WO2018229432A1 - Agents complexants de type trimethoxyphenyl pyridine hydrosolubles et complexes de lanthanide correspondants - Google Patents

Agents complexants de type trimethoxyphenyl pyridine hydrosolubles et complexes de lanthanide correspondants Download PDF

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WO2018229432A1
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compound
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Laurent Lamarque
Jurriaan Zwier
Emmanuel Bourrier
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Cisbio Bioassays
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Definitions

  • the present invention relates to water-soluble complexing agents or ligands, lanthanide complexes obtained from these complexing agents, and the use of these lanthanide complexes for labeling molecules and detecting them by time-resolved fluorescence techniques.
  • This invention discloses stable complexes having one, two or three hydrosoluble, functionalised trimethoxyphenylpyridine chromophores. State of the art
  • the lanthanide complexes have seen their use increase significantly in the last twenty years in the field of life sciences. These fluorescent compounds indeed have interesting spectroscopic characteristics, which make them markers of choice for detecting biological molecules. These fluorescent compounds are particularly suitable for use in conjunction with compatible fluorophores to carry out FRET measurements (the acronym for "Fester Resonance Energy Transfer”), the application of which for studying interactions between biomolecules is exploited by several companies, including Cisbio Bioassays and its HTRF® product line.
  • FRET measurements the acronym for "Fester Resonance Energy Transfer”
  • the fluorescent lanthanide complexes consist of three parts:
  • the application WO 89/04826 relates to the synthesis of lanthanide complexes comprising three chromophores of trimethoxyphenylpyridine type. These complexes belong to the chelate family, which makes them very unstable complexes, especially in the presence of divalent cations or complexing agents of the EDTA type, which are used as additives in the immunoassay buffers.
  • the authors describe complexes comprising trimethoxyphenylpyridine units.
  • the object of the invention is to overcome the disadvantages of the compounds of the prior art by providing stable complexes in the presence of EDTA and with most divalent cations, soluble in all biological media since the complexes of the invention comprise water-soluble groups of anionic, cationic or zwitterionic type and finally a functionalization branch directly substituted on the ethylenic chain of the triazacyclononane ring, which ring is particularly adapted to the complexation of the lanthanide atom and which respects a symmetry of C3 type around lanthanide.
  • the complexes of the invention provide compounds whose emission spectrum is well adapted to their use in FRET experiments, as well as good practicality for the labeling of biomolecules.
  • Figures 1 to 3 respectively represent the UV spectrum, the chromatogram and the mass spectrum of a representative complex of the invention.
  • Figures 4 to 6 respectively show the UV spectrum, the chromatogram and the mass spectrum of a representative complex of the invention.
  • Figures 7 to 9 show respectively the UV spectrum, the chromatogram and the mass spectrum of a representative complex of the invention.
  • the complexing agents according to the invention are the compounds of formula (I):
  • Chron 1, Chrom 2 and Chrom 3 each represent a group of formula (Ia) or (Ib):
  • X 2 each represents a group L CO-R or L 2 -G;
  • R is a group -OR 2 or -NH-E
  • Ra is H or a group - (CH 2 )
  • - R is a group -C0 2 H or -PO (OH) R 3 ;
  • R 2 is H or a (C 1 -C 4 ) alkyl
  • R 3 is (C 1 -C) alkyl, preferably methyl; a phenyl optionally substituted with a group -SO 3 " , the latter preferably being in the meta or para position, or a benzyl;
  • L 2 is a divalent linking group
  • G is a reactive group
  • E is -CH 2 - (CH 2) s -CH 2 -S0 3 " or -N + Alk 1 Alk 2 Alk 3i or sulfobetaine;
  • I is an integer from 1 to 4.
  • r is an integer from 1 to 6, preferably from 1 to 3;
  • s 0, 1 or 2;
  • Alk, Alk 2 , Alk 3 which may be the same or different, represent a (dC 6 ) alkyl
  • the compound of formula (I) has at least one group of formula (Ia) and at least one group L r CO-R.
  • PEG group is meant a polyethylene glycol group of formula -CH 2 - (CH 2 OCH 2 ) y -CH 2 OCH ; being an integer from 1 to 5.
  • Sulfobetaine means a group chosen from:
  • R 4 which represents a (CC 6 ) alkyl, preferably a methyl or ethyl, and t which is equal to 1, 2, 3, 4, 5 or 6, and which is preferably 1 or 2, sulfobetaine of formula - (CH 3 ) 2 N + - (CH 2 ) 3 -SO 3 ' being preferred.
  • the groups -SO 3 H, -C0 2 H and -PO (OH) 2 are in deprotonated form or not. These groups therefore designate in the rest of the text also the groups -S0 3 " , -C0 2 " and -PO (OH) 0 ⁇ , and vice versa.
  • a first preferred family of complexing agents consists of the compounds of formula (I) in which Chrom represents a group of formula (Ia) in which X is a group L 2 -G; and Chrom 2 and Chrom 3 , which are identical or different, each represents a group of formula (Ib) in which X 2 is a group L CO-R.
  • Chrom Chrom 2 and 3 are identical.
  • a second preferred family of complexing agents consists of the compounds of formula (I) where Chronium ! and Chrom 2 , which may be identical or different, each represents a group of formula (Ia) in which X is a group L CO-R; and Chrom 3 represents a group of formula (Ib) in which X 2 is a group L 2 -G.
  • Chrom-1 and Chrom 2 are identical.
  • a third preferred family of complexing agents consists of the compounds of formula (I) in which Chroma Chrom 2 and Chrom 3 , which are identical or different, each represent a group of formula (Ia) wherein, is a group U-CO-R; and Ra is - (CH 2 ) r G.
  • Chrom-Chrom 2 and Chrom 3 are the same.
  • preferred subfamilies are those wherein the complexing agents comprise one or more of the following characteristics:
  • R 4 is (C 1 -C 4 ) alkyl and t is 1 or 2.
  • the complexing agents of formula (I) comprise several groups E, at most one of these groups represents a sulfobetaine.
  • the reactive group G carried by a spacing arm L 2 makes it possible to couple the compounds according to the invention with a species that it is desired to render fluorescent, for example an organic molecule, a peptide, a protein or a nucleotide (RNA , DNA).
  • a species that it is desired to render fluorescent for example an organic molecule, a peptide, a protein or a nucleotide (RNA , DNA).
  • the conjugation techniques of two organic molecules are based on the use of reactive groups and fall within the general knowledge of those skilled in the art. These conventional techniques are described for example in Bioconjugate Techniques, Hermanson WG, Academy Press, Second Edition 2008, p. 169-211.
  • the reactive group is an electrophilic or nucleophilic group that can form a covalent bond when it is respectively brought into contact with a suitable nucleophilic or electrophilic group.
  • the conjugation reaction between a compound according to the invention comprising a reactive group and an organic molecule, a peptide or a protein bearing a functional group results in the formation of a covalent bond comprising one or more atoms of the reactive group.
  • the reactive group G is a group derived from one of the following compounds: an acrylamide, an activated amine (for example a cadaverine or an ethylenediamine), an activated ester, an aldehyde, an alkyl halide, a anhydride, aniline, azide, aziridine, carboxylic acid, diazoalkane, haloacetamide, halotriazine, such as monochlorotriazine, dichlorotriazine, hydrazine (including hydrazides), imido ester, isocyanate, isothiocyanate, a maleimide, a sulfonyl halide, or a thiol, a ketone, an amine, an acid halide, a succinimidyl ester, a hydroxysuccinimidyl ester, a hydroxysulfosuccinimidyl ester, an azidonitrophenyl,
  • w is from 0 to 8 and v is 0 or 1
  • Ar is a saturated or unsaturated 5- or 6-membered heterocycle comprising 1 to 3 heteroatoms, optionally substituted with a halogen atom.
  • the reactive group G is an amine (optionally protected in form - NHBoc), a succinimidyl ester, a haloacetamide, a hydrazine, an isothiocyanate, a group maleimide, or a carboxylic acid (optionally protected in the form of a group -C0 2 e, -C0 2 tBu).
  • the acid will have to be activated in ester form to be able to react with a nucleophilic species.
  • the reactive groups G are linked to the complexing agent by a covalent bond or via a spacer arm advantageously constituted by a divalent organic radical.
  • the spacer arm L 2 can be chosen from:
  • said alkylene, cycloalkylene or arylene groups optionally containing one or more heteroatoms, such as oxygen, nitrogen, sulfur, phosphorus or one or more carbamoyl or carboxamido group (s), and said alkylene, cycloalkylene or arylene groups being optionally substituted with 1 to 5, preferably 1 to 3, C 1 -C 8 alkyl, C 6 -C 4 aryl, sulfonate or oxo;
  • n, m, p, q are integers from 1 to 16, preferably from 1 to 5 and e is an integer from 1 to 6, preferably from 1 to 4.
  • the group -L 2 -G consists of a reactive group G chosen from: a carboxylic acid (optionally protected in the form of a group -C0 2 e, -C0 2 tBu), an amine (optionally protected form -NHBoc), a succinimidyl ester, a haloacetamide, a hydrazine, an isothiocyanate, a maleimide group, and an L 2 spacer arm consisting of an alkylene chain comprising from 1 to 5 carbon atoms or of a group chosen from groups of formula:
  • n, m are integers from 1 to 16, preferably from 1 to 5 and e is an integer from 1 to 6, preferably from 1 to 4, the group G being bound to one or the other other end of these divalent groups.
  • complexing agents consisting of a tri-zoned macrocycle (1, 4,7-triazacyclononane, hereinafter TACN) whose nitrogen atoms are substituted by chromophores of trimethoxyphenylpyridine type in which the methoxy in position 4 has been replaced by an O-X1 group, which makes it easy to introduce water-solubilising functions.
  • TACN tri-zoned macrocycle
  • chromophores of trimethoxyphenylpyridine type in which the methoxy in position 4 has been replaced by an O-X1 group
  • the lanthanide complexes according to the invention have excellent photophysical properties, in particular as regards their quantum yield, the lifetime of their luminescence and their excitation spectrum, which is very well adapted to a laser excitation at approximately 337 nm. nm.
  • the complexes of the invention may comprise one, two or three chromophores which makes it possible to easily modulate the overall brightness of the complex as well as the size of the complex. When the complex comprises a chromophore, the steric hindrances are small.
  • the invention also relates to lanthanide complexes consisting of a lanthanide atom complexed with a complexing agent as described above, the lanthanide being chosen from: Eu 3+ , Sm 3+ , Tb 3 ⁇ Gd 3+ , Dy 3+ , Nd 3t , Er 3+ .
  • the lanthanide is Tb 3+ , Sm 3+ or Eu 3+ and even more preferably Tb 3+ .
  • complexes are prepared by contacting the complexing agents according to the invention and a lanthanide salt.
  • lanthanide salt an equivalent of complexing agent and 1 to 5 equivalents of lanthanide salt (europium, samarium or terbium in the form of chlorides, acetates or triflates) in a solvent (acetonitrile, methanol or other solvent compatible with these salts) or buffer, at room temperature for a few minutes, leads to the corresponding complex.
  • the fluorescent complexes obtained have excellent photophysical properties, in particular with regard to their quantum efficiency, the lifetime of their luminescence and their excitation spectrum, which is very well adapted to a laser excitation at approximately 337 nm. nm.
  • the distribution of the bands of their emission spectra confers on the complexes very favorable properties in the use of FRET with acceptors of the cyanine, fluorescein, rhodamine or allophycocyanin type (such as the XL665 marketed by Cisbio Bioassays). Because of the high stability of these complexes in biological media containing most divalent cations (Ca 2+ , Mg 2+ ...) or EDTA, their luminescence remains excellent compared to the complexes of the prior art.
  • the complexing agents and lanthanide complexes according to the invention comprising a group -L 2 -G, are particularly suitable for labeling organic or biological molecules comprising a functional group capable of reacting with the reactive group to form a covalent bond.
  • the invention also relates to the use of lanthanide complexes for labeling molecules of interest (proteins, antibodies, enzymes, hormones, RNA, DNA, etc.).
  • the invention also relates to the molecules labeled with a complex according to the invention.
  • All organic or biological molecules may be conjugated with a complex according to the invention if they have a functional group capable of reacting with the reactive group.
  • the conjugates according to the invention comprise a complex according to the invention and a molecule chosen from: an amino acid, a peptide, a protein, an antibody, a sugar, a carbohydrate chain, a nucleoside, a nucleotide (DNA, RNA), an oligonucleotide, an enzyme substrate (in particular a suicide enzyme substrate such as a benzylguanine or a benzylcytosine (substrates of the enzymes sold under the names Snaptag and Cliptag)), a chloroalkane (substrate of the enzyme sold under the name Halotag), coenzyme A (substrate of the enzyme marketed under the name ACPtag or CPtag).
  • a suicide enzyme substrate such as a benzyl
  • Diagram 1 From the macrocycle triazacyclononane mono protected Boc 1, were introduced the two pyridinyl units which will be used to hang the two solubilizing groups E.
  • the protective group Boc is removed then the antenna (chromophore) is added to the macrocycle thus leading to the ligand 3.
  • the hydrolysis of the esters (carboxylates and phosphinates) was carried out in a conventional manner using basic conditions. This then makes it possible to incorporate the lanthanide atom (Ln) thus forming the complexes 5. From these complexes, the two water-solubilizing functions E are introduced. Finally, after deprotection of the protective group Boc carried by the antenna (chromophore), the complexes are functionalized (7) so that they can be conjugated on biomolecules.
  • the di-antenna systems are obtained using a similar strategy but reversing the order of introduction of the pyridinyl units and chromophores. This time antennas are introduced in first place to lead to the compounds 8. After removal of the Boc group, the last pyridinyl unit was introduced. The sequence is identical, namely hydrolysis of the ester functions (carboxylates and phosphinates), formation of the lanthanide complex, introduction of the two water-solubilizing functions E (this time these functions are carried by the chromophores) and then incorporation into the di-antenna family 13 .
  • the synthesis is simplified because the amino function which makes it possible to introduce a functional group is fixed directly on the macrocycle triazacyclononane (TACN).
  • TACN macrocycle triazacyclononane
  • the three chromophores are thus introduced in the first step, followed by the hydrolysis of the ester functions (carboxylates and phosphinates) and then the complexation with the desired lanthanide.
  • the complexes are made soluble by fixing on each of the chromophores solubilizing groups E. After deprotection of the amine, this function is converted into a reactive function for bioconjugation.
  • the complexing function (carboxylic acid or phosphinic acid), in position 4 a function which allows either to introduce the water-solubilising group (methyl ester function) or a function which makes it possible to incorporate the functional group (protected amino function and tert-butyl ester function)
  • the analogous compounds 28a-c (without carbon chain) of the series 25 were prepared according to a similar strategy.
  • the introduction of the NHBoc group was carried out for example using the method described in the review article Tetrahedron Letters 2010, 51, 4445.
  • the methyl ester function at the 4-position may be directly attached to the aromatic ring (pyridine).
  • pyridine aromatic ring
  • the pyridine is then oxidized in the presence of m-CPBA leading to the corresponding N-oxide derivative 36.
  • the N-oxide function is easily reacted with trifluoroacetic anhydride which undergoes a rearrangement to conduct after hydrolysis to the methyl alcohol function at position 6. This The latter is mesylated under standard conditions thus leading to compound 38.
  • Analogous phosphinate derivatives 44a-b were prepared using compound 39 which is first esterified and then converted to phosphinate ester 41a-b. The rest of the reaction sequence is identical to that used for the synthesis of compound 38. 3
  • the derivatives 51a-b were prepared according to the reaction sequence described in scheme 11.
  • the ester functions are introduced using ethyl or tert-butyl thioglycolate.
  • phosphinate analogs 56a-d are prepared according to the synthetic route described in Scheme 12. 2) Preparation of chromophores
  • the chromophores were synthesized according to schemes 13a-b and 14.
  • the phenol 57 is protected as TBDMS.
  • the next step consists in carrying out selective lithiation at position 4 of OTBDMS followed by addition of the electrophile (2-iso-propoxy-4 l 4.5 l 5-tetramethyl-1, 3,2-dioxaborolane).
  • Compound 59 is obtained with a yield of 39%.
  • Compound 59 is then coupled via a Suzuki reaction to pyridine derivatives 14a-c.
  • the reaction conditions lead to a mixture of 60a-c (acid form) and 61a-c (ester form). It should be noted that the protective group of phenol is also removed during this step. This mixture is treated under esterification conditions thus making it possible to convert the series 60 into series 61.
  • the phenol functions are alkylated (62) and the alcohol functions are mesylated, which leads to the compounds 63a-c.
  • the amine function is necessary, it is then introduced onto the chromophore by alkylating the phenol with bromopropylamine NHBoc leading to the series 64 and the alcohol functions are mesylated (series 65).
  • FIG. 15 The mono-antenna complexes are synthesized according to Scheme 15. Starting from the Boc-protected mono TACN macrocycle, the pyridinyl derivatives (Py) leading to the compounds 66a-s are condensed. The macrocycle is deprotected and the corresponding chromophore (Z identical to those carried by the Py) is introduced on the ligand. The ester functions are hydrolyzed (series 68) and the lanthanide (in particular europium or terbium) is complexed in the various ligands to give the 69a-s complexes.
  • the lanthanide in particular europium or terbium
  • the compounds are rendered soluble in aqueous media by the introduction of two water-solubilizing groups E, -E s : these groups are either of anionic nature (sulfonates, E, and E 2 ) or neutral (zwitterion : sulfo-betaines, E 3 ), or of cationic nature (quaternary ammonium E 4 and E 5 ).
  • the synthesis begins with the alkylation reaction on the monoprotected TACN with the three types of chromophores: carboxylate, methyl phosphinate and phenyl phosphinate.
  • the protecting group Boc is removed and the corresponding pyridines carrying the Z identical to the chromophores are introduced on the last alkylation site of the TACN.
  • the ligands are hydrolysed and the lanthanide atom is introduced into the macrocycle leading to series 74.
  • the water-solubilising groups (EE 5 ) are then introduced on the two chromophores (diagram 20). They are anionic, neutral or cationic.
  • the tri-antenna complexes were synthesized according to the reaction scheme described in scheme 22.
  • TACN 1b On the mono substituted TACN 1b are condensed the different mesylated pyridines (63a-c).
  • the ligands 77a-c obtained are hydrolysed in the presence of lithium and then brought into contact with the corresponding lanthanide salts, which leads either to the europium complexes Eu-79a-c or to the terbium complexes Tb-79a-c.
  • the Boc group is removed in the presence of trifluoroacetic acid, which leads to the complexes Eu-81a-c and Tb-81a.
  • CDCI 3 deuterated chloroform
  • DIAD Diisopropyl azodicarboxylate
  • DIPEA diisopropylethylamine
  • HATU (O- (7-azabenzotriazol-1-yl) -N, N, N ', N'-tetramethyluronium hexafluorophosphate) HNO 3 : nitric acid
  • LiOH / Lithine lithium hydroxide
  • TSTU 0- (N-Succinimidyl) -1,1,3,3-tetramethyluronium tetrafluoroborate
  • UPLC-S ultra-high performance liquid chromatography coupled with Xphos: 2-dicyclohexylphosphino-2 ', 4' , 6'-tri-isopropylbiphenyl mass spectrometry
  • HPLC high performance liquid chromatography
  • High performance ultra-high performance liquid chromatography was performed on a Waters Acquity HCIass device with either a PDA-type PDA detector or a single SQD2 quadrupole mass detector.
  • the probe used is an electro-spray in positive mode: capillary voltage at 3.2 KV - cone voltage at 30 V.
  • the silica column chromatographies were carried out on Merck silica gel 60 (0.040-0.063 mm).
  • the alumina column chromatographies were performed on Sigma-Aldrich aluminum oxide, neutral, activated, Brochmann I.
  • the NMR spectra ( 1 H, 13 C and 31 P) were carried out using a Bruker Avance 400 MHz NanoBay spectrometer (9.4 Tesla magnet), equipped with a BBFO measurement probe, multi-nuclei. diameter 5 mm, gradient Z and lock 2 H.
  • the chemical shifts ( ⁇ ) are expressed in parts per million (ppm). The following abbreviations are used:
  • s singlet
  • s I broad singlet
  • s app apparent singlet
  • d doublet
  • t triplet
  • q quadruplet
  • m multiplet
  • dd doublet split
  • td doubled triplet
  • qd doubled quadruplet
  • ddd doublet
  • Duplicate doublet AB: AB system.
  • the mass spectra were performed using a Waters ZQ 2000 single-quadrupole ESI / APCI multimode source spectrometer equipped with Waters XBridge C18, 3.5 ⁇ , 4.6 ⁇ 100 mm column or a simple quadrupole mass spectrum of the SQD2 type.
  • the analyzes were performed with a QStar Elite (Applied Biosystems SCIEX) mass spectrometer equipped with a pneumatically assisted atmospheric pressure ionization (API) source.
  • the sample was ionized in positive electrospray mode under the following conditions: electrospray voltage (ISV): 5500 V; orifice voltage (OR): 20 V; Nebulization gas pressure (air): 20 psi.
  • ISV electrospray voltage
  • OR orifice voltage
  • Nebulization gas pressure (air) 20 psi.
  • HRMS flight time analyzer
  • the exact mass measurement was performed in triplicate with a double internal calibration.
  • Compound 1 was prepared according to the procedure described in applications WO 2013/01 1236 and WO 2014/1 1 1661.
  • Compounds 15b-15f These compounds were prepared according to the same procedure as that used for the synthesis of 15a using the corresponding alkenes.
  • Compound 16a In a 50 ml flask Compound 15a (233 mg, 0.927 mmol) was solubilized in eOH (10 mL) to give a colorless solution. To the reaction mixture was added 10% Pd / C (23.69 mg, 0.022 mmol) in one go. The reaction was stirred at RT with dihydrogen bubbling for 2 h. The progress of the reaction was monitored by UPLC-MS (gradient A). After this period, the reaction was complete.
  • Compound 27a-c compounds 27a-c were prepared according to the procedure described in the article: Tetrahedron Letters 2010, 51, 4445.
  • Compound 29 This compound is commercially available.
  • Compound 30 was prepared according to the procedure described in the article: Dalton Transactions 2010, 39, 707.
  • Compounds 32a-32c Compounds 32a-32c were prepared according to the procedure described in the article: Journal of Organic Chemistry 2010, 75, 7175.
  • Compounds 33a-33c Compounds 33a-33c were prepared according to the procedure described in the article: Journal of Organic Chemistry 2010, 75, 7175.
  • Compound 35 was prepared according to the procedure described in the article: Bioorganic Chemistry 2014, 57, 148.
  • Compound 36 was prepared according to the procedure described in the article: Carbohydrate Research 2013, 372, 35.
  • Compound 37 was prepared according to the procedure described in application WO 2014/111661.
  • Compound 38 The compound was prepared according to the same procedure as that used for the synthesis of 17a.
  • Compound 40 was prepared according to the procedure described in the article: Bioorganic Chemistry 2014, 57, 148.
  • Compound 41a-b the compounds 41a-b were prepared according to the procedure described in the application WO 2014/1 11661 using the corresponding catalyst.
  • Compound 42a-b The compounds 42a-b were prepared according to the same procedure as that used for the synthesis of 36.
  • Compound 43a-b The compounds 43a-b were prepared according to the same procedure as that used for the synthesis of 37.
  • Compound 44a-b The compounds 44a-b were prepared according to the same procedure as that used for the synthesis of 17a.
  • Compound 45 This compound is commercially available.
  • Compound 46 was prepared according to the procedure described in the article: Chemistry - A European Journal, 2014, 20, 3610.
  • Compound 47 Compound 46 (0.313 g, 2.04 mmol) was dissolved in H 2 S0 (11 mL) at RT and then the solution was cooled in an ice bath. To this mixture was added dropwise HNO 3 (9.7 mL) and the solution was heated at 100 ° C for 2 days. The mixture was cooled to RT and poured into crushed ice (100 g).
  • Compound 48 Compound 47 (2.9, 14.7 mmol) was dissolved in anhydrous MeOH (3 mL) at RT. To this solution was added H 2 S0 (200 ⁇ l) dropwise and the solution was heated at 65 ° C for 3 days. The solution was cooled to RT and the solvent was removed under reduced pressure. To the residue was added H 2 O (30 mL) and the solution was extracted with AcOEt (3 x 20 mL). The organic phases were combined, washed with 5% sodium bicarbonate solution (2 x 20 mL), then with saturated brine solution (20 mL). After drying over MgSO 4 , the solvent was filtered, removed under reduced pressure to yield compound 48 which was used in the subsequent synthesis without further purification (57 mg, 76%).
  • Compound 50b was prepared according to the same procedure as that used for the synthesis of 50a.
  • Compound 51b was prepared according to the same procedure as that used for the synthesis of 51a.
  • Compounds 52a-b The compounds 52a-b were prepared according to the same procedures as those used respectively for the synthesis of 14b and 14c.
  • Compounds 54a-b The compounds 54a-b were prepared according to the same procedure as that used for the synthesis of 49.
  • Compounds 55a-d the compounds 55a-d were prepared according to the same procedure as that used for the synthesis of 50a.
  • Compounds 56a-d Compounds 56a-d were prepared according to the same procedure as that used for the synthesis of 51a.
  • Compound 57 This compound is commercially available.
  • the reaction mixture was stirred at 65 for 4 h. The progress of the reaction was followed by
  • Tb-80a-E compound 4 In a 25 mL flask Tb-79a compound (9.3 mg, 6.4 pmol) was solubilized in anhydrous DMSO (1 mL) to give a colorless solution. To the reaction mixture was added 2-N, N, N-trimethylammonium-ethylamine (3.96 mg, 38.4 ⁇ mol), DIPEA (4.5 ⁇ L, 25.6 ⁇ mol) and then HATU (10.4 mmol). mg, 25.6 pmol) in one go. The reaction was stirred at RT for 15 min. The progress of the reaction was monitored by UPLC-MS (gradient C). After this period, the reaction was complete.
  • the UV spectrum, the chromatogram and the mass spectrum of the Eu-81a-E 2 complex are shown in FIGS. 1 to 3.
  • the UV spectrum, the chromatogram and the mass spectrum of the Tb-81a- E 2 complex are represented Figures 4 to 8.
  • the UV spectrum, the chromatogram and the mass spectrum of the Tb-81a * E complex are shown in Figures 7 to 9.
  • the solubility of the various complexes was determined as follows. For each complex, three equimolar solutions of europium complex were prepared in methanol, the solvent was removed under reduced pressure and the remaining solid was dissolved and stirred for 2 minutes. in a water / octanol mixture (2: 1, 1: 1, 1: 2), (0.9 mL). After equilibration, an emission spectrum of each phase was recorded in methanol (50 ⁇ L of solution in 1 mL of methanol). For each mixture, the LogP value was calculated using the following equation:
  • the LogP values of the complexes according to the invention are negative, which reflects a perfect solubility in the aqueous buffers, unlike the compounds 82a and 82b whose LogP values are weakly positive.

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Abstract

L'invention concerne des agents complexants de formule (I) dans laquelle Ra, Chrom1, Chrom2 et Chrom3 sont tels que définis dans la description. L'invention concerne également des complexes de lanthanides obtenus à partir de ces agents complexants. Application : marquage de molécules biologiques.

Description

AGENTS COMPLEXANTS DE TYPE T IMETHOXYPHENYL PYRIDINE
HYDROSOLUBLES ET COMPLEXES DE LANTHANIDE CORRESPONDANTS
La présente invention a pour objet des agents complexants ou ligands hydrosolubles, des complexes de lanthanide obtenus à partir de ces agents complexants, et l'utilisation de ces complexes de lanthanide pour marquer des molécules et les détecter par des techniques de fluorescence en temps résolu. Cette invention décrit des complexes stables comportant un, deux ou trois chromophores de type triméthoxyphényl-pyridine hydrosolubles et fonctionnalisés. Etat de la technique
Les complexes de lanthanide ont vu leur utilisation augmenter de manière très importante depuis une vingtaine d'années dans le domaine des sciences de la vie. Ces composés fluorescents présentent en effet des caractéristiques spectroscopiques intéressantes, qui en font des marqueurs de choix pour détecter des molécules biologiques. Ces composés fluorescents sont particulièrement appropriés pour être utilisés en conjonction avec des fluorophores compatibles pour effectuer des mesures de FRET (acronyme de l'expression anglaise « Fôrster Résonance Energy Transfer »), dont l'application pour étudier les interactions entre biomolécules est exploitée de manière commerciale par plusieurs sociétés, dont Cisbio Bioassays et sa gamme de produits HTRF®. La durée de vie relativement longue des complexes de lanthanides permet également d'effectuer des mesures de fluorescence en temps résolu, c'est-à-dire avec un délai après excitation des fluorophores, ce qui permet de limiter les interférences de fluorescence dues au milieu de mesure. Cette dernière caractéristique est d'autant plus utile que le milieu de mesure se rapproche d'un milieu biologique, qui comprend de nombreuses protéines dont la fluorescence pourrait interférer avec celle des composés étudiés. Plusieurs complexes de lanthanides ont été divulgués et certains sont exploités de manière commerciale : on peut citer en particulier les cryptâtes macropolycycliques de lanthanide (EP-A-0 180 492, EP-A-0 321 353, EP-A-0 601 113 , WO 2001/96877, WO 2008/063721 ), les complexes de lanthanide comportant un motif dérivé de la coumarine lié à un motif diéthylènetriamine penta-acide (US 5,622,821), et ceux comprenant des dérivés de pyridine (US 4,920,195, US 4,761 ,481), de bipyridine (US 5,216,134), ou de terpyridine (US 4,859,777, US 5,202,423, US 5,324,825).
Les complexes de lanthanide fluorescents sont constitués de trois parties :
un chromophore qui absorbe la lumière (phénomène d'antenne),
- une partie complexant
et d'un atome appartenant à la famille des lanthanides (en général l'europium ou le terbium).
De nombreux chromophores ont été utilisés par les équipes qui travaillent dans le domaine et ces travaux ont fait l'objet de nombreux articles de revue : Journal of Luminescence 1997, 75, 149 ; Chemical Reviews 2010, 110, 2729; et Inorganic Chemistry 2014, 53, 1854. Parmi tous ces travaux, peu d'entre eux ont été consacrés au chromophore triméthoxyphénylpyridine. Dans Journal of Luminescence 1997, 75, 149, les auteurs décrivent les propriétés photophysiques de dérivés de l'acide triméthoxyphényldipicolinique qui est formellement un chélate instable en milieux aqueux. Dans Analytical Chemistry 2005, 77, 2643, les auteurs ont introduit ce motif dans des nanoparticules afin de les rendre utilisable dans un immunoessai. Cependant ces particules sont de grande taille (45 nm de diamètre) ce qui est un inconvénient lorsque de petites molécules biologiques doivent être marquées avec des sondes fluorescentes.
La demande WO 89/04826 est relative à la synthèse de complexes de lanthanide comportant trois chromophores de type triméthoxyphénylpyridine. Ces complexes appartiennent à la famille des chélates ce qui en fait des complexes très instables surtout en présence de cations divalents ou d'agents complexants de type EDTA, qui sont utilisés comme additifs dans les tampons d'immuno- essais. Dans la demande WO 2005/058877, les auteurs décrivent des complexes comportant des motifs triméthoxyphénylpyridine. Ces chromophores ont été incorporés dans différentes structures :
lorsqu'ils sont incorporés dans des chélates, ils forment des complexes instables dans les milieux mentionnés précédemment (cations divalents et EDTA) ;
lorsque les chromophores sont intégrés dans des macrocycles de type triazacyclononane (TACN), cette fois les complexes sont stables mais sont assez peu solubles dans les milieux biologiques aqueux. De plus la fonction nalisation n'est pas possible directement et les auteurs ne décrivent aucune procédure pour fonctionnaliser ces systèmes ;
enfin lorsque ces chromophores sont incorporés dans des macrocycles de type triazacyclodécane, les complexes sont toujours aussi peu solubles dans les milieux aqueux biologiques. La fonction nalisation est réalisée sur le carbone central de la chaîne propylénique du macrocycle ce qui modifie la symétrie autour de l'atome de lanthanide et par conséquent la répartition des raies du spectre d'émission.
L'objet de l'invention vise à pallier aux inconvénients des composés de l'art antérieur en fournissant des complexes stables en présence d'EDTA et avec la plupart des cations divalents, soluble dans tous les milieux biologiques puisque les complexes de l'invention comportent des groupements hydrosolubilisants de type anionique, cationique ou zwitterionique et enfin un bras de fonctionnalisation directement substitué sur la chaîne éthylénique du cycle triazacyclononane, cycle qui est particulièrement adapté à la complexation de l'atome de lanthanide et qui respecte une symétrie de type C3 autour du lanthanide. Les complexes de l'invention fournissent des composés dont le spectre d'émission est bien adapté à leur utilisation dans des expériences de FRET, ainsi qu'une bonne praticité pour le marquage de biomolécules. Brève description des figures
Les figures 1 à 3 représentent respectivement le spectre UV, le chromatogramme et le spectre de masse d'un complexe représentatif de l'invention.
Les figures 4 à 6 représentent respectivement le spectre UV, le chromatogramme et le spectre de masse d'un complexe représentatif de l'invention.
Les figures 7 à 9 représentent respectivement le spectre UV, le chromatogramme et le spectre de masse d'un complexe représentatif de l'invention.
AGENTS COMPLEXANTS
Les agents complexants selon l'invention sont les composés de formule (I) :
Ch
Figure imgf000004_0001
rri! dans laquelle :
Chron^, Chrom2 et Chrom3 représentent chacun un groupe de formule (la) ou (Ib) :
Figure imgf000004_0002
et X2 représentent chacun un groupe L CO-R ou L2-G ;
R est un groupe -OR2 ou -NH-E ;
Ra est H ou un groupe -(CH2)|-G ;
- R, est un groupe -C02H ou -PO(OH)R3 ;
- R2 est H ou un (Ci-C4)alkyle ;
R3 est un (Ci-C )alkyle, de préférence un méthyle ; un phényle éventuellement substitué par un groupe -S03 ", ce dernier étant de préférence en position méta ou para ; ou un benzyle ;
Î! est une liaison directe ; un groupe -(CH2)r - éventuellement interrompu par au moins un atome choisi parmi un atome d'oxygène, un atome d'azote et un atome de soufre ; un groupe -CH=CH- ; un groupe -CH=CH-CH2- ; un groupe -CH2-CH=CH- ; ou un groupe PEG ;
L2 est un groupe de liaison divalent ; G est un groupe réactif ;
E est un groupe -CH2-(CH2)s-CH2-S03 " ou -N+Alk1Alk2Alk3i ou une sulfobétaïne ;
I est un entier allant de 1 à 4 ;
r est un entier allant de 1 à 6, de préférence de 1 à 3 ;
s est 0, 1 ou 2 ;
Alk,, Alk2, Alk3, qui peuvent être identiques ou différents, représentent un {d-C6)alkyle ;
étant entendu que le composé de formule (I) comporte au moins un groupe de formule (la) et moins un groupe LrCO-R.
Par groupe PEG on entend un groupe polyéthylène glycol de formule -CH2-(CH2OCH2)y-CH2OCH; étant un nombre entier allant de 1 à 5.
Par sulfobétaïne on entend un groupe choisi parmi :
Figure imgf000005_0001
avec R4 qui représente un (C C6)alkyle, de préférence un méthyle ou éthyle, et t qui est égal à 1 , 2, 3, 4, 5 ou 6, et de préférence qui est égal à 1 ou 2, la sulfobétaïne de formule -(CH3)2N+-(CH2)3-S03 ' étant préférée.
En fonction du pH, les groupes -S03H, -C02H et -PO(OH)2 sont sous forme déprotonée ou pas. Ces groupes désignent donc dans la suite du texte également les groupes -S03 ", -C02 " et -PO(OH)0~, et vice-versa.
Une première famille préférée d'agents complexants est constituée des composés de formule (I) où Chrom, représente un groupe de formule (la) dans laquelle X, est un groupe L2-G ; et Chrom2 et Chrom3, identiques ou différents, représentent chacun un groupe de formule (Ib) dans laquelle X2 est un groupe L CO-R. Dans un mode de réalisation, Chrom2 et Chrom3 sont identiques.
Une deuxième famille préférée d'agents complexants est constituée des composés de formule (I) où Chronri! et Chrom2, identiques ou différents, représentent chacun un groupe de formule (la) dans laquelle X est un groupe L CO-R ; et Chrom3 représente un groupe de formule (Ib) dans laquelle X2 est un groupe L2-G. Dans un mode de réalisation, Chrom-i et Chrom2 sont identiques.
Dans un mode de réalisation commun aux deux premières familles préférées d'agents complexants,
Ra est H.
Une troisième famille préférée d'agents complexants est constituée des composés de formule (I) où Chroma Chrom2 et Chrom3, identiques ou différents, représentent chacun un groupe de formule (la) dans laquelle , est un groupe U-CO-R ; et Ra est un groupe -(CH2)rG. dans un mode de réalisation, Chrom^ Chrom2 et Chrom3 sont identiques.
Parmi ces trois familles préférées, des sous-familles préférées sont celles où les agents complexants comprennent une ou plusieurs des caractéristiques ci-après :
Rt est un groupe -C02H ou -P(0)(OH)R3 dans lequel R3 est un (d-C4)alkyle ou un phényle; L, est une liaison directe ; un groupe -(CH2)r - éventuellement interrompu par au moins un atome choisi parmi un atome d'oxygène et un atome de soufre, et r = 2 ou 3 ; un groupe -CH=CH- ; un groupe -CH=CH-CH2- ; ou un groupe -CH2-CH=CH- ;
- E est un groupe -CH2-(CH2)S-CH2-S03 ' avec s = 0 ou 1 ;; -(CHaJs-NTAI^AlkaAIks avec Alki ,
Alk2 Alk3, identiques ou différents, représentant un (Ci-C4)alkyle et s = 0 ou 1 ; ou un groupe de formule :
Figure imgf000006_0001
dans laquelle R4 est un (Ci-C4)alkyle et t est 1 ou 2.
Dans un mode de réalisation de l'invention, lorsque les agents complexants de formule (I) comprennent plusieurs groupes E, au plus l'un de ces groupes représente une sulfobétaïne.
Le groupe réactif G porté par un bras d'espacement L2, permet de coupler les composés selon l'invention avec une espèce que l'on souhaite rendre fluorescente, par exemple une molécule organique, un peptide, une protéine ou un nucléotide (ARN, ADN). Les techniques de conjugaison de deux molécules organiques sont basées sur l'utilisation de groupes réactifs et relèvent des connaissances générales de l'homme du métier. Ces techniques classiques sont décrites par exemple dans Bioconjugate Techniques, G.T. Hermanson, Académie Press, Second Edition 2008, p. 169-211.
Typiquement, le groupe réactif est un groupe électrophile ou nucléophile qui peut former une liaison covalente lorsqu'il est respectivement mis en présence d'un groupe nucléophile ou électrophile approprié. La réaction de conjugaison entre un composé selon l'invention comportant un groupe réactif et une molécule organique, un peptide ou une protéine portant un groupe fonctionnel entraîne la formation d'une liaison covalente comportant un ou plusieurs atomes du groupe réactif.
De préférence, le groupement réactif G est un groupe dérivé d'un des composés ci-après : un acrylamide, une aminé activée (par exemple une cadavérine ou une éthylènediamine), un ester activé, un aldéhyde, un halogénure d'alkyle, un anhydride, une aniline, un azide, une aziridine, un acide carboxylique, un diazoalcane, un haloacétamide, une halotriazine, telle que la monochlorotriazine, la dichlorotriazine, une hydrazine (y compris les hydrazides), un imido ester, un isocyanate, un isothiocyanate, un maléimide, un halogénure de sulfonyle, ou un thiol, une cétone, une aminé, un halogénure d'acide, un ester de succinimidyle, un ester d'hydroxysuccinimidyle, un ester d'hydroxysulfosuccinimidyle, un azidonitrophényle, un azidophényle, un 3-(2-pyridyldithio)- propionamide, un glyoxal, une triazine, un groupe acétylénique, et en particulier un groupe choisi parmi
Figure imgf000007_0001
dans lesquelles w varie de 0 à 8 et v est égal à 0 ou 1 , et Ar est un hétérocycle à 5 ou 6 chaînons saturé ou insaturé, comprenant 1 à 3 hétéroatomes, éventuellement substitué par un atome d'halogène.
De manière préférée, le groupement réactif G est une aminé (éventuellement protégée sous forme - NHBoc), un ester de succinimidyle, un haloacétamide, une hydrazine, un isothiocyanate, un groupe maléimide, ou un acide carboxylique (éventuellement protégé sous la forme d'un groupe -C02 e, -C02tBu). Dans ce dernier cas, l'acide devra être activé sous forme d'ester pour pouvoir réagir avec une espèce nucléophile.
Les groupes réactifs G sont liés à l'agent complexant par une liaison covalente ou bien via un bras d'espacement constitué de manière avantageuse par un radical organique bivalent. Ainsi, le bras d'espacement L2 peut être choisi parmi :
une liaison directe;
un groupe alkylène linéaire ou ramifié en Ci-C20, contenant éventuellement une ou plusieurs doubles ou triples liaisons ;
un groupe cycloalkylène en C5-C8 ; un groupe arylène en C6-C14;
lesdits groupes alkylène, cycloalkylène ou arylène contenant éventuellement un ou plusieurs hétéroatomes, tels que l'oxygène, l'azote, le soufre, le phosphore ou un ou plusieurs groupe(s) carbamoyle ou carboxamido, et lesdits groupes alkylène, cycloalkylène ou arylène étant éventuellement substitués par 1 à 5, de préférence 1 à 3, groupes alkyle en CrC8, aryle en C6-Ci4, sulfonate ou oxo ;
- un groupe choisi parmi les groupes divalents de formules suivantes : (CH2)n — (CH2)n— 0-(CH2)m— 0-(CH2)p
Figure imgf000008_0001
.
Figure imgf000009_0001
dans lesquelles n, m, p, q sont des nombres entiers de 1 à 16, de préférence de 1 à 5 et e est un nombre entier allant de 1 à 6, de préférence de 1 à 4.
De manière préférée, le groupe -L2-G est constitué d'un groupement réactif G choisi parmi : un acide carboxylique (éventuellement protégé sous la forme d'un groupe -C02 e, -C02tBu), une aminé (éventuellement protégée sous forme -NHBoc), un ester de succinimidyle, un haloacétamide, une hydrazine, un isothiocyanate, un groupe maléimide, et d'un bras d'espacement L2 constitué d'une chaîne alkylène comprenant de 1 à 5 atomes de carbone ou d'un groupe choisi parmi les groupes de formule :
Figure imgf000009_0002
où n, m, sont des nombres entiers de 1 à 16, de préférence de 1 à 5 et e est un nombre entier allant de 1 à 6, de préférence de 1 à 4, le groupe G étant lié à l'une ou l'autre extrémité de ces groupes divalents.
Description de l'invention
Les problèmes mentionnés précédemment ont été résolus grâce à des agents complexants constitués d'un macrocycle triazoté (1 ,4,7-triazacyclononane, ci-après TACN) dont les atomes d'azote sont substitués par des chromophores de type triméthoxyphénylpyridine dans lequel le méthoxy en position 4 a été remplacé par un groupement O-X1 , ce qui permet facilement l'introduction de fonctions hydrosolubilisantes. Les agents complexants selon l'invention forment des complexes stables avec les lanthanides, et peuvent être utilisés pour produire des conjugués fluorescents de molécules d'intérêt. Les complexes de lanthanide selon l'invention présentent d'excellentes propriétés photophysiques, en particulier en ce qui concerne leur rendement quantique, la durée de vie de leur luminescence et leur spectre d'excitation qui est très bien adapté à une excitation laser à environ 337 nm. Les complexes de l'invention peuvent comporter un, deux ou trois chromophores ce qui permet de moduler facilement la brillance globale du complexe ainsi que la taille du complexe. Lorsque le complexe comporte un chromophore, les encombrements stériques sont faibles. La présence de trois chromophores augmente de façon significative le coefficient d'absorption molaire (epsilon) et par conséquent la brillance globale du complexe, et la solubilité des complexes en milieu aqueux les rend très adaptés à une utilisation en milieu biologique. Enfin la fonction NH2 portée par le cycle TACN permet facilement la bioconjugaison avec des biomolécules. En particulier cette fonction est facilement convertible en ester de N-hydroxysuccinimide, fonction préférée des biologistes. COMPLEXES
L'invention concerne également les complexes de lanthanide constitués d'un atome de lanthanide complexé par un agent complexant tel que décrit ci-dessus, le lanthanide étant choisi parmi : Eu3+, Sm3+, Tb3\ Gd3+, Dy3+, Nd3t, Er3+. De préférence, le lanthanide est Tb3+, Sm3+ ou Eu3+ et de manière encore plus préférée Tb3+.
Ces complexes sont préparés en mettant en contact les agents complexants selon l'invention et un sel de lanthanide. Ainsi la réaction entre un équivalent d'agent complexant et 1 à 5 équivalents de sel de lanthanide (europium, samarium ou terbium sous forme de chlorures, d'acétates ou de triflates) dans un solvant (acétonitrile, méthanol ou autre solvant compatible avec ces sels) ou un tampon, à température ambiante pendant quelques minutes, conduit au complexe correspondant.
Comme indiqué précédemment, les complexes fluorescents obtenus présentent d'excellentes propriétés photophysiques, en particulier en ce qui concerne leur rendement quantique, la durée de vie de leur luminescence et leur spectre d'excitation qui est très bien adapté à une excitation laser à environ 337 nm. De plus la répartition des bandes de leurs spectres d'émission confère aux complexes des propriétés très favorables dans une utilisation de FRET avec des accepteurs de type cyanine, fluorescéine, rhodamine ou allophycocyanine (telle que la XL665 commercialisée par Cisbio Bioassays). Du fait de la grande stabilité de ces complexes dans les milieux biologiques contenant la plupart des cations divalents (Ca2+, Mg2+...) ou de l'EDTA, leur luminescence reste excellente comparée aux complexes de l'art antérieur.
CONJUGUES
Les agents complexants et complexes de lanthanide selon l'invention comportant un groupe -L2-G, sont particulièrement adaptés au marquage de molécules organiques ou biologiques comportant un groupe fonctionnel susceptible de réagir avec le groupe réactif pour former une liaison covalente. Ainsi l'invention concerne aussi l'utilisation des complexes de lanthanide pour le marquage de molécules d'intérêt (protéines, anticorps, enzymes, hormones, ARN, ADN etc.).
L'invention concerne également les molécules marquées par un complexe selon l'invention. Toutes les molécules organiques ou biologiques peuvent être conjuguées avec un complexe selon l'invention si elles possèdent un groupe fonctionnel susceptible de réagir avec le groupe réactif. En particulier, les conjugués selon l'invention comportent un complexe selon l'invention et une molécule choisie parmi : un acide aminé, un peptide, une protéine, un anticorps, un sucre, une chaîne glucidique, un nucléoside, un nucléotide (ADN, ARN), un oligonucléotide, un substrat d'enzyme (en particulier un substrat d'enzyme suicide telle qu'une benzylguanine ou une benzylcytosine (substrats des enzymes commercialisées sous les dénominations Snaptag et Cliptag)), un chloroalcane (substrat de l'enzyme commercialisée sous la dénomination Halotag), le coenzyme A (substrat de l'enzyme commercialisée sous le nom ACPtag ou CPtag).
SYNTHESE
La stratégie générale concernant la préparation des agents complexants (ligands) et des complexes selon l'invention est décrite de manière schématique ci-après (schéma 1 : mono-antenne, schéma 2 : di-antenne et schéma 3 tri-antenne), et de manière plus détaillée dans la partie expérimentale.
Figure imgf000011_0001
Schéma 1 A partir du macrocycle triazacyclononane mono protégé Boc 1 , ont été introduits les deux motifs pyridinyle qui seront utilisés pour accrocher les deux groupements solubilisants E. Le groupement protecteur Boc est supprimé puis l'antenne (chromophore) est ajoutée sur le macrocycle conduisant ainsi au ligand 3. L'hydrolyse des esters (carboxylates et phosphinates) a été réalisée de manière classique en utilisant des conditions basiques. Ceci permet ensuite d'incorporer l'atome de lanthanide (Ln) formant ainsi les complexes 5. A partir de ces complexes, sont introduites les deux fonctions hydrosolubilisantes E. Enfin après déprotection du groupement protecteur Boc porté par l'antenne (chromophore), les complexes sont fonctionnalisés (7) afin qu'ils puissent être conjugués sur des biomolécules.
Figure imgf000012_0001
Schéma 2
Les systèmes di-antennes sont obtenus en utilisant une stratégie analogue mais en inversant l'ordre d'introduction des motifs pyridinyle et des chromophores. Cette fois les antennes sont introduites en premier lieu pour conduire aux composés 8. Après suppression du groupement Boc, le dernier motif pyridinyle a été introduit. La suite est identique à savoir hydrolyse des fonctions esters (carboxylates et phosphinates), formation du complexe de lanthanide, introduction des deux fonctions hydrosolubilisantes E (cette fois ces fonctions sont portées par les chromophores) puis incorporation nt ainsi à la famille di-antenne 13.
Figure imgf000013_0001
Figure imgf000013_0002
Schéma 3
En ce qui concerne les complexes tri-antennes, la synthèse est simplifiée car la fonction aminé qui permet d'introduire un groupe fonctionnel est fixée directement sur le macrocycle triazacyclononane (TACN). Les trois chromophores sont ainsi introduits dans la première étape, suivie de l'hydrolyse des fonctions esters (carboxylates et phosphinates) puis la complexation avec le lanthanide souhaité. Les complexes sont rendus solubles en fixant sur chacun des chromophores des groupes solubilisants E. Après déprotection de l'amine, cette fonction est convertie en une fonction réactive permettant la bioconjugaison.
1) Préparation des briques pyridinyles
Les schémas ci-après (4-12) décrivent les différentes voies synthétiques permettant de disposer de dérivés pyridinyles trifonctionnels :
en position 2 la fonction complexante (acide carboxylique ou acide phosphinique), en position 4 une fonction qui permet soit d'introduire le groupe hydrosolubilisant (fonction ester méthylique) ou bien une fonction qui permet d'incorporer le groupe fonctionnel (fonction aminé protégée et fonction ester tert-butylique)
et enfin en position 6 une fonction méthyle alcool qui est convertie en mésylate correspondant afin de pouvoir réagir avec les aminés du cycle TACN.
Figure imgf000014_0001
15a, n = 0, Y= I, X= C02 e, 68% 16a, n = 1 , X= C02Me, 98% 17a, n = 1 , X= C02Me, 82%
14a, Y = I, X = C02Me
15b, n = 1, Y= I, X= C02Me 16b, n = 2, X= C02Me 17b, n = 2, X= C02Me 14b, Y = Br, X = PMe(0)OEt
15c, n = 0, Y= Br, X= P e(0)OEt 16c, n = 1 , X= PMe{0)OEt 17c, n = 1 , X= PMe(0)OEt 14c, Y = Br, X = PPh(Q)OEt
15d, n = 1, Y= Br, X= P e(0)OEt 16d, n = 2, X= PMe(0)OEt 17d, n = 2, X= P e(0)OEt 15e, n = 0, Y= Br, X= PPh(0)OEt 16e, n = 1 , X= PPh(0)OEt 17e, n = 1, X= PPh(0)OEt 15f, n = 1 , Y= Br, X= PPh(0)OEt n = 2, X= PPh(0)OEt 17f, n = 2, X= PPh(0)OEt
Figure imgf000014_0002
18a, n = 1 , x= co2Me
18b, n = 2, X= C02Me
18c, n = 1 , X= PMe(0)OEt
18d, n = 2. X= PMe(0)OEt
18e, n = 1, X= PPh(0)OEt
18f, n = 2, X= PPh(0)OEt
Schéma 4 Les synthèses des synthons 14a-c ont été décrites précédemment (cf. les demandes WO 2013/011236 et WO 2014/11 1661). A partir de ces synthons, la série des composés 17a-f a été obtenue par une séquence de trois réactions : réaction de Heck permettant de créer la liaison carbone-carbone entre le dérivé de la pyridine et l'alcène. Cette procédure a été décrite par exemple dans la demande de brevet EP-A-2 002 836. La réduction de la double liaison par hydrogénation catalytique suivie de la réaction de mésylation conduit aux composés 17a-f. Alternativement la double liaison peut être conservée pour rigidifier le système et imposer une orientation apicale aux groupements hydrosolubilisants (18a-f).
Figure imgf000015_0001
14a, Y = I, X = C02Me 19a, n = 0, Y= I, X= C02Me. 20a, n = 1, X=C02Me, 21a, n = 1, X=C02Me, 14b, Y = Br, X = PMe(0)OEI 19b, n = 1, Y= I, X= C02 e 20b, n = 2, X= C02Me 21b, n = 2, X=C02Me 14c, Y = Br, X = PPh(0)OEt 19c, n = 0, Y= Br. X= PMe(0)OEt 20c, n = 1, X=PMe(0)OEt 21c, n = 1, X=PMe{0)OEt
19d, n = 1 , Y= Br, X= PMe(0)OEt 20d, n = 2, X= PMe(0)OEl 21d, n = 2, X= PMe(0)OEt 19e, n = 0, Y= Br, X= PPh(0)OEt 20e,n = 1. X=PPh(0)OEt 21e, n = 1, X=PPh(0)OEt 19f, n = 1, Y= Br, X= PP (0)OEt 20f, n = 2, X=PPh(0)OEl 21f,n = 2, X=PPh(0)OEt
Figure imgf000015_0002
22a, n = 1, X=C02 e
22b, n = 2, X= C02 e
22c, n = 1, X=PMe(0)OEt
22d, n = 2, X= PMe(0)OEI
22e,n= 1, X=PPh(0)OEt
22f, n = 2, X=PPh(0)OEt
Schéma 5
Les composés 21a-f et 22a-f (schéma 5) sous forme ester tert-butylique (analogues de la série 17 et 18) ont été obtenus en suivant la même stratégie et en utilisant l'alcène correspondant.
Figure imgf000015_0003
14a, Y = I, X = C02Me 23a, n = 0, Y= I. X= C02Me. 24a, n = 1, X=C02 e, 25a, n = l. X=C02Me, 14b, Y = Br,X= P e(0)0Et 23b, n = 1, Y=l,X=C02Me 24b, n = 2, X= COjMe 25b, n = 2, X= C02 e 14c, Y = Br, X = PPh{0)0Et 23c, n = 0, Y= Br, X= PMe(0)OEt 24c, n = 1, X=PMe(0)OEt 25c, n = 1, X= PMe(0)OEt
23d, n = 1 , Y= Br, X= P e(0)0Et 24d,n = 2, X=P e{0)OEt 25d, n = 2, X= PMe(0)OEt 23e, n = 0, Y= Br, X= PPh(0)0Et 24e, n= 1, X=PPh(0)OEt 25e, n = 1, X= PPh(0)OEt 23f, n = 1 , Y= Br, X= PPh(0)0Et 24f, n = 2, X= PPh(0)OEt 25f,n = 2, X=PPh{0)OEt
Figure imgf000015_0004
26a, n = 1, X= C02 e
26b, n = 2, X=C02 e
26c, n = 1, X=PMe(0)OEt
26d, n = 2, X=P e(0)OEt
26e, n = 1, X=PPh(0)OEt
26f, n = 2. X=PPh(0)0Et
Schéma 6 Les composés 25a-f et 26a-f (schéma 5) sous forme NHBoc (analogues de la série 17 et 18) ont été obtenus en suivant la même stratégie en utilisant l'acène correspondant.
Figure imgf000016_0001
27a, X= C02 e, 28a, X= C02 e,
14a, Y = I, X = C02Me
27b, X= PMe(0)OEt 28b, X= PMe(0)OEt
14b, Y = Br, X = P e(0)OEt
27c, X= PPh(0)OEt 28c, X= PPh(0)OEt
14c, Y = Br, X = PPh(0)OEt
Schéma 7
Les composés 28a-c (sans chaîne carbonée) analogues de la série 25 ont été préparés selon une stratégie analogue. L'introduction du groupement NHBoc a été réalisée par exemple en utilisant la méthode décrite dans l'article de revue Tetrahedron Letters 2010, 51 , 4445.
Figure imgf000016_0002
Schéma 8
Les dérivés pyridinyles sur lesquels est intercalé en position 4 un atome d'oxygène entre le linker aliphatique portant la fonction (COzR ou NHBoc) et le noyau aromatique (pyridine), ont été préparés selon la méthode décrite dans le schéma 8. L'acide chélidamique 29 a été estérifié sous forme de diester méthylique puis le linker portant la fonction a été introduit en utilisant une réaction de Mitsunobu (procédure décrite par exemple dans Organic Biomolecular Chemistry 2012, 10, 9183). La mono-réduction en utilisant du borohydrure de sodium permet d'obtenir les composés 32a-c sous forme de monoalcool qui sont ensuite convertis en dérivés mésylés correspondants 33a-c.
Figure imgf000017_0001
Schéma 9
La fonction ester méthylique en position 4 peut être fixée directement sur le noyau aromatique (pyridine). Dans ce cas, il est nécessaire de partir du composé 34 commercial qui est d'abord estérifié. La pyridine est oxydée ensuite en présence de m-CPBA conduisant au dérivé N-oxyde correspondant 36. La fonction N-oxyde réagit facilement avec l'anhydride trifluoroacétique qui subit un réarrangement pour conduire après hydrolyse à la fonction méthyle alcool en position 6. Ce dernier est mésylé dans les conditions classiques conduisant ainsi au composé 38.
Figure imgf000017_0002
Me
Ph
m-CPBA
CHCI3
Figure imgf000017_0003
Schéma 10
Les dérivés phosphinates 44a-b analogues ont été préparés en utilisant le composé 39 qui est d'abord estérifié puis converti en ester de phosphinate 41a-b. La suite de la séquence réactionnelle est identique à celle utilisée pour la synthèse du composé 38. 3
Figure imgf000018_0001
51a, R = Et 50a, R = Et
51 b, R = tBu 50b, R = tBu
Schéma 11
Les dérivés 51a-b ont été préparés selon la séquence réactionnelle décrite dans le schéma 11. Dans cet exemple, les fonctions ester sont introduites en utilisant le thioglycolate d'éthyle ou de tert-butyle.
Figure imgf000018_0002
56a, R-i = Me, R2 = Et 55a, R = Me, R2 = Et 54a, R, = Me
56b, = Ph, R2 = Et 55b, Ri = Ph, R2 = Et 54b, R, = Ph
56c, R, = Me, R2 = tBu 55c, Ri = Me, R2 = tBu
56d, R, = Ph, R2 = tBu 55d, RT = Ph, R2 = tBu
Schéma 12
Les analogues phosphinates 56a-d sont préparés selon la voie de synthèse décrite dans le schéma 12. 2) Préparation des chromophores
Figure imgf000019_0001
59
Schéma 13a
Les chromophores ont été synthétisés selon les schémas 13a-b et 14. Le phénol 57 est protégé sous forme de TBDMS. L'étape suivante consiste à réaliser la lithiation sélective en position 4 du OTBDMS suivi de l'addition de l'électrophile (2-iso-propoxy-4l4,5l5-tétraméthyl-1 ,3,2-dioxaborolane). Le composé 59 est obtenu avec un rendement de 39%.
Figure imgf000019_0002
14a, Y = I, X = C02Me 60a, X = C02H 61a, X = C02Me 6 a, X = C02Me. 80% 14b, Y = Br, X = PMe(0)OEt 60b, X = PMe(0)OH 61b, X = PMe(0)OEt 61b, X = PMe(0)OEt 14c, Y = Br, X = PPh(0)OEt 60c, X= PPh(0)OH 61c, X= PP (0)OEt = PPh(0)OEt
Figure imgf000019_0003
63a, X = C02Me, 98% 62a, X = C02Me, 60% 63b, X = PMe(0)OEt 62b, X = PMe(0)OEt 63c, X = PPh(0)OEt 62c, X= PPh(0)OEt
Schéma 13b
Le composé 59 est ensuite couplé via une réaction de Suzuki sur les dérivés de la pyridine 14a-c. Les conditions de la réaction conduisent à un mélange de 60a-c (forme acide) et 61a-c (forme ester). Il faut noter que le groupement protecteur du phénol est également supprimé lors de cette étape. Ce mélange est traité dans des conditions d'estérification permettant ainsi de convertir la série 60 en série 61. Les fonctions phénols sont alkylées (62) et les fonctions alcools sont mésylées ce qui conduit aux composés 63a-c.
Figure imgf000020_0001
61a, X = C02Me 64a, X = C02Me 65a, X = C02Me
61b, X = P e(Û)OEt 64b, X = PMe(0)OEt 65b, X = PMe(0)OEt 61c, X= PP (Q)OEt 64c, X= PPh(0)OEt 65c, X = PPh(0)OEt
Schéma 14
Lorsque, pour des raisons de synthèse la fonction aminé est nécessaire, elle est alors introduite sur le chromophore en alkylant le phénol avec de la bromopropyiamine NHBoc conduisant à la série 64 puis les fonctions alcools sont mésylées (série 65).
) Synthèse des complexes mono-antenne
Figure imgf000021_0001
69a, Z = C02 ", L, = 0 68a, Z = C<¾", L, = 0
6Sb, Z = ΡΜβ(0)0 · L = 0 68b, Z = PMe(0)0"' M ' = 0
69c, Z = PPh(0)0\ L, = 0 68c, Z = PPh(0)0\ Ui = 0
69d, Z = C02 '. Li - -(CHjfe- 68d, Z = C02 , L, = - CH2 -
69e, Z = C02 -, L1 = -<CH2)3- 68e, Z = C02 . L, = - CH2)j-
69f, Z = PMe(0)0-, L, = -(CH2)2- 68f, Z = PMe(0)0\ u, = -(CH2)r
69g, Z = PMe(0)0\ L, = -(CH2)3- 68g, Z = PMe(0)0\ L, = -{CH2)3-
69h, Z » PPh(0)0-, L, = -(CH2)2- 68h, Z = PPh(O)0\ L, = -(CH2fe-
691, Z = PPh(0)0\ L, = -(CH2)3- 681, Z = PPh(0)0", L, = -(CHjfcj-
69J, Z = C02-, L, = -0<CH2)3- 68J, Z = C(¾\ Ui = -0(CH2h-
69k, Z = C02 ", L, = SCH2 68k, Z = C<¾-, L, = SCH2
691, Z = PMe(0)0\ L, 1 = SCH2 681, Z = PMe(0)0\ L, , = SCH2
69m, Z = PPh(0)0\ Li = SCH2 68m, Z = PPh(0)0\ L, = SCH2
69n, Z = CC¾-. L, = -CH=CH-, 68n, Z = C02\ L, = -CH=CH-,
69o, Z = C<¾-, L, = -CH=CH-CH2", 680, z = co2-. L, = -CH=CH-CH2-,
69p, Z = PMe(0)0-, L, = -CH=CH-, 68p, Z = PMe(0)0-, L 1 = -CH=CH-,
69q, Z = PMe(0)0-, L, = -CH=CH-CHr. 68q, Z = ΡΜβ(0)0', L 1 ¾ -CH— CH-CH2-,
68r, Z = PPh(0)0-, L, 1 = -CH=CH-, 68r, Z = PPh(O)0-, L, , = -CH=CH-,
69s, Z = PP (0)0-, L — -CH=CH-CH2", 68s, Z = PPh(0)0-, L, = -CH=CH-CH2-,
Schéma 15 Les complexes mono-antenne sont synthétisés selon le schéma 15. A partir du macrocycle TACN mono protégé Boc sont condensés les dérivés pyridinyles (Py) conduisant aux composés 66a-s. Le macrocycle est déprotégé et le chromophore correspondant (Z identiques à ceux portés par les Py) est introduit sur le ligand. Les fonctions esters sont hydrolysées (série 68) et le lanthanide (en particulier l'europium ou le terbium) est complexé dans les différents ligands pour conduire aux complexes 69a-s.
Figure imgf000022_0001
Figure imgf000022_0002
Schéma 16
Sur la série 69a-s, les composés sont rendus solubles dans les milieux aqueux par l'introduction de deux groupements hydrosolubilisants E,-Es : ces groupements sont soit de nature anionique (sulfonates, E, et E2) soit neutre (zwitterion : sulfo-bétaïnes, E3), soit de nature cationique (ammonium quaternaire E4 et E5).
Figure imgf000023_0001
70a-E, Z = C02\
70a-E2, Z = C02 ", 0
71a-E, Z = C02-,
70a-E3, Z = C02 ", 0
71a-E2, Z = C02 ", L- 70a-E4, Z = C02-, 0
71a-E3, Z = C02", L.
70a-E5, Z = C02 ", 0
71a-E4, Z = C02 ", L- 71a-Es, Z = C02 ", L.
70b-E1.S, Z PMe(0)0' 0
-(CH2)2- -<CH2)3- -(CH2)2- -(CH2)3- -(CH2)2- -<CH2)3- -0(CH2)3-
L1 = SCH2
L, = SCH2
L, = SCH2
L, = -CH=CH-, L, = -CH=CH-CH2- L, = -CH=CH-, L, = -CH=CH-CH2-, L, = -CH=CH-, L, = -CH=CH-CH2-,
Figure imgf000023_0002
Figure imgf000023_0003
Schéma 17
Enfin le groupement Boc est éliminé en présence d'acide trifluoroacétique ce qui conduit aux complexes de l'invention qui sont fonctionnalisés NH2> complexes 7~\a-E-,-s - Zls-E^s. 4) Synthèse des complexes di-antennes
La synthèse des complexes di-antennes est décrite dans les schémas 18-21.
Y = NHBoc
Y = NHBoc
Y = NHBoc
Y = NHBoc
Y = NHBOC
Y = NHBoc
Y = NHBoc
Y = NHBoc
Y = NHBoc
Y = C02tBu
Y = C02IBu
Y = C02tBu
Y = C02tBu
Y = C02tBu
Y = C02tBu
Y = C02tBu
Y = NHBoc
Y = C02tBu
Y = C02IBu
Y = C02tBu
Y = C02tBu Y = C02tBu
Y = C02tBu Y = C02tBu
Y = C02tBu Y = C02tBu
Y = NHBoc Y = NHBoc
Y = NHBoc Y = NHBoc
Y = NHBoc
Figure imgf000024_0001
Y = NHBoc
Schéma 18
La synthèse commence par la réaction d'alkylation sur le TACN monoprotégé avec les trois types de chromophores : carboxylate, méthyl phosphinate et phényl phosphinate. Le groupement protecteur Boc est éliminé et les pyridines correspondantes portant les Z identiques aux chromophores sont introduites sur le dernier site d'alkylation du TACN.
Figure imgf000025_0001
73a, Z = C02Me, L1 = 0, Y = NHBoc
73b, Z = PMe(0)OEt, L-i = 0, Y = NHBoc 74a, Z = = co2-, Li = 0, Y = NHBoc
73c, Z = PPh{0)OEt, L, = 0, Y = NHBoc 74b, Z = = PMe(0)0", L, = 0, Y = NHBoc
73d, Z = C02 e, L, = -(CH2)2-, Y = NHBoc 74c, Z = = PPh<0)0", Li = 0. Y = NHBOC
73e, z = C02Me, L, = -(CH2)3-, Y = NHBoc 74d, Z = = co2 , Li = -(CH2)2-, Y = NHBoc
73f, z = PMe(0)OEt, L, = -{CH2)2-, Y = NHBoc
74e, Z =
73g, z = PMe(0)OEt, L, = -(CH2)3-, Y = NHBoc = co2-, Li = -(CH2)3-, Y = NHBoc
73h, z = PPh{0)OEt, Li = -{CH2)2-, Y = NHBoc 74f, Z = = P e(0)0\ L, = -(CH2)2-, Y = NHBoc
73i, z = PPh(0)OEt, L, = -(CH2)3-, Y = NHBoc 74g, Z = = PMe(0)0-, Li = -(CH2)3-, Y = NHBoc
73j, z = C02Me, L = -(CH2)2-, Y = C02tBu 74h, Z = = PPrt(0)0", Li = -(CH2)2-, Y = NHBoc
73k, z = C02 e, = -(CH2)3-, Y = C02tBu 74i, Z = PPh(0)0", L, i = -(CH2)3-, Y = = NHBoc
73I, z = PMe(0)OEt, L = -<CH2)2-, Y = C02tBu
Z
73m, C02tBu z = PMe(0)OEt, L, = -(CH2)3-, Y = C02tBu 74j, = co2-, L- i = -(CH2)2-, Y =
73n, z = PPh(0)OEt, L, = -(CH2)2-, Y = C02tBu 74k, Z = co2-, L. i = -(CH2)3-, Y = C02tBu
73o, z = PPh(0)OEt, L, = -(CH2)3-, Y = C02tBu 74I, z = PMe(0)0\ Li = -(CH2)2-, Y = C02tBu
73p, z = C02 e, L, = -0(CH2)3-, Y = C02tBu 74m, z = P e(0)0", Li i - -(CH2)3-, Y = = C02tBu
73q, z = C02 e, L, = -0(CH2)3-, Y = NHBoc 74n, z = PPh(0)0\ Li = -(CH2)2-, Y = C02tBu
73r, z = C02Et, L, = SCH2, Y = C02tBu
73s, z = PMe(0)OEt, 74o, z = PPh(0)0\
Li = SCH2, Y = C02tBu Li = -(CH2)3-, Y = C02tBu
73t. z = PPh(0)OEt, = SCH2, Y = C02tBu 74p, z = co2-, L, = -0(CH2)3-, Y = C02tBu
73u, z = C02Me, L, = -CH=CH-, Y = C02tBu 74q, z = co2-, L, = -0(CH2)3-, Y = NHBoc
73v, z = C02Me, L, = -CH=CH-CH2- , Y = C02tBu 74r, z = co2 , L, = SCH2, Y = C02tBu
73w, z = PMe(0)OEt, L-, = -CH=CH-, Y = C02tBu 74s, z = PMe(0)0',
0 L, = SCH2, Y = C02tBu
73x, z = PMe( )OEt, L, = -CH=CH-CH2- . Y = C02tBu
Bu
73y, z = PPh{0)OEt, L, = -CH=CH-. Y = C02tBu 74t, z = PPh(0)0\ L, = SCH2, Y = C02t
73z, z = PPh(0)OEt, Li = -CH=CH-CH2- , Y = C02tBu 74u, z = co2-, Li = -CH=CH-, Y = C02tBu
73aa, Z = C02Me, L, = -CH=CH-, Y = NHBoc 74v, z = co2-, Li = -CH=CH-CH2- , Y = C02tBu
73ab, Z = C02Me, Li = -CH=CH-CH2- , Y = NHBoc 74w, z = PMe(0)0-, = -CH=CH-, Y = C02tBu
73ac, Z = PMe(0)OEt, Li = -CH=CH-, Y = NHBoc 74x, z = PMe(0)0", 02tBu
73ad, Z = PMe(0)OEI, L, = -CH=CH-CH2- , Y = NHBoc L = -CH=CH-CH2-, , Y = C
73ae, Z = PPh(0)OEt, L-, = -CH=CH-, Y = NHBoc 74y, z = PPh(0)0\ Li = -CH=CH-, Y = C02tBu
73af, z = PPh(0)OEt, L = -CH=CH-CH2 -, Y = NHBoc 742, z = PPh(0)0-, Li = -CH=CH-CH2- , Y = C02tBu
74aa, z = co2-, Li = -CH=CH-, Y = NHBoc
74ab, z = co2-, Li = -CH=CH-CH2- , Y = NHBoc
74ac, z = PMe(0)0-, Li = -CH=CH-, Y = = NHBOC
74ad, z = P e(0)0", u, = -CH=CH-CH2- , Y = = NHBoc
74ae, z = PPh(0)0", Li = -CH=CH-, Y = = NHBoc
74af, z = PPh(0)0-. Li = -CH=CH-CH2- ·, Y = NHBoc
Schéma 19
Les ligands sont hydrolysés et l'atome de lanthanide est introduit dans le macrocycle conduisant à série 74.
Figure imgf000026_0001
74a,
74b, NHBoc
74c, = NHBoc
74d, Y = NHBoc
74e, Y = NHBoc
74f, Y = NHBoc
74g, -(CH2)3-. Y = NHBOC
74h, Y = NHBoc
74i, -(CH2)3-. Y = NHBoc
74j, C02tBu
74k, Y = COjtBu
74I, -(CHîfe.. Y = C02tBu
74m, Y = C02tBu
74n, Y = C02tBu
74o, -<CH2)3-, Y = C02tBu
74p, Y = COjtBu
74q, Y = NHBoc
74r, = C02tBu
74s, Y = COjtBu
74t, Y = C02tBu
74u, Y = C02tBu
74v, Y = COjtBu
74w, = -CH Y = COjtBu
74x, L, = -CH=CH-CHr. Y = C02tBu
74y, Y = COjtBu
74Z, = -CH=CH-CH2 Y = COjtBu
74aa, Y = NHBoc
74ab, Y = NHBoc
74ac, = -CH=CH-, Y = NHBoc
74ad, L, = -CH=CH-CH2-, Y = NHBoc
74ae, -CH=CH-. Y = HBoc
74af,
Figure imgf000026_0002
Ll = -CH=CH-CHr, Y = NHBoc
Schéma 20
Les groupements hydrosolubilisants (E E5) sont ensuite introduits sur les deux chromophores (schéma 20). Ils sont de nature anionique, neutre ou cationique.
Figure imgf000027_0001
Schéma 21
Pour finir le groupement Boc ou ester de ierf-butyle est ensuite éliminé en présence d'acide trifluoroacétique pour conduire aux composés 76a-af (schéma 21).
5) Synthèse des complexes tri-antennes
Figure imgf000028_0001
77a, Z = C02Me 78a, Z = C02
77b, Z = PMe(0)OEt 78b, Z = PMe(O)0- 77c, Z = PPh(0)OEt 78c, Z = PPh(0)0'
Figure imgf000028_0002
Schéma 22
Les complexes tri-antennes ont été synthétisés selon le schéma réactionnel décrit dans le schéma 22. Sur le TACN mono substitué 1b sont condensées les différentes pyridines mésylées (63a-c). Les Iigands 77a-c obtenus sont hydrolysés en présence de lithine puis mis en contact avec les sels de lanthanide correspondant ce qui conduit soit aux complexes d'europium Eu-79a-c soit aux complexes de terbium Tb-79a-c. Après introduction des groupements hydrosolubilisants E^Es le groupement Boc est supprimé en présence d'acide trifluoroacétique ce qui conduit aux complexes Eu-81a-c et Tb-81a- Pour montrer l'efficacité des complexes de l'invention Eu-81a-E2, Tb-81a-E2l Tb-81a-E4, ces derniers ont été comparés à des complexes de l'art antérieur 82a et 82b comprenant des antennes triméthoxyphényipyridine. Les résultats des tests sont présentés dans la partie expérimentale.
Figure imgf000029_0001
Schéma 23
Figure imgf000030_0001
Schéma 24
Trois des complexes de l'invention ont été convertis en complexes fonctionnalisés NHS correspondant (schéma 24). Ces trois complexes sont utilisables pour marquer une protéine par exemple et plus particulièrement un anticorps. PARTIE EXPERIMENTALE
Abréviations utilisées :
AcOEt : acétate d'éthyle
AcOH : acide acétique
Boc : tert-butyloxycarbonyle
n-BuLi : n-butyllithium
CDCI3 : chloroforme deutéré
CHCI3 : chloroforme
CH(OEt)3 : orthoformiate d'éthyle
Cs2C03 : carbonate de césium
Cul : iodure de cuivre(l)
DCM/CH2CI2 : dichlorométhane
DIAD : azodicarboxylate de diisopropyle
DMF : diméthylformamide
DIPEA: diisopropyléthylamine
DMSO : diméthylsulfoxyde
Et : éthyle
ESI + : ionisation par électronébulisation en mode positif
EtOH : éthanol
h : heure
HATU : (0-(7-azabenzotriazol-1 -yl)-N,N,N',N'-tétraméthyluronium hexafluorophosphate) HNO3 : acide nitrique
HPLC : chromatographie liquide à haute performance
H20 : eau
H202 : eau oxygéné
H2S0 : acide sulfurique
j : jour
K2C03 : carbonate de potassium
Kl : iodure de potassium
K3P04 : phosphate de potassium
LC-MS : chromatographie liquide à haute performance couplée à la spectromètrie de masse
LiOH / Lithine: hydroxyde de lithium
LnCI3 : chlorure de lanthanide
m-CPBA : acide métachloroperbenzoïque
Me : m éthyle
MeCN : acétonitrile
Me2CO : acétone
MeOH : méthanol
min: minute Ms : mésyle
MsCI : chlorure de mésyle / chlorure de méthanesulfonyle
NaBH4 : borohydrure de sodium
NaH : hydrure de sodium
Pd/C : Palladium sur charbon
Pd(dba)2 : bis(dibenzylidèneacétone)palladium(0)
Pd(dppf)CI2 : bis(diphénylphosphino)ferrocène]dichloropalladium(ll)
Pd(OAc)2 : acétate de palladium(ll)
Pd(PPh3) : tetrakis(triphénylphosphine)palladium(0)
Ph: phényle
PhMe: toluène
PPh3 : triphénylphosphine
Pf: point de fusion
Py : pyridine
Rf : front de solvant
Rt : temps de rétention
TA : température ambiante
TEA/Et3N : triéthylamine
TFA : acide trifluoroacétique
THF : tétrahydrofurane
TBD SCI : chlorure de tert-butyldiméthylsilyle
Ts : tosyle
TSTU: tétrafluoroborate de 0-(N-Succinimidyl)-1 ,1 ,3,3-tétraméthyluronium
UPLC- S : chromatographie liquide à ultra haute performance couplée à la spectrométrie de masse Xphos : 2-dicyclohexylphosphino-2',4',6,-triisopropylbiphényle
Chromatographie
Les chromatographies liquides à haute performance (HPLC) analytiques et préparatives ont été effectuées sur deux appareils :
- HPLC Analytique : ThermoScientific, pompe quaternaire P4000, Détecteur UV 1000 à lampe au deutérium (190-350 nm), colonne analytique Waters XBridge C18, 3,5 Mm, 4,6 χ
100 mm.
HPLC Préparative : Shimadzu, 2 pompes LC-8A, détecteur UV à barrette de diodes Varian ProStar, colonne préparative Waters XBridge prép. C18, 5 μιτι: 19 x 100 mm ou 50 x 150 mm.
Les chromatographies liquides à Ultra-haute performance (UPLC) analytiques ont été réalisées sur un appareil Waters Acquity HCIass avec comme détecteur soit un détecteur UV à barette de diode de type PDA ou soit un détecteur de masse simple quadripolaire de type SQD2. La sonde utilisée est un électro-spray en mode positif : tension de capillaire à 3,2 KV - tension de cône à 30 V. Les chromatographies sur colonne de silice ont été réalisées sur gel de silice Merck 60 (0.040-0.063 mm). Les chromatographies sur colonne d'alumine ont été réalisées sur oxyde d'aluminium Sigma- Aldrich, neutre, activé, Brochmann I.
Spectroscopie
· Résonance Magnétique Nucléaire (RMN)
Les spectres RMN (1 H, 13C et 31P) ont été réalisés à l'aide d'un spectromètre Bruker Avance 400 MHz NanoBay (aimant de 9,4 Teslas), muni d'une sonde de mesure BBFO, multi noyaux de diamètre de 5 mm, de gradient Z et de lock 2H. Les déplacements chimiques (δ) sont exprimés en partie par million (ppm). Les abréviations suivantes sont utilisées :
s : singulet, s I : singulet large, s app : singulet apparent, d : doublet, t : triplet, q : quadruplet, m : multiplet, dd : doublet dédoublé, td : triplet dédoublé, qd : quadruplet dédoublé, ddd : doublet de doublet dédoublé, AB : système AB.
• Spectrométrie de masse (LRMS)
Les spectres de masse (LC-MS) ont été réalisés à l'aide d'un spectromètre Waters ZQ 2000 simple quadipôle à source multimode ESI/APCI équipé de colonne Waters XBridge C18, 3,5μηΊ, 4,6 χ 100 mm ou bien d'un spectre de masse simple quadripolaire de type SQD2.
• Spectrométrie de masse haute résolution (HRMS)
Les analyses ont été effectuées avec un spectromètre de masse QStar Elite (Applied Biosystems SCIEX) équipé d'une source d'ionisation à pression atmosphérique (API) assistée pneumatiquement. L'échantillon a été ionisé en mode electrospray positif dans les conditions suivantes : tension electrospray (ISV) : 5500 V ; tension d'orifice (OR) : 20 V ; pression du gaz de nébulisation (air) : 20 psi. Le spectre de masse haute résolution (HRMS) a été obtenu avec un analyseur temps de vol (TOF). La mesure de masse exacte a été effectuée en triple avec un double étalonnage interne. Gradient A
Colonne Waters Acquity C18, 300 Â, 1 ,7 Mm, 2,1 x 50 mm - A / eau 0,1 % acide formique B / acétonitrile 0,1 % acide formique t = 0 min 5 % B - t = 0,2 min 5 % B - t = 5 min 100 % B - 0,6 mL.min"1.
Gradient B
Colonne Waters Xbridge C18, 5 μιη, 50 x 150 mm - A / eau 25 mM TEAAc pH 7 B / acétonitrile t = 0 min 10 % B - t = 19 min 60 % B - 100 mL.min"1.
Gradient C
Colonne Waters Acquity C 8, 300 Â, 1 ,7 Mm, 2,1 x 50 mm - A / eau 5 mM acétate d'ammonium B / acétonitrile t = 0 min 5 % B - 1 = 0,2 min 5 % B - 1 = 5 min 100 % B - 0,6 mL.min'1.
Gradient D
Colonne Waters Xbridge Ci8, 5 Mm. 20 x 100 mm - A / eau 25 mM TEAAc pH 7 B / acétonitrile t = 0 min 5 % B - t = 19 min 60 % B - 20 mL.min"1.
Gradient E
Colonne Waters Xbridge C18, 5 Mm, 20 x 100 mm - A / eau 25 mM TEAAc pH 7 B / acétonitrile t = 0 min 2 % B - t = 19 min 40 % B - 20 mL.min"1. Gradient F
Colonne Waters Xbridge C18, 5 μιτι, 20 x 100 mm - A / eau 25 m TEAAc pH 6 B / acétonitrile t = 0 min 2 % B - t = 19 min 40 % B - 20 mLmin'1.
Gradient G
Colonne Waters Xbridge C,8, 5 μητι, 50 x 150 mm - A / eau 0,2% TFA B / acétonitrile t = 0 min 10 % B - t = 12 min 50 % B - 80 mLmin"1.
Gradient H
Colonne Waters Xbridge C18, 5 μηη, 50 x 150 mm - A / eau 0,2% TFA B / acétonitrile t = 0 min 30 % B - t = 20 min 100 % B - 80 mLmin"1.
Exemples
Composé 1 : le composé 1 a été préparé selon la procédure décrite dans les demandes WO 2013/01 1236 et WO 2014/1 1 1661.
Composés 14a-14c : les composés 14a-14c ont été préparés selon la procédure décrite dans les demandes WO 2013/01 1236 et WO 2014/1 1 1661 .
Composé 15a : dans un ballon de Schlenk de 100 mL le composé 14a (440 mg, 1 ,5 mmol) a été solubilisé dans du DMF anhydre (10 mL) pour donner une solution incolore. Au mélange réactionnel a été ajouté la tri(o-tolyl)phosphine (91 mg, 0,3 mmol), Pd(OAc)2 (33,7 mg, 0,15 mmol), la TEA (0,314 mL, 2,252 mmol) puis l'acrylate de méthyle (0,203 mL, 2,252 mmol) en une seule fois. La réaction a été agitée à 70 °C pendant 5 h. L'avancement de la réaction a été suivi par UPLC-MS (gradient A). Après cette période, la réaction était totale. Le mélange réactionnel a été concentré sous pression réduite, dilué dans AcOEt (50 mL), lavé avec de l'eau (2 x 50 mL) puis de l'eau saturée en NaCI (50 mL). La phase organique a été séchée sur MgS0 , filtrée et concentrée sous pression réduite. Le brut a été purifié par chromatographie sur colonne de silice en utilisant un gradient de solvant DCM/MeOH de 00/0 jusqu'à 99/1 pour conduire au composé 15a (233 mg, 62%) sous forme de poudre blanche. Pf = 156,4-156,9°C - HPLC gradient A - Rt = 2,03 min - [Μ+ΗΓ, m/z 251 ,9 - Rf = 0,41 (silice, dichlorométhane - méthanol 96 : 4 - HRMS (ESI+) calculée pour Ci2H14N05 + [M+H]+, m/z 252,0866 , trouvée : 252,0868 - RMN H (400 MHz, CDCI3) δ : 8,13 (s, 1 H, Py H5), 7.67 (d, J = 16.2 Hz, 1 H), 7,65 (s, 1 H, Py H3), 7,19 (dd, J = ; 16,2 Hz, 2 H, HC=CH), 6.71 (d, J = 16.2 Hz, 1 H), 4,91 (s, 2 H, CjHs-OH), 4,04 (s, 3 H, Py-COOMe), 3,85 (s, 3 H, COOMe), 3,49 (s I, 1 H, OH) ; RMN 13C (100 MHz, CDCI3) δ : 166,20 (COOMe), 165,24 (Py-COOMe), 161 ,59 (Py C2), 147,97 (Py-Ç_=C), 143,74 (Py C6), 140,92 (Py C4), 123,77 (Py C3), 122,08 (Py C5), 121 ,86 (Py-C=ÇJ, 64,68 (CH2-OH), 53,10 (Py- COsÇHa), 52,19 (CO2ÇH3).
Composés 15b-15f : ces composés ont été préparés selon la même procédure que celle utilisée pour la synthèse de 15a en utilisant les alcènes correspondants. Composé 16a : dans un ballon de 50 ml_ le composé 15a (233 mg, 0,927 mmol) a été solubilisé dans eOH (10 ml_) pour donner une solution incolore. Au mélange réactionnel a été ajouté le Pd/C 10% (23,69 mg, 0,022 mmol) en une seule fois. La réaction a été agitée à TA avec un barbotage de dihydrogène pendant 2 h. L'avancement de la réaction a été suivi par UPLC-MS (gradient A). Après cette période, la réaction était totale. Le mélange réactionnel a été filtré sur filtre nylon 22 μσι, évaporé à sec pour conduire au composé 16a (231 mg, 98%) sous forme de poudre blanche. Pf = 133,2- 136,4°C - HPLC gradient A - Rt = 1 ,86 min - [M+H]+, m/z 253,2 - HRMS (ESI+) calculée pour C12H16N<V [M+H]+, m/z 254,1023 , trouvée : 254,1024 - RMN 1H (400 MHz, CDCI3) δ : 7,9 (s, 1 H, Py H5), 7,41 (s, 1 H, Py H3), 4,85 (s, 2 H, CH^-OH), 4,01 (s, 3 H, Py-COOMe), 3,69 (s, 3 H, COOMe), 3,05 (t, J = 7,6 Hz, 2 H, Py-ÇJ±.-CH2), 2,71 (t, J = 7,6 Hz, 2 H, Py-CH,-CH£) ; RMN 3C (100 MHz, CDCI3) δ : 172,41 (COOMe), 165,65 (Py-COOMe), 160,49 (Py C2), 151 ,67 (Py C4), 147,22 (Py C6), 140,92 (Py C3), 123,96 (Py C3), 123,9 (Py C5), 64,62 (CH2-OH), 52,91 (Py-COaÇHg), 51 ,91 (CO^Ha), 33,97 (Py-CH Çty, 30,07 (Py-CH2-CH,). Composés 16b-16f : ces composés ont été préparés selon la même procédure que celle utilisée pour la synthèse de 16a.
Composé 17a : dans un ballon de 100 mL le composé 16a (231 mg, 0,912 mmol) a été solubilisé dans du THF anhydre (30 mL) pour donner une solution incolore. Au mélange réactionnel placé dans un bain de glace a été ajouté la TEA (0,127 mL, 0,912 mmol) puis MsCI (72 [il, 0,912 mmol) en une seule fois. Le mélange a été réchauffé à TA et agité pendant 15 min. L'avancement de la réaction a été suivi par UPLC-MS (gradient A). Après cette période, la réaction était totale. Le mélange réactionnel a été concentré sous pression réduite, dilué dans du DCM (50 mL), lavé avec de l'eau (2 x 25 mL) puis de l'eau saturée en NaCI (20 mL). La phase organique a été séchée sur MgS04, filtrée et concentrée sous pression réduite pour conduire au composé 17a (249 mg, 82%) sous forme de poudre blanche. HPLC gradient A - Rt = 3,2 min - [M+H]\ m/z 332,3 - Rf = 0,23 (silice, dichlorométhane - méthanol 98 : 2 - HRMS (ESI+) calculée pour C,3HieN07S+ [M+H]\ m/z 332,0799, trouvée : 332,0799 - RMN Ή (400 MHz, CDCI3) δ : 7,98 (s, 1 H, Py H5), 7,54 (s, 1 H, Py H3), 5,41 (s, 2 H, Chk-OMs), 4,00 (s, 3 H, Py-COOMe), 3,69 (s, 3 H, COOMe), 3,16 (s, 3 H, OMs), 3,07 (t, J = 7,5 Hz, 2 H, Py-ÇHg-CH2), 2,72 (t, J = 7,5 Hz, 2 H, Py-CH,-CH2) ; RMN 13C (100 MHz, CDCI3) δ : 172,23 (COOMe), 165,27 (Py-COOMe), 154,56 (Py C2), 152,46(Py C4), 147,93 (Py C6), 125,19 (Py C3), 125,03 (Py C5), 70,97 (CHrQMs). 53,08 (Py-COaQHa), 51 ,94 (COsÇHa), 38,05 (CH,-OSO,CH,). 33,87 (Py-CH2-Ç_H2) , 30,07 (Pv-CHg-CH,). Composés 17b-17f : ces composés ont été préparés selon la même procédure que celle utilisée pour la synthèse de 16a.
Composés 18a-18f : ces composés ont été préparés selon la même procédure que celle utilisée pour la synthèse de 17a. Composés 19a-19f : ces composés ont été préparés selon la même procédure que celle utilisée pour la synthèse de 15a.
Composés 20a-20f : ces composés ont été préparés selon la même procédure que celle utilisée pour la synthèse de 16a.
Composés 21a-21f : ces composés ont été préparés selon la même procédure que celle utilisée pour la synthèse de 17a.
Composés 22a-22f : ces composés ont été préparés selon la même procédure que celle utilisée pour la synthèse de 1 a.
Composés 23a-23f : ces composés ont été préparés selon la même procédure que celle utilisée pour la synthèse de 15a en utilisant les alcènes correspondants.
Composés 24a-24f : ces composés ont été préparés selon la même procédure que celle utilisée pour la synthèse de 16a.
Composés 25a-25f : ces composés ont été préparés selon la même procédure que celle utilisée pour la synthèse de 17a.
Composés 26a-26f : ces composés ont été préparés selon la même procédure que celle utilisée pour la synthèse de 17a.
Composé 27a-c : les composés 27a-c ont été préparés selon la procédure décrite dans l'article : Tetrahedron Letters 2010, 51 , 4445.
Composés 28a-28c : ces composés ont été préparés selon la même procédure que celle utilisée pour la synthèse de 17a.
Composé 29 : ce composé est disponible commercialement.
Composé 30 : le composé 30 a été préparé selon la procédure décrite dans l'article : Dalton Transactions 2010, 39, 707.
Composés 31a-31c : les composés 31a-31c ont été préparés selon la procédure décrite dans l'article : Organic Biomolecular Chemistry 2012, 10, 9183.
Composés 32a-32c : les composés 32a-32c ont été préparés selon la procédure décrite dans l'article : Journal of Organic Chemistry 2010, 75, 7175. Composés 33a-33c : les composés 33a-33c ont été préparés selon la procédure décrite dans l'article : Journal of Organic Chemistry 2010, 75, 7175.
Composé 34 : ce composé est disponible commercialement.
Composé 35 : le composé 35 a été préparé selon la procédure décrite dans l'article : Bioorganic Chemistry 2014, 57, 148.
Composé 36 : le composé 36 a été préparé selon la procédure décrite dans l'article : Carbohydrate Research 2013, 372, 35.
Composé 37 : le composé 37 a été préparé selon la procédure décrite dans la demande WO 2014/111661.
Composé 38 : le composé a été préparé selon la même procédure que celle utilisée pour la synthèse de 17a.
Composé 39 : disponible commercialement.
Composé 40 : le composé 40 a été préparé selon la procédure décrite dans l'article : Bioorganic Chemistry 2014, 57, 148.
Composé 41a-b : les composés 41a-b ont été préparés selon la procédure décrite dans la demande WO 2014/1 11661 en utilisant le catalyseur correspondant.
Composé 42a-b : les composés 42a-b ont été préparés selon la même procédure que celle utilisée pour la synthèse de 36.
Composé 43a-b : les composés 43a-b ont été préparés selon la même procédure que celle utilisée pour la synthèse de 37.
Composé 44a-b : les composés 44a-b ont été préparés selon la même procédure que celle utilisée pour la synthèse de 17a.
Composé 45 : ce composé est disponible commercialement.
Composé 46 : le composé 46 a été préparé selon la procédure décrite dans l'article : Chemistry - A Européen Journal, 2014, 20, 3610. Composé 47 : le composé 46 (0,313 g, 2,04 mmol) a été dissous dans H2S0 (1 1 mL) à TA puis la solution a été refroidie dans un bain de glace. A ce mélange a été ajouté goutte à goutte HN03 (9,7 mL) et la solution a été chauffée à 100 °C pendant 2 j. Le mélange a été refroidi à TA puis versé dans de la glace pilée (100 g). Après 1 h, la phase aqueuse a été extraite avec du CH2CI2 (3 x 50 mL), les phases organiques ont été regroupées, séchées sur gS04 et le produit brut a été purifié par chromatographie sur colonne de silice en utilisant un mélange de solvant {CH2CI2-AcOH, 98/2) pour conduire à un solide blanc (224 mg, 56%). R, (CH2CI2/AcOH, 98/2) = 0.38; Pf: 147 °C; RMN 1H (400 MHz, CDCI3, δ): 16.49 (s, 1 H, COOH), 9.08 (s, 1 H, H3), 8.36 (s, 1 H, H5), 2.75 (s, 3H, py-CH3); RMN 13C (101 MHz, CDCI3, δ): 159.4 (COOH), 152.4 (C6), 144.4 (C4), 138.7 (C2), 123.1 (C5), 121.7 (C3), 18.4 (py-CH3); MS Calculée pour C7H7N205 199,036. Trouvée 199,035 [M+H]+.
Composé 48: le composé 47 (2,9, 14,7 mmol) a été dissous dans du MeOH anhydre (3 mL) à TA. A cette solution a été ajouté H2S0 (200 μί) goutte à goutte et la solution a été chauffée à 65°C pendant 3 j. La solution a été refroidie à TA et le solvant a été éliminé sous pression réduite. Au résidu a été ajoutée H20 (30 mL) et la solution a été extraite avec AcOEt (3 x 20 mL). Les phases organiques ont été réunies, lavée avec une solution de bicarbonate de sodium à 5% (2 x 20 mL), puis avec une solution de saumure saturée (20 mL). Après séchage sur MgS04, le solvant a été filtré, éliminé sous pression réduite pour conduire au composé 48 qui a été utilisée dans la suite de la synthèse sans purification supplémentaire (57 mg, 76%). RMN 1H (400 MHz, CDCI3, δ): 8.33 (d, 1 H, J 3.1 , H5), 8.19 (d, 1 H, J 3.1 , H3), 4.02 (s, 3H, CH3CO), 2.57 (s, 3H, py-CH3); RMN 13C (100 MHz, CDCI3, δ): 160.8 (COOMe), 152.7 (C6), 142.1 (C4), 140.5 (C2), 121.4 (C5), 119.3 (C3), 53.8 (OCH3), 18.3 (py-CH3); MS Calculée C8H9N2052 3,051 . Trouvée 213,050 [M+H]+.
Composé 49 : à une solution de composé 48 (1 14 mg, 0,54 mmol) dans du CHCI3 (10 mL) a été ajouté à TA de l'anhydride trifluoroacétique (1 ,48 mL, 10,8 mmol). Le mélange a été chauffé à 60°C pendant 5 h sous atmosphère inerte. Après cette période, la réaction a été refroidie à TA puis le solvant a été éliminé sous pression réduite. A l'huile jaune ont été ajoutés du EtOH (3 mL) et H20 (3 mL) et la solution a été agitée à TA pendant 2 h. Les solvants ont été éliminés sous pression réduite et la phase aqueuse a été extraite avec du CH2CI2 (3 x 30 mL). Les phases organiques ont été réunies, séchées sur MgS04 et évaporées sous pression réduite . Le résidu a été purifié par chromatographie sur colonne de silice en utilisant un gradient de solvant Hexane/AcOEt, 70/30 to 50/50 pour conduire au composé 49 (74 mg, 65%). R, (CHgCla/MeOH, 95/5) = 0.67; RMN 1H (400 MHz, CDCI3, δ): 8.68 (d, 1 H, 4J 2.1 , H3), 8.37 (d, 1 H, 4J 2.1 , H5), 5.06 (s, 2H, CH2OH), 4.06 (s, 3H, CH3CO); RMN 13C (100 MHz, CDCI3, δ): 164.3 (COOMe), 163.6 (C6), 155.3 (C4), 149.7 (C2), 1 16.4 (C5), 1 16.3 (C3), 64.5 (CH2OH), 29.5 (C02CH3).
Composé 50a : à une solution de composé 49 (21 ,6 mg, 0,102 mmol) dans du DMF anhydre (1 mL) ont été ajoutés du NaH (17 mg, 0.708 mmol) et du thioglycolate d'éthyle (35 pL, 0.320 mmol) sous atmosphère inerte et à TA. Le mélange a été agité à TA pendant 2 h sous atmosphère inerte. Le solvant a été ensuite éliminé sous pression réduite et à l'huile jaune ont été ajoutés du MeOH (5 mL) et H2S0 (200 μΙ_). La solution a été chauffée à 65°C pendant 72 h sous argon. Le solvant a été éliminé sous pression réduite et au résidu a été ajoutée H20 (10 mL) et la solution aqueuse a été extraite avec AcOEt (3 x 20 mL). Les phases organiques ont été rassemblées et séchées sur MgS04l filtrées et concentrées sous pression réduite. Le résidu a été purifié par chromatographie sur colonne de silice en utilisant comme éluant CH2CI2-MeOH, 98/2 pour conduire au composé 50a (8.2 mg, 25%). R, (DCM/MeOH, 95/5) = 0.35; R N H (400 MHz, CDCI3, δ): 7.88 (d, 1 H, J 1.9, H5), 7.63 (d, 1 H, 4J 1.9, H3), 4.69 (s, 2H, CH2OH), 4.02 (s, 2H, Ç_H2S), 3.96 (s, 3H, CH3CO), 3.76 (s, 3H, CH3CO); RMN 13C (100 MHz, CDCI3, δ): 170.7 (COOMe) , 166.4 (COOMe), 163.3 (C2), 152.3 (C4), 147.8 (C6), 121.2 (C5), 121 .1 (C3), 65.1 (CH2OH), 53.3 (CO2ÇH3), 48.5 (CO;>ÇH3), 33.6 (SÇ_H2).
Composé 50b : le composé 50b a été préparé selon la même procédure que celle utilisée pour la synthèse de 50a.
Composé 51a : à une solution de composé 50a (8,2 mg, 0,03 mmol) dans du THF anhydre (2 mL) ont été ajoutés de la TEA (12,5 pL, 0,09 mmol) et du MsCI (3,5 pL, 0,045 mmol). Cette solution a été agitée à TA pendant 3,5 h. Après cette période, le solvant a été éliminé sous pression réduite et le résidu a été dissous dans du CH2CI2 (20 mL). La phase organique a été lavée avec H20 (3 x 10 mL), séchée sur MgS04, filtrée et le solvant a été éliminé sous pression réduite pour conduire de façon quantitative au composé 51a. R, (DCM/MeOH, 95/5) = 0.8; ; RMN 1H (400 MHz, CDCI3, δ): 7.95 (d, 1 H, 4J 1 .5, H5), 7.52 (d, 1 H, 4J 1 .5, H3), 5.35 (s, 2H, CjiOMs), 3.98 (s, 2H, CH2S), 3.82 (s, 2H, COCH3), 3.77 (s, 2H, COCH3), 3.14 (s, 3H, SCH3).
Composé 51 b : le composé 51 b a été préparé selon la même procédure que celle utilisée pour la synthèse de 51 a.
Composés 52a-b : les composés 52a-b ont été préparés selon les mêmes procédures que celle utilisées respectivement pour la synthèse de 14b et 14c.
Composés 53a-b : les composés 53a-b ont été préparés selon la même procédure que celle utilisée pour la synthèse de 46.
Composés 54a-b : les composés 54a-b ont été préparés selon la même procédure que celle utilisée pour la synthèse de 49. Composés 55a-d : les composés 55a-d ont été préparés selon la même procédure que celle utilisée pour la synthèse de 50a.
Composés 56a-d : les composés 56a-d ont été préparés selon la même procédure que celle utilisée pour la synthèse de 51 a. Composé 57 : ce composé est disponible commercialement.
Composé 58 : à une solution de 3,5-diméthoxyphénol (10 g, 62.9 mmol) dans du DMF anhydre (145 mL) ont été additionnés de l'imidazole (6,49 g, 94,4 mmol) puis du TBD SCI (9,78 g, 62,9 mmol). Le mélange réactionnel a été agité pendant une nuit à TA. A cette solution a été ajoutée H20 (50 mL) puis la solution a été extraite avec AcOEt (2 x 30 mL). Les phases organiques ont été réunies, lavées avec une solution de saumure (20 mL), séchées sur gS04, filtrée et concentrées sous pression réduite. Le produit brut a été purifié par chromatographie sur colonne de silice en utilisant un gradient de solvant Cyclohexane-AcOEt de 0/90 - 85/15 par incrément de 5% pour conduire au composé 58 (15.8 g, 94%) sous forme d'huile incolore. HPLC - Rt = 4,19 min - [M+H]+, m/z 270,3 - RMN H (300 MHz, CDCI3) δ : 6,11 (s, 1 H, para), 6,03 (s, 2 H, ortho), 3,75 (s, 6 H, OMe), 0,98 (s, 9 H, Si-tert-Bu), 0,21 (s, 6 H, Si-Me)
Composé 59 : à une solution de composé 58 (15,8 g, 58,9 mmol) dans du THF anhydre (130 mL) a été ajouté goutte à goutte à -78°C du n-BuLi 2,5 M dans l'hexane (26,3 mL, 65,8 mmol) sous argon. Le mélange réactionnel a été agité à TA pendant 5 h puis refroidi à -78°C. A cette solution a été ajouté goutte à goutte une solution de 2-iso-propoxy-4,4,5,5-tétraméthyl-1 ,3,2-dioxaborolane (14,4 mL, 70,6 mmol) dans du THF anhydre (32 mL). Le mélange réactionnel a été agité à TA pendant 3 h puis a été versé dans un mélange glace pilée-H20 (400 mL). La phase aqueuse a été extraite avec AcOEt (2 x 50 mL). Les phases organiques ont été réunies, lavées avec une solution de saumure (20 mL), séchées sur MgS04, filtrée et concentrées sous pression réduite. Au résidu a été ajouté du eOH (9 mL) et la solution a été refroidie à 4°C pendant une nuit. Après cette période, un solide blanc a cristallisé. Les cristaux ont été collectés par filtration et séchés pour conduire au composé 59 (8.91 g, 38%) sous forme de solide blanc. HPLC - Rt = 3,80 min - [ +H]+, m/z 395,3 - RMN 1H (300 MHz, CDCI3) δ : 5,97 (s, 2 H, ortho), 3,7 (s, 6 H, OMe), 1 ,36 (s, 12 H, B(O-C-diMe)), 0,96 (s, 9 H, Si-tert- Bu), 0,17 (s, 6 H, Si-Me) ; RMN 13C (300 MHz, CDCI3) δ : 164,6; 159,4; 96,8; 83,8; 55,9; 26,1 ; 25,0;18,6, -4,0;
Composés 60a et 61a : dans un ballon de Schlenk de 50 mL le composé 14a (440 mg, 1 ,5 mmol) a été solubilisé dans un mélange d'acétone (2 mL) et H20 (2,5 mL) pour donner une solution incolore.
Au mélange réactionnel ont été ajoutés le composé 59 (710 mg, 1 ,8 mmol), du K2C03 (518 mg, 3,75 mmol), et du Pd(dba)2 (1 ,725 mg, 3,00 Mmol) en solution dans de l'acétone (0,5 mL) en une seule fois.
Le mélange réactionnel a été agité à 65°C pendant 4 h. L'avancement de la réaction a été suivi par
UPLC-MS (Gradient A). Après cette période, la réaction était totale, contenant un mélange des composés 60a et 61a. Le mélange réactionnel a été concentré sous pression réduite et a été utilisé dans la suite de la synthèse sans purification supplémentaire. HPLC gradient A - Rt = 1 ,44 min -
[M+H]+, m/z 304,6
Composé 61a : dans un ballon de 250 mL le mélange de composés 60a et 61a (458 mg, 1 ,5 mmol) a été solubilisé dans du MeOH (100 mL) pour donner une solution jaune. Au mélange réactionnel a été ajouté H2S04 (0,416 mL, 4,50 mmol) en une seule fois. La réaction a été agitée à reflux pendant 7 j. L'avancement de la réaction a été suivi par UPLC-MS (gradient A). Après cette période, la réaction était partielle (90%). Le mélange réactionnel a été concentré sous pression réduite puis a été directement purifié par HPLC préparative (gradient G) pour conduire au composé 61a (385 mg, 1 ,21 mmol, 80%) sous forme de poudre jaune. Pf = 169,7-174,1 °C - HPLC gradient A - Rt = 2,07 min - [M+H]+, m/z 320,3 - HRMS (ESI+) calculée pour C16H18N06 + [M+H]+, m/z 320,1129 , trouvée : 320,1127 - RMN 1H (400 MHz, MeOD4) δ : 8,22 (s, 1 H, Py H3), 8,02 (s, 1 H, Py H5), 6,25 (s, 2 H, ortho), 4,89 (s, 2 H, Pv-CH£-OH), 4,05 (s, 3 H, Py-COOMe), 3,77 (s, 6 H, OMe) ; RMN 13C (100 MHz, MeOD4) δ : 162,95; 161 ,64 ; 158,75 ; 158,68 ; 150,91 ; 141 ,38 ; 127,81 ; 127,22 ; 105,67 ; 91 ,95 ; 61 ,70 ; 54,89 ; 52,54.
Composé 62a : dans un ballon de 250 mL le composé 61a (354 mg, 1 ,11 mmol) a été solubilisé dans du MeCN anhydre (100 mL) pour donner une solution jaune. Au mélange réactionnel a été ajouté du K2C03 (460 mg, 3,33 mmol), du Kl (27,6 mg, 0,166 mmol) puis le bromoacétate de méthyle (0,162 mL, 1 ,66 mmol) en une seule fois. La réaction a été agitée à 65°C pendant 1 nuit. L'avancement de la réaction a été suivi par UPLC-MS (gradient A). Après cette période, la réaction était totale. Le mélange réactionnel a été concentré sous pression réduite, dilué dans du DCM (50 mL) puis filtré et enfin purifié par chromatographie sur colonne de silice en utilisant AcOEt comme éluant pour conduire au composé 62a (261 mg, 60 %) sous forme de poudre blanche. Pf = 151 , 1 -154, 4°C - HPLC gradient A - Rt = 2,58 min - [M+H]+, m/z 393,1 - Rf = 0,36 (silice, acétate d'éthyle) - HRMS (ESI+) calculée pour C19H22N08 + [M+H]\ m/z 392,1340 , trouvée : 392,1340 - RMN 1H (400 MHz, CDCI3) δ : 8,03 (s, 1 H, Py H3), 7,48 (s, 1 H, Py H5), 6,24 (s, 2 H, ortho), 4,87 (s, 2 H, Py-CHrOH). 4,71 (s, 2 H, Q-CHr COOMe), 3,99 (s, 3 H, Py-COOMe), 3,86 (s, 3 H, 0-CH9-C00Me). 3,73 (s, 6 H, OMe) ; RMN 13C (100 MHz, CDCI3) δ : 169,03 ; 166,03 ; 159,85 ; 159,18 ; 158,20 ; 146,32 ; 144,61 ; 127,05 ; 126,72 ; 109,65 ; 91 ,48 ; 65,38 ; 64,71 ; 55,89 ; 52,73 ; 52,46.
Composé 63a : dans un ballon de 100 mL le composé 62a (224 mg, 0,572 mmol) a été solubilisé dans du THF anhydre (30 mL) pour donner une solution incolore. Le mélange réactionnel a été placé dans un bain de glace puis du MsCI (45 μί, 0,572 mmol) a été ajouté en une seule fois. En fin d'addition le bain de glace a été retiré et la réaction a été agitée pendant 15 min. L'avancement de la réaction a été suivi par UPLC-MS (gradient A). Après cette période, la réaction était totale. Le mélange réactionnel a été concentré sous pression réduite, dilué dans du DCM (50 mL) et lavé avec de l'eau (2 x 40 mL). La phase organique a été séchée sur MgS04, filtrée et évaporée à sec au rotavapor. Le brut a été purifié par chromatographie sur colonne de silice en utilisant un gradient de solvant DCM/MeOH de 100/0 jusqu'à 95/5 pour conduire au composé 63a (264 mg, 98%) sous forme de poudre blanche. Pf = 141 ,7-144,1 °C - HPLC gradient A - Rt = 2,96 min - [M+H]+, m/z 470,6 - Rf = 0,48 (silice, dichlorométhane - méthanol 96 : 4) - HRMS (ESI+) calculée pour C2oH24 OioS+ [M+H]+, m/z 470,11 15 , trouvée : 470,11 13 - RMN 1H (400 MHz, CDCI3) δ : 8,13 (s, 1 H, Py H3), 7,67 (s, 1 H, Py H5), 6,24 (s, 2 H, ortho), 5,46 (s, 2 H, Pv-CH OH . 4,72 (s, 2 H, Q-CH2-COQMe). 4,00 (s, 3 H, Py- COOMe), 3,86 (s, 3 H, 0-CH2-COOjyJe), 3,73 (s, 6 H, OMe), 3,14 (s, 3 H, OMs) ; RMN 3C (100 MHz, CDCI3) δ : 168,98 ; 165,73 ; 160,09 ; 158,20 ; 153,24 ; 147,15 ; 145,30 ; 128,25 ; 128,10 ; 109,08 ; 91 ,49 ; 71 ,66 ; 65,37 ; 55,90 ; 52,94 ; 52,48 ; 38,17.
Composé 77a : dans un ballon de Schlenk de 50 ml_ le composé 1b (41 mg, 0,159 mmol) a été solubilisé dans du THF anhydre (5 ml_) pour donner une solution incolore. Au mélange réactionnel ont été ajoutés le composé 63a (223 mg, 0,476 mmol) en solution dans du eCN anhydre (10 mL) puis du K2C03 (88 mg, 0,635 mmol) en une seule fois. La réaction a été agitée à 85°C pendant 1 nuit. L'avancement de la réaction a été suivi par UPLC- S (gradient A). Après cette période, la réaction était totale. Le mélange réactionnel a été directement purifié par HPLC préparative (gradient H) pour conduire au composé 77a (106 mg, 48%) sous forme de poudre blanche. HPLC gradient A - Rt = 3,64 min - [ +H]+, m/z 1379,9 - HRMS (ESI+) calculée pour C2oHa4N010S+ [M+2H]2+, m/z 689,7843 , trouvée : 689,7842.
Composé Eu-79a : dans un ballon de 50 mL le composé 77a (53 mg, 38,5 μπιοΙ) a été solubilisé dans du MeCN (1 mL) et de l'eau (5 mL) pour donner une solution incolore. Au mélange réactionnel a été ajouté LiOH (0,941 mg, 38,5 μιηοΙ) en une seule fois. La réaction a été agitée à température ambiante pendant 30 min. L'avancement de la réaction a été suivi par UPLC-MS (gradient A). Après cette période, la déprotection était totale (composé 78a). Le pH du mélange réactionnel a été ajusté à 7 avec HC1 1 M. Au mélange réactionnel a été ajouté du chlorure d'europium hexahydrate (21 mg, 57,8 μητιοΙ) en une seule fois. La réaction a été agitée à TA pendant 1 nuit, après cette période la réaction était totale. Le mélange réactionnel a été directement purifié par HPLC préparative (gradient D) pour conduire au composé 79a (49 mg, 88%) sous forme de poudre blanche. HPLC gradient A - Rt = 2,63 min - [M-2H]\ m/z 1445,4 - HRMS (ESI+) calculée pour C63H70N7OZ3Eu2+ [M-H]2+, m/z 722,6868 , trouvée : 722,6868.
Composé Eu-80a-E2 : dans un ballon de 25 mL le composé 79a (49 mg, 34 μητιοΙ) a été solubilisé dans du DMSO anhydre (1 ,5 mL) pour donner une solution incolore. Au mélange réactionnel ont été ajoutés de l'acide 3-amino-1-propanesulfonique (29 mg, 204 μπιοΙ), de la DIPEA (36 μί, 204 μηηοΙ) puis du HATU (53 mg, 136 μιτιοΙ) en une seule fois. La réaction a été agitée à TA pendant 15 min. L'avancement de la réaction a été suivi par UPLC-MS (gradient C). Après cette période, la réaction était totale. Le mélange réactionnel a été directement purifié par HPLC préparative (gradient D) pour conduire au composé Eu-80a-E2 (19 mg, 10,2 μιηοΙ, 30%) sous forme de poudre blanche. HPLC gradient C - Rt = 1 ,92 min - [M-2Hf, m/z 1808,4 - HRMS (ESI+) calculée pour ΰ72Η91Ν10Ο2933Ευ2+ [M-H]2+, m/z 904,2162 , trouvée : 904,2166.
Composé Eu-81a-E2 : dans un ballon de 25 mL le composé Eu-80a-E2 (18,32 mg, 10,14 μητιοΙ) a été solubilisé dans du TFA (400 μί) pour donner une solution jaune. La réaction a été agitée à TA pendant 30 min. L'avancement de la réaction a été suivi par UPLC-MS (gradient C). Après cette période, la réaction était totale. Le mélange réactionnel a été évaporé au rotavapor puis purifié par HPLC préparative (gradient E) pour conduire au composé Eu-81a-E2 (7,89 μπηοΙ, 78%) sous forme de poudre blanche. HPLC gradient C - Rt = 1 ,48 min - [M-2H]+, m/z 1709 - HRMS (ESI+) calculée pour C67He3N10O27S3Eu2+ [M-H]2+, m/z 854,1899 , trouvée : 854,1906.
Composé Tb-79a : dans un ballon de 50 mL le composé 77a (53 mg, 38,5 pmol) a été solubilisé dans du MeCN (1 mL) et de l'eau (5 mL) pour donner une solution incolore. Au mélange réactionnel a été ajouté LiOH (0,941 mg, 38,5 μιτιοΙ) en une seule fois. La réaction a été agitée à TA pendant 30 min. L'avancement de la réaction a été suivi par UPLC-MS (gradient A). Après cette période, la déprotection était totale (composé 78a). Le pH du mélange réactionnel a été ajusté à 7 avec du HCI 1 M. Au mélange réactionnel a été ajouté le chlorure de terbium hexahydrate (22 mg, 57,8 pmol) en une seule fois. La réaction a été agitée à TA pendant 1 nuit, après cette période la réaction était totale. Le mélange réactionnel a été directement purifié par HPLC préparative (gradient D) pour conduire au composé Tb-79a (19 mg, 12,8 pmol, 33%) sous forme de poudre blanche. HPLC gradient A - Rt = 2,63 min - [M-2H]+, m/z 1451 ,7 - HRMS (ESI+) calculée pour C63H7oN7023Tb2+ [M-H]2\ m/z 725,6883 , trouvée : 725,6887.
Composé Tb-80a-E2 : dans un ballon de 25 mL le composé Tb-79a (9,3 mg, 6,4 pmol) a été solubilisé dans du DMSO anhydre (1 mL) pour donner une solution incolore. Au mélange réactionnel ont été ajoutés de l'acide 3-amino-1 -propanesulfonique (5,5 mg, 38,4 pmol), de la DIPEA (4,5 pL, 25,6 pmol) puis du HATU (10 mg, 25,6 pmol) en une seule fois. La réaction a été agitée à TA pendant 15 min. L'avancement de la réaction a été suivi par UPLC-MS (gradient C), après cette période, la réaction était totale. Le mélange réactionnel a été directement purifié par HPLC préparative (gradient D) pour conduire au composé Tb-80a-E2 (7,8 mg, 4,3 μιτιοΙ, 67%) sous forme de poudre blanche. HPLC gradient C - Rt = 1 ,89 min - [M-2H]\ m/z 1815,9 - HRMS (ESI+) calculée pour C72H91N10O29S3T 2+ [M-H] +, m/z 907,2179 , trouvée : 907,2167.
Composé Tb-80a-E4 : dans un ballon de 25 mL le composé Tb-79a (9,3 mg, 6,4 pmol) a été solubilisé dans du DMSO anhydre (1 mL) pour donner une solution incolore. Au mélange réactionnel ont été ajoutés de la 2-N,N,N-triméthylammonium-éthylamine (3,96 mg, 38,4 pmol), de la DIPEA (4,5 pL, 25,6 pmol) puis du HATU (10 mg, 25,6 pmol) en une seule fois. La réaction a été agitée à TA pendant 15 min. L'avancement de la réaction a été suivi par UPLC-MS (gradient C). Après cette période, la réaction était totale. Le mélange réactionnel a été directement purifié par HPLC préparative (gradient D) pour conduire au composé Tb-80a-E4 (6,1 mg, 3,6 pmol, 56%) sous forme de poudre blanche. HPLC gradient C - Rt = 2,00 min - [M]3+, m/z 569,3 - HRMS (ESI+) calculée pour C78H108N13O20Tb4t [M-2H]4+, m/z 426,4266 , trouvée : 426,4265.
Composé Tb-81a-E2 : dans un ballon de 25 mL le composé Tb-80a-E2 (7,8 mg, 4,3 pmol) a été solubilisé dans du TFA (500 pL) pour donner une solution jaune. La réaction a été agitée à TA pendant 30 min. L'avancement de la réaction a été suivi par UPLC-MS (gradient C). Après cette période, la réaction était totale. Le mélange réactionnel a été évaporé au rotavapor puis purifié par HPLC préparative (gradient E) pour conduire au composé Tb-81a-E2 (2,78 pmol, 64%) sous forme de poudre blanche. HPLC gradient C - Rt = 1 ,45 min - (M-2H]\ m/z 1715,3 - H RM S (ESi+) calculée pour
Figure imgf000044_0001
m/z 857, 917 , trouvée : 857,1905.
Composé Tb-81a-E4 : dans un ballon de 25 mL le composé Tb-80a-E4 {6,1 mg, 3,6 prnol) a été solubilisé dans du TFA (200 μί_) pour donner une solution jaune. La réaction a été agitée à TA pendant 30 min. L'avancement de la réaction a été suivi par UPLC- S (gradient C). Après cette période, la réaction était totale. Le mélange réaction nel a été évaporé au rotavapor puis purifié par HPLC préparative (gradient E] pour conduire au composé Tb-8 a-E (2,2 pmol, 62%) sous forme de poudre blanche, HPLC gradient C - Rt = 1 ,57 min - [Mf , m/z 535,9 - HRMS (ESIt) calculée pour C?3H,ea 130 3T ' [ -2H \ m/ 401 ,4135 , trouvée : 401 ,4125.
Le spectre UV, le chromatogramme et le spectre de masse du complexe Eu-81a-E2 sont représentés sur (es figures 1 à 3. Le spectre UV, le chromatogramme et le spectre de masse du complexe Tb-81a- E2 sont représentés sur les figures 4 à 8. Le spectre UV, le chromatogramme et le spectre de masse du complexeTb-81a*E sont représentés sur les figures 7 à 9.
Les propriétés des complexes Eu-81a-E2, Tb81a-E4 et Tb-81a-E2, et complexes correspondants aux structures 82a et 82b. décrits dans la demande WO 2005/058877, ont été déterminées, Les propriétés photo-physiques des complexes 82a et Eu-8 a~E2 sont comparables, En revanche le complexe £u- 8 a-E2 est très soluble dans l'eau alors que le complexe 8.2a présente une très mauvaise solubilité {voir ci-après). En ce qui concerne les complexes de terbîum, les propriétés photo-physiques des complexes 82b et TbS a-E4 et Tb-8 a-E2 sont comparables bien qu'il y ait de petites différences en ce qui concerne l'intensité et la répartition des raies du spectre d'émission. Cependant les complexes Tb81a-E4 et Tb~81a-E2 sont très soîubles dans l'eau comparés au complexe de l'art antérieur 82b (voir ci-après).
La solubilité des différents complexes a été déterminée comme suit, Pour chaque complexe, trois solutions équirnoiaires de complexe d'europium ont été préparées dans du méthanoi, te solvant a été éliminé sous pression réduite et le solide restant a été dissous et agité pendant 2 min dans un mélange eau/octanoi (2 :1 , 1 :1 , 1 :2), (0,9 mL). Après équilibration, un spectre d'émission de chaque phase a été enregistré dans du méthanoi (50 pL de solution dans 1 mL de méthanoi). Pour chaque mélange, la valeur du LogP a été calculée en utilisant l'équation suivante :
LogP = Log [C(octanol)/G(eau)] dans laquelle C(octanol) et C(eau) représentent respectivement la concentration du complexe testé dans i'octanol et dans l'eau,
Pour les complexes d'europium la bande Δϋ = 2 (605 - 635 nm) a été utilisée dans les calculs alors que pour Ses complexes de terbium, la bande AJ ~ 5 (520 - 565 nm) a été choisie. Les résultats sont rapportés dans le tableau ci-dessous. Complexe LogP
82a 0,4 ± 0,2
82b 0,5 ± 0,1
Eu-81a-E2 -2,7 ± 0,2
Tb-81a-E2 -2,8 ± 0,2
Tb-81a-E4 -2,3 ± 0,2
Les valeurs de LogP des complexes selon l'invention sont négatives ce qui reflète une parfaite solubilité dans les tampons aqueux, contrairement aux composés 82a et 82b dont les valeurs de LogP sont faiblement positives.

Claims

REVENDICATIONS
1. Agent complexant de formule (I) :
Chro
Figure imgf000046_0001
m,
(0
dans laquelle :
Chrom!, Chrom2 et Chrom3 représentent chacun un groupe de formule (la)
Figure imgf000046_0002
X et X2 représentent chacun un groupe LrCO-R ou L2-G ;
R est un groupe -OR2 ou -NH-E ;
Ra est H ou un groupe -(CH2)|-G ;
R, est un groupe -C02H ou -PO(OH)R3 ;
R2 est H ou un (CrG alkyle ;
R3 est un (C1-C4)alkyle, de préférence un méthyle ; un phényle éventuellement substitué par un groupe -S03\ ce dernier étant de préférence en position méta ou para ; ou un benzyle ; L, est une liaison directe ; un groupe -(CH2)r- éventuellement interrompu par au moins un atome choisi parmi un atome d'oxygène, un atome d'azote et un atome de soufre ; un groupe -CH=CH-; un groupe -CH=CH-CH2- ; un groupe -CH2-CH=CH- ; ou un groupe PEG ;
L2 est un groupe de liaison divalent ;
G est un groupe réactif ;
E est un groupe -CH2-(CH2)s-CH2-S03 " ou -N^lk! Alk2Alk3i ou une sulfobétaïne ;
I est un entier allant de 1 à 4;
r est un entier allant de 1 à 6, de préférence de 1 à 3 ;
s est 0, 1 ou 2 ;
Alkt, Alk2, Alk3, qui peuvent être identiques ou différents, représentent un (C1-C6)alkyle ; étant entendu que le composé de formule (I) comporte au moins un groupe de formule (la) et au moins un groupe L CO-R.
2. Agent complexant selon la revendication 1 , dans lequel Chrom-, représente un groupe de formule (la) dans laquelle est un groupe L2-G ; et Chrom2 et Chrom3 représentent chacun un groupe de formule (Ib) dans laquelle X2 est un groupe LrCO-R.
3. Agent complexant selon la revendication 2, dans lequel Chrom2 et Chrom3 sont identiques.
4. Agent complexant selon la revendication 1 , dans lequel Chrom, et Chrom2 représentent chacun un groupe de formule (la) dans laquelle X, est un groupe l^-CO-R ; et Chrom3 représente un groupe de formule (Ib) dans laquelle X2 est un groupe L2-G.
5. Agent complexant selon la revendication 4, dans lequel Chrom, et Chrom2 sont identiques.
6. Agent complexant selon l'une quelconque des revendications 2 à 5, dans lequel Ra est H.
7. Agent complexant selon la revendication 1 , dans lequel Chroma Chrom2 et Chrom3 représentent chacun un groupe de formule (la) dans laquelle X, est un groupe U-CO-R ; et Ra est un groupe -(CH2)rG.
8. Agent complexant selon la revendication 8, dans lequel Chroma Chrom2 et Chrom3 sont identiques.
9. Agent complexant selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel R, est un groupe -C02H ou -P(0)(OH)R3 dans lequel R3 est un (CrC )alkyle ou un phényle.
10. Agent complexant selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel L, est une liaison directe ; un groupe -(CH2)r- éventuellement interrompu par au moins un atome choisi parmi un atome d'oxygène et un atome de soufre, et r = 2 ou 3 ; un groupe -CH=CH- ; un groupe - CH=CH-CH2- ; ou un groupe -CH2-CH=CH.
11. Agent complexant selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel E est un groupe -CH2-(CH2)s-CH2-S03 " avec s = 0 ou 1 ;'' -(CH2)s-N+AlkiAlk2Alk3 avec Alk, , Alk2 Alk3, identiques ou différents, représentant un (C,-C4)alkyle et s = 0 ou 1 ;ou un groupe de formule : dans laquelle R4 est un (d-C )alkyle et t est 1 ou 2.
12. Agent complexant selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel L2 est choisi parmi :
une liaison directe;
un groupe alkylène linéaire ou ramifié en C Cgo, contenant éventuellement une ou plusieurs doubles ou triples liaisons;
un groupe cycloalkylène en C5-C8 ; un groupe arylène en C6-Ci ;
lesdits groupes alkylène, cycloalkylène ou arylène contenant éventuellement un ou plusieurs hétéroatomes, tels que l'oxygène, l'azote, le soufre ou le phosphore, ou un ou plusieurs groupe(s) carbamoyle ou carboxamido, et lesdits groupes alkylène, cycloalkylène ou arylène étant éventuellement substitués par 1 à 5 groupes alkyle en Ci-C8, aryle en C6-C 4, sulfonate ou oxo ;
- un groupe choisi parmi les groupes divalents de formules suivantes :
(CH2)n .— (CH2)n— 0-(CH2)m— 0-(CH2)p— .
0 O
— (CH2)n— 0-(CH2)m— 0-(CH2)p-NH-L(CH2)q-
dans lesquelles n, m, p, q sont des nombres entiers de 1 à 16, de préférence de 1 à 5 et e est un nombre entier allant de 1 à 6, de préférence de 1 à 4.
13. Agent complexant selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel le groupe réactif G est choisi parmi : un acrylamide, une aminé activée, un ester activé, un aldéhyde, un halogénure d'alkyle, un anhydride, une aniline, un azide, une aziridine, un acide carboxylique, un diazoalcane, un haloacétamide, une halotriazine, une hydrazine, un imido ester, un isocyanate, un isothiocyanate, un maléimide, un halogénure de sulfonyle, un thiol, une cétone, une aminé, un halogénure d'acide, un ester de succinimidyle, un ester d'hydroxysuccinimidyle, un ester d'hydroxysulfosuccinimidyle, un azidonitrophényle, un azidophényle, un glyoxal, une triazine, un groupe acétylénique, et en particulier un groupe choisi parmi les groupes de formules :
Figure imgf000049_0001
dans lesquelles w varie de 0 à 8 et v est égal à 0 ou 1 , et Ar est un hétérocycle à 5 ou 6 chaînons saturé ou insaturé, comprenant 1 à 3 hétéroatomes, éventuellement substitué par un atome d'halogène.
14. Agent complexant selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel le groupe -L2-G est constitué d'un groupement réactif G choisi parmi : un acide carboxylique, une aminé, un ester de succinimidyle, un haloacétamide, une hydrazine, un isothiocyanate, un groupe maléimide, et d'un bras d'espacement L2 constitué d'une chaîne alkylène comprenant de 1 à 5 atomes de carbone ou d'un groupe choisi parmi les groupes de formule :
Figure imgf000050_0001
— <CH2)n-NH
où n, m sont des nombres entiers allant de 1 à 16, de préférence de 1 à 5 et e est un nombre entier allant de 1 à 6, de préférence de 1 à 4, le groupe G étant lié à l'une ou l'autre extrémité de ces groupes divalents.
15. Complexe de lanthanide comprenant un agent complexant selon l'une quelconque des revendications précédentes et un lanthanide.
16. Complexe de lanthanide selon la revendication 15, caractérisé en ce que le lanthanide est choisi parmi : Eu3+, Tb3+, Sm3t, de préférence le lanthanide est Tb3+.
17. Conjugué fluorescent obtenu par réaction entre (i) un complexe de lanthanide selon l'une des revendications 15 et 16 comprenant un groupe G, et (ii) une molécule d'intérêt comprenant un groupe fonctionnel, ledit groupe fonctionnel formant une liaison covalente avec l'un des atomes du groupe G.
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