,6H,OMe)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ:169.03；166.03；159.85；159.18；158.20；146.32；144.61；127.05；126.72；109.65；91.48；65.38；64.71；55.89；52.73；52.46。
化合物63a：在100mL烧瓶中，将化合物62a(224mg，0.572mmol)溶解在无水THF(30mL)中，得到无色溶液。将反应混合物置于冰浴中，然后一次性加入MsCl(45μL，0.572mmol)。在添加结束时，移去冰浴并将反应搅拌15min。通过UPLC-MS(梯度A)监测反应进程。在这段时间之后，反应完成。减压浓缩反应混合物，在DCM(50mL)中稀释，用水(2×40mL)洗涤。有机相用MgSO4干燥，过滤并在旋转蒸发器中蒸发至干。使用100/0至95/5的DCM/MeOH溶剂梯度通过硅胶柱层析法纯化粗产物，得到白色粉末形式的化合物63a(264mg，98％)。mp＝141.7-144.1℃–HPLC梯度A-Rt＝2.96min-[M+H]+,m/z 470.6–Rf＝0.48(硅胶，二氯甲烷–甲醇96:4)–HRMS(ESI+)计算值C20H24NO10S+[M+H]+,m/z 470.1115,测量值:470.1113–1H NMR(400MHz，CDCl3)δ:8.13(s,1H,Py H3),7.67(s,1H,Py H5),6.24(s,2H,邻),5.46(s,2H,Py-CH2 -OH),4.72(s,2H,O-CH2 -COOMe),4.00(s,3H,Py-COOMe),3.86(s,3H,O-CH2-COOMe),3.73(s,6H,OMe),3.14(s,3H,OMs)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ:168.98；165.73；160.09；158.20；153.24；147.15；145.30；128.25；128.10；109.08；91.49；71.66；65.37；55.90；52.94；52.48；38.17。
化合物77a：在50mL施兰克烧瓶中，将化合物1b(41mg，0.159mmol)溶解在无水THF(5mL)中以得到无色溶液。将在无水MeCN(10mL)中的化合物63a(223mg，0.476mmol)溶液和随后的K2CO3(88mg，0.635mmol)一次性加入至反应混合物。反应在85℃下搅拌过夜。通过UPLC-MS(梯度A)监测反应进程。次后，反应完成。反应混合物通过制备型HPLC(梯度H)直接纯化，得到白色粉末形式的化合物77a(106mg，48％)。HPLC梯度A-Rt＝3.64min-[M+H]+,m/z1379.9–HRMS(ESI+)计算值C20H24NO10S+[M+2H]2+,m/z 689.7843,测量值:689.7842。
化合物Eu-79a：在50mL烧瓶中，将化合物77a(53mg，38.5μmol)溶解在MeCN(1mL)和水(5mL)中，得到无色溶液。将LiOH(0.941mg，38.5μmol)一次性加入到反应混合物中。将反应在室温下搅拌30min。通过UPLC-MS(梯度A)监测反应进程。这段时间之后，脱保护完成(化合物78a)。用1M HCl将反应混合物的pH调节至7。将六水合氯化铕(21mg，57.8μmol)一次性加入至反应混合物中。在RT下使反应搅拌过夜，此后反应完成。反应混合物通过制备型HPLC(梯度D)直接纯化，得到白色粉末形式的化合物79a(49mg，88％)。HPLC梯度A-Rt＝2.63min-[M-2H]+,m/z 1445.4–HRMS(ESI+)计算值C63H70N7O23Eu2+[M-H]2+,m/z 722.6868,测量值:722.6868。
化合物Eu-80a-E2：在25mL烧瓶中，将化合物79a(49mg，34μmol)溶解在无水DMSO(1.5mL)中，得到无色溶液。将3-氨基-1-丙磺酸(29mg，204μmol)、DIPEA(36μL，204μmol)和随后的HATU(53mg，136μmol)一次性加入至反应混合物中。反应在RT下搅拌15min。通过UPLC-MS(梯度C)监测反应进程。在这段时间之后，反应完成。反应混合物通过制备型HPLC(梯度D)直接纯化，得到白色粉末形式的化合物Eu-80a-E2(19mg，10.2μmol，30％)。HPLC梯度C-Rt＝1.92min-[M-2H]+,m/z 1808.4–HRMS(ESI+)计算值C72H91N10O29S3Eu2+[M-H]2+,m/z904.2162,测量值:904.2166。
化合物Eu-81a-E2：在25mL烧瓶中，将化合物Eu-80a-E2(18.32mg，10.14μmol)溶解在TFA(400μL)中，得到黄色溶液。将反应在RT下搅拌30min。通过UPLC-MS(梯度C)监测反应进程。在这段时间之后，反应完成。将反应混合物在旋转蒸发器中蒸发，然后通过制备型HPLC(梯度E)纯化，得到白色粉末形式的化合物Eu-81a-E2(7.89μmol，78％)。HPLC梯度C-Rt＝1.48min-[M-2H]+,m/z 1709–HRMS(ESI+)计算值C67H83N10O27S3Eu2+[M-H]2+,m/z 854.1899,测量值:854.1906。
化合物Tb-79a：在50mL烧瓶中，将化合物77a(53mg，38.5μmol)溶解在MeCN(1mL)和水(5mL)中，得到无色溶液。将LiOH(0.941mg，38.5μmol)一次性加入至反应混合物中。反应在RT下搅拌30min。通过UPLC-MS(梯度A)监测反应进程。在这段时间之后，脱保护完成(化合物78a)。用1M HCl将反应混合物的pH调节至7。将氯化铽六水合物(22mg，57.8μmol)一次性加入至反应混合物中。反应在RT下搅拌过夜。在这段时间之后，反应完成。反应混合物通过制备型HPLC(梯度D)直接纯化，得到白色粉末形式的化合物Tb-79a(19mg，12.8μmol，33％)。HPLC梯度A-Rt＝2.63min-[M-2H]+,m/z 1451.7–HRMS(ESI+)计算值C63H70N7O23Tb2+[M-H]2+,m/z 725.6883,测量值:725.6887。
化合物Tb-80a-E2：在25mL烧瓶中，将化合物Tb-79a(9.3mg，6.4μmol)溶解在无水DMSO(1mL)中，得到无色溶液。将3-氨基-1-丙磺酸(5.5mg，38.4μmol)、DIPEA(4.5μL，25.6μmol)和随后的HATU(10mg，25.6μmol)一次性加入至反应混合物中。反应在RT下搅拌15min。通过UPLC-MS(梯度C)监测反应进程，在这段时间之后，反应完成。反应混合物通过制备型HPLC(梯度D)直接纯化，得到白色粉末形式的化合物Tb-80a-E2(7.8mg，4.3μmol，67％)。HPLC梯度C-Rt＝1.89min-[M-2H]+,m/z 1815.9–HRMS(ESI+)计算值C72H91N10O29S3Tb2+[M-H]2+,m/z 907.2179,测量值:907.2167。
化合物Tb-80a-E4：在25mL烧瓶中，将化合物Tb-79a(9.3mg，6.4μmol)溶解在无水DMSO(1mL)中，得到无色溶液。将2-N,N,N-三甲基铵-乙胺(3.96mg，38.4μmol)、DIPEA(4.5μL，25.6μmol)和随后的HATU(10mg，25.6μmol)一次性加入至反应混合物中。反应在RT下搅拌15min。通过UPLC-MS(梯度C)监测反应进程。在这段时间之后，反应完成。反应混合物通过制备型HPLC(梯度D)直接纯化，得到白色粉末形式的化合物Tb-80a-E4(6.1mg，3.6μmol，56％)。HPLC梯度C-Rt＝2.00min-[M]3+,m/z 569.3–HRMS(ESI+)计算值C78H108N13O20Tb4+[M-2H]4+,m/z 426.4266,测量值:426.4265。
化合物Tb-81a-E2：在25mL烧瓶中，将化合物Tb-80a-E2(7.8mg，4.3μmol)溶解在TFA(500μL)中，得到黄色溶液。反应在RT下搅拌30min。通过UPLC-MS(梯度C)监测反应进程。在这段时间之后，反应完成。将反应混合物在旋转蒸发器中蒸发，然后通过制备型HPLC(梯度E)纯化，得到白色粉末形式的化合物Tb-81a-E2(2.78μmol，64％)。HPLC梯度C-Rt＝1.45min-[M-2H]+,m/z 1715.3–HRMS(ESI+)计算值C67H83N10O27S3Tb2+[M-H]2+,m/z 857.1917,测量值:857.1905。
化合物Tb-81a-E4：在25mL烧瓶中，将化合物Tb-80a-E4(6.1mg，3.6μmol)溶解在TFA(200μL)中，得到黄色溶液。反应在RT下搅拌30min。通过UPLC-MS(梯度C)监测反应进程。这段时间之后，反应完成。将反应混合物在旋转蒸发器中蒸发，然后通过制备型HPLC(梯度E)纯化，得到白色粉末形式的化合物Tb-81a-E4(2.2μmol，62％)。HPLC梯度C-Rt＝1.57min-[M]3+,m/z 535.9–HRMS(ESI+)计算值C73H100N13O18Tb4+[M-2H]4+,m/z 401.4135,测量值:401.4125。
络合物Eu-81a-E2的UV光谱、色谱和质谱示于图1至图3中。络合物Tb-81a-E2的UV光谱、色谱和质谱示于图4至图6中。络合物Tb-81a-E4的UV光谱、色谱和质谱示于图7至图9中。
对络合物Eu-81a-E2、Tb-81a-E4和Tb-81a-E2以及在申请WO 2005/058877中描述的对应于结构82a和82b的络合物的性质进行测定。络合物82a和Eu-81a-E2的光物理性质是类似的。然而，络合物Eu-81a-E2是非常易溶于水的，而络合物82a具有非常差的溶解度(见下文)。关于铽络合物，尽管在发射光谱的谱线的强度和分布方面存在小的差异，络合物82b和Tb-81a-E4以及Tb-81a-E2的光物理性质是类似的。然而，与现有技术82b的络合物相比，络合物Tb-81a-E4和Tb-81a-E2是非常易溶于水的(见下文)。
如下对各种络合物的溶解度进行了测定。对于每种络合物，制备了铕络合物在甲醇中的三个等摩尔溶液。减压除去溶剂，将剩余的固体溶解并在水/辛醇混合物(2:1，1:1，1:2)(0.9mL)中搅拌2min。平衡后，在甲醇中记录各相的发射光谱(在1mL甲醇中的50μL溶液)。对于每种混合物，使用以下方程计算LogP的值：
LogP＝Log[C(辛醇)/C(水)]
其中C(辛醇)和C(水)分别表示在辛醇和水中测试的络合物的浓度。
对于铕络合物，在计算中使用了谱带ΔJ＝2(605-635nm)，而对于铽配合物，选择了谱带ΔJ＝5(520-565nm)。结果如下表所示。
络合物 LogP
82a 0.4±0.2
82b 0.5±0.1
Eu-81a-E<sub>2</sub> -2.7±0.2
Tb-81a-E<sub>2</sub> -2.8±0.2
Tb-81a-E<sub>4</sub> -2.3±0.2
与LogP值略呈正的化合物82a和化合物82b相比，本发明所述的络合物的LogP值为负，其反映了在水性缓冲液中的优异的溶解度。

Claims (17)

1.式(I)的络合剂：
Figure FDA0002379305160000011
其中：
-发色团1、发色团2和发色团3各自表示式(Ia)或式(Ib)的基团：
Figure FDA0002379305160000012
-X1和X2各自表示基团L1-CO-R或L2-G；
-R为基团-OR2或-NH-E；
-Ra为H或基团-(CH2)l-G；
-R1为基团-CO2H或-PO(OH)R3；
-R2为H或(C1-C4)烷基；
-R3为(C1-C4)烷基，优选甲基；任选地由基团-SO3 -取代的苯基，所述基团-SO3 -优选在间位或对位；或苄基；
-L1为直接键合；基团-(CH2)r-，所述基团-(CH2)r-任选地由选自氧原子、氮原子和硫原子的至少一个原子中断；-CH＝CH-基团；-CH＝CH-CH2-基团；-CH2-CH＝CH-基团；或PEG基团；
-L2为二价连接基团；
-G为反应性基团；
-E为基团-CH2-(CH2)s-CH2-SO3 -或-N+Alk1Alk2Alk3，或磺基甜菜碱；
-l为1至4范围内的整数；
-r为1至6、优选1至3范围内的整数；
-s为0、1或2；
-Alk1、Alk2、Alk3可相同或不同，表示(C1-C6)烷基；
应当理解，式(I)的化合物包含至少一个式(Ia)的基团和至少一个基团L1-CO-R。
2.如权利要求1所述的络合剂，其中，发色团1表示其中X1是基团L2-G的式(Ia)的基团，并且发色团2和发色团3各自表示其中X2是基团L1-CO-R的式(Ib)的基团。
3.如权利要求2所述的络合剂，其中，发色团2和发色团3相同。
4.如权利要求1所述的络合剂，其中，发色团1和发色团2各自表示其中X1是基团L1-CO-R的式(Ia)的基团，并且发色团3表示其中X2是基团L2-G的式(Ib)的基团。
5.如权利要求4所述的络合剂，其中，发色团1和发色团2相同。
6.如权利要求2-5中任一项所述的络合剂，其中，Ra是H。
7.如权利要求1所述的络合剂，其中，发色团1、发色团2和发色团3各自表示其中X1是基团L1-CO-R的式(Ia)的基团；并且Ra是基团-(CH2)l-G。
8.如权利要求8所述的络合剂，其中，发色团1、发色团2和发色团3相同。
9.如前述权利要求中任一项所述的络合剂，其中，R1是基团-CO2H或-P(O)(OH)R3，其中R3是(C1-C4)烷基或苯基。
10.如前述权利要求中任一项所述的络合剂，其中，L1是直接键合；基团-(CH2)r-，所述基团-(CH2)r-任选地由选自氧原子和硫原子的至少一个原子中断，并且r＝2或3；-CH＝CH-基团；-CH＝CH-CH2-基团；或-CH2-CH＝CH-基团。
11.如前述权利要求中任一项所述的络合剂，其中，E为基团-CH2-(CH2)s-CH2-SO3 -，s＝0或1；具有Alk1、Alk2、Alk3的-(CH2)s-N+Alk1Alk2Alk3，所述Alk1、Alk2、Alk3可相同或不同，表示(C1-C4)烷基，并且s＝0或1；或者下式的基团：
Figure FDA0002379305160000031
其中，R4是(C1-C4)烷基，并且t是1或2。
12.如前述权利要求中任一项所述的络合剂，其中，L2选自：
-直接键合；
-直链或支链的C1-C20亚烷基基团，所述亚烷基基团任选地含有一个或多个双键或三键；
-C5-C8环亚烷基基团；C6-C14亚芳基基团；
所述亚烷基、环亚烷基或亚芳基基团任选地含有例如氧、氮、硫或磷的一个或多个杂原子，或一个或多个氨基甲酰基或甲酰胺基基团，并且所述亚烷基、环亚烷基或亚芳基基团任选地由1至5个C1-C8烷基、C6-C14芳基、磺酸基或氧代基团取代；
-选自下式的二价基团的基团：
-(CH2)n-、-(CH2)n-O-(CH2)m-O-(CH2)p-、
Figure FDA0002379305160000032
Figure FDA0002379305160000041
-(CH2)n-NH-、-(CH2)n-NH-(CH2)m-、
Figure FDA0002379305160000042
Figure FDA0002379305160000043
其中，n、m、p、q是1至16、优选1至5的整数，并且e是1至6、优选1至4范围内的整数。
13.如前述权利要求中任一项所述的络合剂，其中，所述反应性基团G选自：丙烯酰胺、活化胺、活化酯、醛、卤代烷、酸酐、苯胺、叠氮化物、氮杂环丙烷、羧酸、重氮烷、卤代乙酰胺、卤代三嗪、肼、亚氨酸酯、异氰酸酯、异硫氰酸酯、马来酰亚胺、磺酰卤、硫醇、酮、胺、酰卤、琥珀酰亚胺酯、羟基琥珀酰亚胺酯、羟基磺基琥珀酰亚胺酯、叠氮基硝基苯基、叠氮基苯基、乙二醛、三嗪、乙炔基基团，以及特别是选自下式基团的基团：
Figure FDA0002379305160000051
其中，w从0至8变化，v等于0或1，Ar是包含1至3个杂原子的饱和或不饱和的5元或6元杂环，所述5元或6元杂环任选地由卤素原子取代。
14.如前述权利要求中任一项所述的络合剂，其中，所述基团-L2-G由反应性基团G和间隔臂L2组成，所述反应性基团G选自羧酸、胺、琥珀酰亚胺酯、卤代乙酰胺、肼、异硫氰酸酯、马来酰亚胺基团，所述间隔臂L2由含有1至5个碳原子的亚烷基链或选自下式基团的基团组成：
Figure FDA0002379305160000052
其中，n、m是1至16、优选1至5的整数，e是1至6、优选1至4范围内的整数，所述基团G连接至这些二价基团的一端或另一端。
15.一种镧系元素络合物，所述镧系元素络合物含有镧系元素和如前述权利要求中任一项所述的络合剂。
16.如权利要求15所述的镧系元素络合物，其特征在于，所述镧系元素选自Eu3+、Tb3+、Sm3+，优选地，所述镧系元素为Tb3+。
17.一种荧光缀合物，所述荧光缀合物通过(i)如权利要求15或16所述的镧系元素络合物与(ii)包含官能团的感兴趣分子之间的反应而获得，所述镧系元素络合物包含基团G，所述官能团与所述基团G的原子之一形成共价键。
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