FR2893617A1

FR2893617A1 - Analogues photoactivables du nadh, du nadph, du nad+ ou du nadp+

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Publication number: FR2893617A1
Application number: FR0511914A
Authority: FR
Original assignee: Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Current assignee: Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Priority date: 2005-11-24
Filing date: 2005-11-24
Publication date: 2007-05-25

Abstract

L'invention concerne des analogues photoactivables du NADH, du NADPH, du NAD+ ou du NADP+ permettant de déclencher de façon sélective une séquence enzymatique précise et de ce fait de suivre par spectroscopie optique rapide le fonctionnement de la machinerie enzymatique.

Description

Analogues photoactivables du NADH, du NADPH, du NAD+ ou du NADP+.

L'invention concerne un outil moléculaire permettant de déclencher de façon sélective une séquence enzymatique précise et de ce fait de suivre par spectroscopie optique rapide le fonctionnement de la machinerie enzymatique.

Il est impossible d'exciter sélectivement le NADPH, car il absorbe à 340 nm, région spectrale dans laquelle beaucoup d'autres composantes biologiques absorbent. De plus il n'est pas possible de synchroniser l'initiation d'une réaction enzymatique avec le NADPH.

Plusieurs composés photoactivables pour l'étude de la machinerie enzymatique ont été développés. Depuis de nombreuses années des complexes organométalliques pour étudier les transferts d'électrons au sein de protéines sont utilisés. Une approche développée est de coupler ces complexes via une cystéine accessible au solvant. Nous ne détaillerons ici qu'une seule des stratégies récentes dirigées sur des enzymes à hème. L'idée est de relier le complexe [Ru(bpy)3]2+ à une porphyrine puis à l'insérer dans la myoglobine (Contakes et coll. 2005, PNAS, 102, 38, 13451-13456). La diffraction aux rayons X permet de déterminer la distance du Ruthénium au fer de l'hème ; elle est d'environ 16 À pour la myoglobine. Le transfert des électrons est initié par une impulsion lumineuse à 480 nm et il est suivi par absorption transitoire. Le temps de vie de l'état excité *[Ru(bpy)3]2+ est diminué par rapport à celui du complexe en solution (450 ns) lorsque le complexe est fixé à la protéine. Ces composés dérivés de [Ru(bpy)3]2+ et d'autres complexes organo-métalliques du Rhenium ont été aussi utilisés pour l'étude du domaine oxygénase de la NO-Synthase inductible (Dunn et coll. 2005, JACS, 127, 5169-5173). Toutefois la fixation du complexe [Ru(bpy)3]2+ sur la protéine maintient l'hème dans un état bas spin, inactivant ainsi la catalyse. Ces molécules ne constituent donc pas pour l'instant des outils adéquats pour l'étude de la machinerie enzymatique.

Depuis les années 1990, des composés cagés ont été développées pour permettre l'étude de la machinerie enzymatique (cf. US5872243). En utilisant une impulsion laser focalisée, il est possible de libérer par photodissociation un nucléotide de sa cage avec un contrôle spatial et temporel précis au sein d'une cellule. Cette méthode a été utilisée pour des mesures une 5, la taux de photodissociation est assez à utiliser des puissances d'impulsion très élevées. De plus, une fois libérés les nucléotides 30 doivent diffuser jusqu'à l'enzyme, ce qui limite considérablement la résolution. Enfin l'affinité de ces formation de cétoglutarate a été observé. Toutefois un certain nombre d'éléments Tout d'abord, le faible, obligeant de diffraction Laue résolue dans le temps avec résolution milliseconde (Stoddard et coll (1998), 891-897). Pour l'enzyme isocitrate désyhydrogénase, l'intermédiaire réactionnel a-contribuent à une résolution limitée. composés pour leurs sites de fixation est généralement faible, ce qui limite l'accumulation du signal.

L'objet de la présente invention concerne un outil moléculaire permettant de déclencher de façon sélective et synchrone la catalyse par des enzymes portant un site de fixation du NADH, du NADPH, du NAD+ et/ou du NADP+ et de suivre par spectroscopie optique rapide le mécanisme enzymatique. Cet outil moléculaire permet d'obtenir une meilleure résolution spacio-temporelle, une sensibilité accrue et une sélectivité d'adressage jamais atteinte jusqu'à présent. L'invention s'affranchit des problèmes de diffusion en adressant l'outil moléculaire directement au site naturel du NADH, du NADPH, du NAD+ et/ou du NADP+ des enzymes. Cet outil moléculaire est inactif dans son état fondamental, il entre en compétition avec NADH, NADPH, NAD+ et/ou NADP+ et inhibe ainsi l'initiation de la catalyse. Par contre, après photo-activation, dans son état excité, il devient réactif et initie la catalyse enzymatique.

Pour mettre au point cet outil moléculaire, les inventeurs se sont appuyés sur les études effectuées sur le site de fixation du cofacteur sur des enzymes à NADH, NADPH, NAD+ et/ou NADP+ (Carugo et Argos, 1997, Proteins : 28 :10-28). Ces études se basent sur des données cristallographiques obtenues sur des enzymes portant un site de fixation du NADH, du NADPH, du NAD+ et/ou du NADP+. Ces études montrent que ces sites de fixation sont conservés. Les Nicotinamide Adénine Dinucléotide (Phosphate) (NAD(P)H/NAD(P)+) sont des molécules ubiquitaires, qui participent à un très grand nombre de réactions physiologiques d'oxydoréduction. Si l'on observe leur structure, on constate que ces molécules sont composées d'une partie adénosine et d'une partie nicotinamide reliées entre elles par un double phosphate. En examinant le mode de fixation du NAD(P)H/NAD(P)+ sur la structure cristallographique de plusieurs enzymes, on constate que c'est la partie adénosine qui joue un rôle déterminant pour la fixation du cofacteur sur l'enzyme. De plus, pour les enzymes qui reconnaissent spécifiquement le NADPH/NADP+ c'est l'existence d'une interaction entre le groupe 2'Phosphate de la partie adénosine et l'enzyme qui est responsable de la discrimination entre le NADPH/NADP+ et le NADH/NAD+. La partie nicotinamide du NAD(P)H/NAD(P)+, quant à elle, est fixée sur une partie de la protéine accessible au solvant. Elle n'est impliquée dans aucune interaction conservée avec la chaîne polypeptidique. Cela indique que le mode de fixation de cette partie est moins strict que pour la partie adénosine. Le mode de fixation est, de plus, très différent d'une protéine à l'autre.

D'un point de vue structural, l'outil moléculaire de la présente invention a été conçu de manière à comprendre deux parties A et B reliées entre elle soit directement soit par un groupement espaceur L. La partie B est un analogue de l'adénosine ou bien un analogue de l'adénosine 2'-phosphate, la partie B permet la reconnaissance de l'outil moléculaire par l'enzyme. La partie nicotinamide a été remplacée par un chromophore (partie A). Un tel outil moléculaire constitue un analogue photoactivable du NADH, du NADPH, du NAD+ ou du NADP+. La présente invention a pour objet des analogues photoactivables du NADH, du NADPH, du NAD+ ou du NADP+ de formule : A-L-B

où A est un chromophore qui présente, à une longueur d'onde a, comprise entre 300 et 700 nm, un coefficient 15 d'extinction molaire (CM) supérieur à 20 000 M-1 . cm-1, où B est un analogue de l'adénosine ou de l'adénosine 2'-phosphate ; où L est présent ou non et L est un groupement espaceur. 20 Par analogue du NADH, du NADPH, du NAD+ ou du NADP+, on entend une molécule capable d'entrer en compétition avec NADH, NADPH, NAD+ ou NADP+ respectivement pour la fixation sur l'enzyme. Généralement l'équilibre de 25 dissociation du complexe enzyme-analogue présente, à température ambiante, une constante de dissociation (KD) inférieure ou égale à 10-3 M, préférentiellement inférieure à 10-4 M et, encore plus préférentiellement, inférieure à 10-5 M. Typiquement l'analogue présente 30 des dimensions semblables à celles du NAD(P)H. Typiquement la longueur de l'analogue sera comprise10 entre 1 et 2 nm, préférentiellement entre 1,2 et 1,7 nm.

De même, par analogue de l'adénosine ou de l'adénosine 2'-phosphate on entend une molécule capable d'entrer en compétition avec l'adénosine ou de l'adénosine 2'-phosphate, respectivement pour la fixation sur l'enzyme. Par molécule photoactivable, on entend une molécule qui 10 une fois excitée par photo-activation, devient réactive et est capable d'initier la catalyse enzymatique.

Par groupement espaceur, on entend un groupement qui relie deux parties d'une molécule. Ces deux parties 15 sont reliées par une chaîne d'atomes reliés entre eux. Chaque atome de cette chaîne constitue un chaînon. A titre d'exemple non limitatif de groupements espaceurs, on peut citer : -groupement espaceur à un chaînon :-CH2- ou -O- ; 20 -groupement espaceur à deux chaînons : -CH2-CH2- ou -CH2-0-

Préférentiellement L est un groupement espaceur constitué de 1 à 8 chaînons, encore plus 25 préférentiellement L est un groupement espaceur constitué de 1 à 4 chaînons.

Préférentiellement l'analogue photoactivable selon l'invention est un analogue du NADH ou du NAD+ de 30 formule : R2 R1

où T est O ou S, préférentiellement O ; où Rl est OH; où R2 est H, OH, OCH3r NH2, préférentiellement OH ; où R3 est une base purine ou pyrimidine, en particulier adénine, guanine, hypoxanthine, thymine, uracile ou cytosine, préférentiellement adénine.

Préférentiellement l'analogue photoactivable selon l'invention est un analogue du NADPH ou du NADP+ de formule . où T est O ou S, préférentiellement O ; où Yl est H2PO4 ou HSO4, préférentiellement H2PO4; où R2 est H, OH, OCH3, NH2, préférentiellement OH ; où R3 est une base purine ou pyrimidine, en particulier adénine, guanine, hypoxanthine, thymine, uracile ou cytosine, préférentiellement adénine.

Préférentiellement l'analogue photoactivable selon l'invention est caractérisé en ce que son sM est 25 compris entre 20000 et 100000 M-1. cm-l. A-L R3 R3 Typiquement, l'analogue photoactivable selon l'invention comprend une partie A qui présente une structure de type push-pull, push-push ou pull-pull. Des exemples de structures de ce type sont données dans Blanchard-Desce C.R. Physique 3 (2002) 439-448.

Préférentiellement un analogue photoactivable selon l'invention est caractérisé en ce que A est un chromophore excitable à au moins deux photons qui présente, à une longueur d'onde 2comprise entre 700 et 1100 nm, un a2 supérieur à 30 GM (1GM = 10-50 cm4.s.photon-1), préférentiellement supérieur à 100 GM. Pour mesurer 62, on pourra utiliser la méthode décrite dans Measurement of two-photon excitation cross sections of molecular fluorophores with data from 690 to 1050 nm Xu, C.; Webb, W. W. J. Opt. Soc. Am. B 1996, 13, 481-491.

Préférentiellement l'analogue photoactivable selon 20 l'invention est de formule :

R4-Ar-Z-Ar'-Xl-L-B ;

où R4 est un groupement électro-donneur, typiquement 25 NR2 où R est H ou un groupement alkyle en Cl ou en C2, ou bien R4 est un groupement électro-attracteur, typiquement CN; où Ar et Ar' sont des groupements aryles identiques ou non, substitués ou non ; 30 où Z est un connecteur conjugué ; où Xl est un groupement un groupement électro-donneur ou un groupement électro-attracteur. Par connecteur conjugué, on entend un ensemble de 5 liaisons conjuguées qui relie Ar à Ar'. Préférentiellement l'analogue photoactivable selon l'invention est de formule : H2 N L-B R'9 10 où R'1, R'2, R'3, R'4, R'5, R'6; R'7, R'8, R'9 sont indépendamment choisis dans le groupe de fonctions constitué par H, OH, NH2, CO2H, alkyle linéaire en C1-C8, groupement organique hydrosoluble (à titre d'exemple on peut citer le PEG) ; 15 où n est compris entre 1 et 3.

Préférentiellement l'analogue photoactivable selon l'invention est de formule : NH2 H N N R'9 où Y2 est OH ou H2PO4.

Un autre objet de l'invention est un procédé de synthèse d'un analogue photoactivable selon l'invention, caractérisé en ce que l'on fait réagir un réactif de formule : A-L'-X2, où L' est présent ou non et L' est un groupement espaceur, sur un réactif de formule X3-B de façon à obtenir un produit de formule A-L-B, où X2 et X3 sont des groupements fonctionnels qui peuvent réagir l'un avec l'autre. Des exemples de groupements fonctionnels pouvant réagir l'un avec l'autre, sont des groupements électrophiles avec des groupements nucléophiles, des groupements pauvres en électrons avec des groupements riches en électrons.

Ce procédé de synthèse permet de générer facilement des analogues photoactivables variés qui présentent des modifications au niveau de la partie chromophore tout en conservant un schéma de synthèse global similaire. Ceci permet de faire varier facilement le potentiel redox à l'état excité de l'analogue photoactivable, ainsi que ses propriétés spectroscopiques.

Un mode de réalisation de l'invention concerne un procédé pour initier la catalyse d'une réaction de manière synchrone par une enzyme à NADH, à NADPH, NAD+ et/ou NADP+ à l'aide d'un analogue photoactivable selon l'invention comprenant les étapes suivantes : 1) l'enzyme et un analogue photoactivable selon l'invention sont mis en présence l'un de l'autre ; 10 2) l'analogue est excité par irradiation lumineuse, en particulier par impulsion laser.

Un mode de réalisation de l'invention concerne un 5 procédé d'imagerie d'une enzyme à NADH, NADPH, NAD+ et/ou NADP+ comprenant les étapes suivantes : 1) l'enzyme et un analogue photoactivable selon l'invention sont mis en présence l'un de l'autre ; 2) l'analogue est excité par irradiation 10 lumineuse, en particulier par impulsion laser ; 3) la fluorescence induite par l'irradiation est détectée et/ou les produits issus de la réaction catalytique initiée par l'analogue photoactivable sont détectés. 15 De manière avantageuse les produits issus de la réaction catalysée sont fluorescents. Typiquement ce procédé d'imagerie permet de colocaliser l'enzyme et ses produits de catalyse et permet de 20 screener en temps réel et in situ des inhibiteurs de l'enzyme.

L'analogue photoactivable, une fois dans son état excité, se désactive de deux manières outre la 25 conversion interne (retour à l'état fondamental par dissipation d'énergie sans émission de lumière) : Par transfert électronique ou bien par fluorescence. Ces deux phénomènes sont en compétition. C'est cette fluorescence de l'analogue photoactivée qui peut être 30 détectée pour l'imagerie d'une enzyme à NADH, NADPH, NAD+ et/ou NADP+ Typiquement le procédé d'imagerie a lieu au sein d'une cellule ou d'un tissu.

Un mode de réalisation de l'invention est une méthode pour étudier par spectroscopie résolue dans le temps le mécanisme d'une enzyme à NADH, NADPH, NAD+ et/ou NADP+ caractérisée en ce que le procédé pour initier la catalyse d'une réaction selon l'invention est mis en œuvre.

Un mode de réalisation de l'invention est une méthode pour étudier par cristallographie résolue dans le temps le mécanisme d'une enzyme à NADH, NADPH, NAD+ et/ou NADP+ caractérisée en ce que le procédé pour initier la catalyse d'une réaction selon l'invention est mis en œuvre.

Typiquement les enzymes à NADH, NADPH, NAD+ et/ou NADP+ sont les NO synthases, les réductases, notamment les les P450 réductases, les déhydrogénases, les catalases, les NADPH oxydases.

La présente invention sera mieux illustrée ci-après à l'aide des exemples qui suivent. Ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation.

Brèves descriptions des figures : Figure 1 : schéma de synthèse de la partie chromophoreligand 11 Figure 2 : schéma de synthèse de l'analogue de 5 l'adénosine 2'-phosphate C Figure 3 : schéma de synthèse de l'analogue A4 à partir de 11 et de C Figure 4 : spectres d'absorption de l'analogue A4, du domaine réductase de eNOS, de NADPH 10 Figure 5a : spectres d'absorption de l'analogue A4 seul, du domaine réductase de eNOS seul, d'un mélange 1/1 analogue A4/domaine réductase de eNOS Figure 5b : spectres d'excitation et d'émission de l'analogue A4 en présence de tampon seulement et de 5 15 équivalents du domaine réductase de eNOS Figure 6 : anisotropie de fluorescence de l'analogue A4 en présence de tampon seul, d'un mélange tampon glycérol, et du domaine réductase de eNOS ; anisotropie de fluorescence du domaine réductase de eNOS 20 Figure 7 : Suivi à 455 nm de la réduction par NADPH des flavines du domaine réductase de eNOS en présence ou absence de l'analogue A4. Figure 8 : spectres de différence avant-après impulsion laser de l'analogue A4 seul et de l'analogue A4 en 25 présence du domaine réductase de eNOS. Figure 9 : spectre d'absorption transitoire de l'analogue en présence de eNOSred (1/1) mesuré 600 ps après l'impulsion excitatrice à 410 nm. La figure présente également la somme calculée des absorptions 30 des radicaux oxydés et réduits (obtenus de façon indépendante) moins les composés dans leur état fondamental (initial). Exemples LISTE DES ABREVIATIONS ET NOMS COMMERCIAUX CCM : Chromatographie sur Couche Mince de silice sauf indication contraire DMF : DiMéthylFormamide HBTU : Hexafluorophosphate de o-(Benzotriazol-l-yl)- N,N,N',N'-TétraméthylUronium TFA : Acide Trichloracétique THF : TétraHydroFurane eq : équivalent p : rendement AcOEt. : acétate d'éthyle Exemple 1 : synthèse d'un analogue photoactivable du NADPH Synthèse de la partie chromophore-ligand 11. Le schéma de synthèse qui a été suivi est donné à la figure 1. Les techniques usuelles de la chimie organique ont été employées pour réaliser la synthèse. De manière plus détaillée, le mode opératoire de la synthèse est le suivant : Synthèse du benzoate de 2-(N-Ethyl-Aniline)Ethyle (2) (1) 2-(N-Ethylaniline)éthanol A température ambiante, sous agitation magnétique et 30 sous azote, 12 ml de chlorure de benzoyle (1.1 eq) sont ajouté à 140 ml d'une solution de THF anhydre contenant 16.54g (1 eq) de 1. La réaction est réalisée en présence de 15.5 ml de triéthyl amine (l.leq) qui a pour rôle de piéger le HC1 formé lors de la réaction.

Au bout de 16 heures la réaction est arrêtée par ajout de 150 ml d'H20 goutte à goutte pendant 20 min. On observe la formation d'un précipité gris qui vire au bleu sombre après quelques minutes. Après évaporation de la phase organique sous vide le précipité est extrait avec 200 ml de CH2C12 puis séché par Na2SO4 Après extraction du solvant sous pompe à vide on obtient une huile visqueuse de couleur bleu (rf (CH2C12/Heptane 3:1) 0.21). La purification sur colonne de silice par un mélange CH2C12/Heptane 3:1 donne 22.93g (p=88.9) d'une huile légèrement jaune.

Synthèse du 4-[Ethyl-(2-benzoyloxyéthyl)amino] benzaldéhyde (3) A 0 C, sous agitation magnétique et sous azote, 8.4ml de POC13 (1.05eq.) sont dissous dans 10 ml de DMF anhydre. 22.83g de 2 dissous dans 10 ml de DMF sont par la suite rajoutés goutte à goutte en 20 minutes sous forte agitation magnétique. Le mélange est ensuite progressivement amené à 95 C. Après 5 heures on arrête la réaction par ajout de 15 ml de NaOH 1N. L'ajout de soude étant exothermique il doit être fait à froid (0 C). On observe alors un précipité vert. Le milieu est neutralisé par ajout de HCO3-. Après réduction du volume de DMF le produit est extrait au CH3CH2C1. La phase organique est séchée par MgSO4 puis évaporée sous vide et a chaud (50 C) une nuit entière pour se débarrasser du DMF qui perturbe la chromatographie sur colonne. Une CCM CH3CH2C/ heptane 1 :1 du produit (3) donne un rf de 0.13. C'est donc l'éluant choisi pour une purification sur colonne de silice. Après évaporation des solvants on obtient 18.98g (p=93%) d'une huile verte. RMN 1H (200MHz) produit (3) 1H-NMR (200.13 MHz, CDC13): 9.74 (s, 1H, CHO), 8.00 (dd, 2H, J = 8.4, 1.5, o-phényl), 7.75 (d, 2H, J = 9.1 Hl), 7.58 (m, 1H, p-phényl), 7.44 (m, 2H, m-phényl), 6.82 (d, 2H, J = 9.1, H2), 4.52 (t, 2H, J = 6.3, H6), 3.80 (t, 2H, J = 6.3, H5), 3.56 (q, J = 7.0, H3), 1.25 (t, 3H, J = 7.0, H4).

Synthèse du 4-[Ethyl-(2-hydroxyéthyl)amino]benzaldéhyde (4) Dans 120m1 d'une solution 1 :1 V de Méthanol, THF contenant 18.90 g de produit (3) on ajoute goutte à goutte 40 ml de NaOH 5%. Le mélange est amené au reflux et la réaction est suivi par CCM au cours du temps en l'absence de changement visible a l'oeil nu (rf CH2C12 (3) =0.28, rf CH2C12 (4) =0.18). Au bout de 4h le réactif de départ n'est plus visible on arrête donc la réaction en neutralisant par ajout de HC1 0.1N. Les solvants organiques sont évaporés sous vide puis le produit de la réaction est extrait avec 250 ml CH2C12 le benzoate restant dans la phase aqueuse. Après séchage de la phase organique par MgSO4 le CH2C12 évaporé sous vide, permettant l'obtention d'un liquide jaune foncé. Le produit de la réaction a été utilisé sans autres formes de purification. Synthèse du 2E)-3-[4-[Ethyl[2-[(tétrahydro-2H-pyrann-2- yl) oxy] éthyl ] amino] phényl ] - 2 -propénaldehyde (5) : La réaction s'effectue en conditions anhydres. Le 4-[éthyl[2-[(tétrahydro-2H-pyrann-2-yl)oxy]éthyl]amino] benzaldéhyde 4 (4 g, 14.9 mmol) est dilué dans 40 mL de THF anhydre. Après addition du bromure de tributyl(1,3- dioxolan-2-ylméthyl)phosphonium (7.13 g, 19.37 mmol) et du NaH (1.70g à 60%, 44.7mmol), le milieu réactionnel est laissé sous agitation et à température ambiante jusqu'à disparition de l'aldéhyde 4, observée par un suivi RMN (environ 19 h).

La réaction est stoppée par addition d'eau à 0 C (bain de glace). Après extraction au dichlorométhane, la phase organique est lavée à l'eau jusqu'à neutralité, séchée et le solvant évaporé. Le produit brut de l'étape précédente (10 g) est repris dans 70 mL de dichlorométhane. On additionne 30 g de silice, 2.5 mL d'eau, et 200 L d'acide acétique. Le mélange réactionnel est laissé sous agitation et à température ambiante jusqu'à disparition de l'acétal, observée par suivi RMN (2,5 jours). Le milieu est filtré sur silice, avec pour éluant un mélange dichlorométhane/acétate d'éthyle 50/50. Le milieu ainsi obtenu est neutralisé par ajout de Na2CO3 et lavage à l'eau, puis séché sur Na2SO4 avant d'être évaporé. Le produit 5 est purifié par chromatographie sur colonne de silice avec pour éluant un mélange dichlorométhane/acétate d'éthyle 98/2, puis 95/5 une fois que le produit commence à passer. On obtient 4.06 g de 5 (92%) à partir de 4. RMN IH : (200.13 MHz, CDC13) : 8 = 9.58 (d, 1H, J = 7.9 Hz), 7.43 (d, 2H, J = 9.0 Hz), 7.36 (d, 1H, J = 15.8 Hz), 6.71 (d, 2H, J = 9.0 Hz), 6.52 (dd, 1H, J = 15.8 ; 7.9 Hz), 4.6 (m, 1H), 3.96-3.75 (m, 2H), 3.65-3.56 (m, 4H), 3.49 (q, 2H, J =-7.1 Hz), 1.85-1.50 (m, 6H), 1.21 (t, 3H, J = 7.1 Hz). RMN 13C : (50.32 MHz, CDC13) : 8 = 193.48, 153.74, 150.12, 130.55, 123.21, 121.16, 111.31, 98.93, 64.66, 62.06, 49.90, 45.38, 30.37, 25.16, 19.22, 11.94 ppm.

Synthèse du N-{4-[4-(4-{éthyl-[2-tétrahydro-pyran-2-yloxy-éthyl]-amino}-phényl) -buta-1,3-diènyl]-phényl}-benzamide (7) La réaction s'effectue en conditions anhydres, sous argon. L'aldéhyde 5 (1 g, 3,3 mmol) est ajouté à 40 mL de THF anhydre. Puis le NaH (3,8 g à 60 %, 9,5 mmol) et le phosphonate 6 (1,2 g, 3,43 mmol) sont additionnés. Après 24 h sous agitation, le mélange réactionnel est refroidi dans un bain de glace et le NaH est neutralisé par ajout de morceaux de glace (réaction exothermique). Le THF est évaporé. La phase organique est extraite par 100 puis 50 mL de dichlorométhane et séchée sur Na2SO4 puis évaporée. Le produit est purifié par chromatographie sur colonne de silice élué par un mélange dichlorométhane/acétate d'éthyle 99/1 puis 97/3 pour accélérer la sortie du produit. La purification est suivie par CCM. Les solvants sont évaporés. On obtient 0,83 g (63 %) de produit 7. RMN 1H : (200,13 MHz, CDC13) :ô= 7.91 (dd, 2H, J = 7.9 Hz, J = 1.6 Hz), 7.88 (s, 1H), 7.65 (d, 2H, J = 8.6 Hz), 7.61-7.44 (m, 4H), 7.35 (d, 2H, J = 8.8 Hz), 6.88 (dd, 1H, J = 21 Hz, J = 15 Hz), 6.74-6.62 (m, 4H), 6.57 (d, 1H, J = 8.8 Hz), 4.64 (m, 1H), 3.99-3.84 (m, 2H), 3.67-3.6 (m, 4H), 3.48 (q, 2H, J = 7.1 Hz), 1.88-1.58 (m, 8H), 1.24 (t, 2H, J = 7 Hz). RMN 13C : (50.32 MHz, CDC13) : 8 = 165.69, 147.28, 136.67, 134.77, 134.18, 132.00, 131.58, 129.43, 129.22, 128.52, 127.62, 126.98, 127.10, 124.96, 124.63, 120.38, 111.58, 99.02, 64.99, 62.15, 49.98, 45.27, 30.50, 25.27, 19.35, 12.16 ppm. Micro-analyse:, mesurée : C : 76.81%; H : 7.34%; N : 5.75%. théo : C : 77.15%; H : 7.10%; N : 5.80%. Masse: C32H36N203. Théo :M+. : 496.2726 ; mesurée : 496.2741. Synthèse du N-[4-(4-{4-[éthyl-(2-hydroxy-éthyl)-amino]-10 phényl}-buta-1,3-diènyl)-phényl]-benzamide (8) L'acétal 7 (0,83 g, 1,67 mmol) est ajouté à 120 mL de dichlorométhane et 6 mL d'HCl 6N. Le mélange est mis sous agitation et laissé au reflux pendant 12 h. L'avancement de la réaction est suivi par CCM de 15 silice. On observe deux phases dans le ballon. La phase contenant le CH2C12 est éliminée. Le solide orangé restant est repris avec de l'eau et de la soude 6N est ajoutée jusqu'à obtention d'un pH basique. La phase organique est extraite au dichlorométhane et séchée sur 20 Nat SO4 . La solution est filtrée et le solvant est évaporé. On obtient 0,65 g (95 %) de produit 8.

RMN 1H : (300,13 MHz, CDC13) : ô = 7.88 (dd, 2H, J = 8.3 Hz, J = 1.5 Hz), 7.83 (s, 1H), 7.63 (d, 2H, J = 7.6 Hz), 7.61-7.52 (m, 3H), 7.45 (d, 2H, J = 8.6 Hz), 7.34 25 (d, 2H, J = 8.8 Hz), 6.88-6.73 (m, 4H), 6.62 (d, 1H, J = 9.6 Hz), 6.57 (d, 1H, J =-9.7 Hz), 3.83 (t, 2H, J = 5.8 Hz), 3.52 (t, 2H, J = 5.8 Hz), 3.46 (q, 2H, J = 6.9 Hz), 1.6 (s. large, 1H), 1.19 (t, 3H, J = 7 Hz). RMN 13C : (50.32 MHz, CDC13) : 8 = 165.49, 147.74, 136.73, 134.96, 134.32, 132.85, 131.86, 129.63, 129.48, 128.82, 127.69, 126.96, 126.75, 126.00, 125.28, 120.17, 112.61, 60.26, 52.44, 45.65, 30 11.95 ppm. Micro-analyse : mesurée : C : 76.95%; H : 6.75%; N : 6.43% ; théo : C : 78.61%; H : 6.84%; N : 6.79% . Masse : C27H28N202 M+. : mesurée : 412.2154 ; théo : 412.2151.

Synthèse du N- [4- (4-{4- [ (2-azido-éthyl) -éthyl-amino] -phényl}-buta-1,3-diènyl)-phényl]-benzamide (9) Etape 1 : sous argon et dans un bain de glace, l'alcool 8 (1,05 g, 2,5 mmol), 12 mL de pyridine distillée et le chlorure de tosyle (1,5 g, 7,87 mmol) sont mélangés. La réaction est laissée sous agitation pendant 3 h. 200 mL d'acétate d'éthyle et 50 mL d'eau sont ajoutés ainsi que du dichlorométhane pour solubiliser le produit. La phase organique est extraite, séchée sur Na2SO4 et filtrée. Le solvant est évaporé jusqu'à ce qu'il reste 100 mL. La solution obtenue est orangée. Etape 2 : du NaN3 (1,2 g, 18,5 mmol) et 50 mL de N'N-diméthylacétamide sont additionnés aux 100 mL de la solution de tosylate 8'. Le mélange est chauffé au reflux pendant 12 h. L'avancement de la réaction est suivi par CCM. Au mélange est ajouté 50 mL de CH2C12 et 50 mL d'H20. La phase organique est extraite et les solvants sont évaporés. Le produit est purifié par chromatographie colonne sur gel de silice et élué au dichlorométhane. On obtient 0,55 g (50 %) de produit 9 (Bloom et coll., 2003). RMN'H : (300,13 MHz, CDC13) : ô = 7.89 (d, 2H, J = 7 Hz), 7.81 (s, 1H), 7.63 (d, 2H, J = 8.5 Hz), 7.59-7.52 (m, 3H), 7.45 (d, 2H, J = 8.5 Hz), 7.36 (d, 2H, J = 8.5 Hz), 6.89-6.64 (m, 4H), 6.66 (d, 1H, J = 15 Hz), 6.59 (d, 1H, J = 6.6 Hz), 3.54-3.46 (m, 6H), 1.21 (t, 3H, J = 7 Hz)30 Synthèse du N- [4- (4-{4- [ (2-amino-étyl) -éthyl-amino] -phényl}-buta-1,3-diènyl)-phényl]-benzamide (10) La triphénylphosphine (0,33 g, 1,27 mmol) dissoute dans 5 mL de toluène est ajoutée à l'azoture 9 (0,5 g, 1,14 mmol) dissous dans 50 mL de toluène. Le mélange est chauffé au reflux pendant 7 h jusqu'à la disparition du composé de départ suivie par CCM. La solution est refroidie à température ambiante. 130 mL de THF et 0,5 mL d'eau sont ajoutés à la solution qui est portée à reflux pendant 5 jours. La réaction est suivie par CCM. Le mélange devient jaune-orangé et limpide. La solution est refroidie à température ambiante puis évaporée. De l'éther est ajouté et le mélange est filtré sur fritté. On obtient 0,47 g (100 %) de produit 10 (Vaultier et coll., 1983). RMN 1H : (200,13 MHz, CDC13) : â= 7.9 (d, 2H, J = 7.2 Hz), 7.86 (s, 1H), 7.63 (d, 2H, J = 8.5 Hz), 7.58-7.49 (m, 5H), 7.45 (d, 2H, J = 8.5 Hz), 7.34 (d, 2H, J = 8.8 Hz), 6.91-6.78 (m, 2H), 6.71 (d, 2H, J = 8.8 Hz), 6.59 (dd, 2H, J = 15.5 Hz, J = 4.8 Hz), 3.46-3.39 (m, 4H), 2.96 (t, 2H, J = 6.8 Hz), 1.19 (t, 3H, J = 7 Hz).

RMN 13C : (75 MHz, CDC13) : S = 168.02, 150.12, 138.02, 134.88, 133.35,132.5, 130.92, 129.97, 129.82, 128.62, 128.49, 128.02, 127.77, 126.55, 125.10, 119.14, 113.27, 53.28, 42.75, 37.70, 13.15.

Synthèse du N-{4-[4-(4-amino-phényl)-buta-1,3-diènyl]-25 phényl}-N-éthyl-éthan-1,2-diamine (11) Dans un ballon, sont mélangés le produit 10 (0,300 g, 0,729 mmol), 20 mL de soude (6 N) et 70 mL d'éthanol. La solution est agitée et portée au reflux pendant 12 h puis évaporée à sec. 50 mL de CH2C12 et 10 mL d'eau 30 sont additionnés. La phase organique est extraite et évaporée. De l'HCl 6N est ajouté jusqu'à obtention d'un pH 1-2 puis de l'éther est rajouté. La phase aqueuse est extraite. Du NaOH est rajouté jusqu'à obtention d'un pH 7-8. La phase organique est extraite au dichlorométhane, séchée sur Na2SO4, filtrée et évaporée. Le produit est recristallisé dans l'éther et filtré sur fritté. On obtient 0,225 g (75 %) de produit 11. RMN 1 H : (200,13 MHz, CDC13) : ô = 7.9(d, 2H, J = 8Hz), 7.4-7.7(m, 4H), 7.2(d, 2H, ), 7.9(d, 2H, J = 8Hz), 7.01(d, 2H, J= 8Hz), 6.65 (d, 2H, J = 8Hz), 3.35 (m, 4H), 2.85 (t, 2H), 2.6 (bl, 2H), 1.1(t, 3H, J= 7.3Hz). RMN 13C : (50.32 MHz, CDC13) : ô = 151.91, 148.72, 141.11, 134.08, 130.54, 129.31, 128.07, 126.89, 126.01, 125.49, 114.97, 11.41, 53.29, 43.73, 39.91, 12.72.

Synthèse de l'analogue de l'adénosine 2'-phosphate C Le schéma de synthèse qui a été suivi est donné à la figure 2. Les techniques usuelles de la chimie organique ont été employées pour réaliser la synthèse.

De manière plus détaillée, le mode opératoire de la synthèse est le suivant : Synthèse du [6-(6-amino-purin-9-yl)-2,2-diméthyl-tétrahydrofuro [3, 4-d] [1, 3] dioxol-4-yl] -méthanol (B) La réaction s'effectue sous atmosphère d'argon.

L'adénosine (A) (3,46 g, 12,95 mmol) et l'APTS (34,56 g, 143 mmol) sont dissous, sous agitation, dans 700 mL d'acétone anhydre. Après 4 h à température ambiante, le mélange est refroidi dans un bain de glace. Le NaHCO3 (23,2 g, 276 mmol) et quelques morceaux de glace sont ajoutés lentement à la solution (réaction exothermique). L'acétone et l'eau sont évaporées. Les traces d'eau restantes sont évaporées en chauffant dans un bain d'huile, sous vide. La poudre blanche obtenue est purifiée avec un Soxhlet, le produit est récupéré dans l'acétone qui est ensuite évaporé. Le solide blanc obtenu est récupéré en chauffant dans 100 mL d'eau. La solution est filtrée et l'eau est évaporée jusqu'à ce qu'il reste 30 mL. La solution est plongée dans un bain de glace pour la recristallisation. La poudre obtenue est filtrée sur fritté. On obtient 3,39 g (85 %) de produit B.

RMN 1H : (500,13 MHz, DMSO) : = 8.35 (s, 1H), 8.16 (s, 1H), 7.36 (s, 2H), 6.13 (d, 1H, J = 3 Hz), 5.35 (q, 1H, J = 3 Hz), 5.26 (t, 1H, J = 5 Hz), 4.97 (dd, 1H, J = 4 Hz, J = 2.3 Hz), 4.22 (dd, 1H, J = 2.5 Hz, J = 4.5 Hz), 1.55 (s, 3H), 1.33 (s, 3H) Synthèse de l'acide 6-(6-amino-purin-9-yl)-2,2-15 diméthyl-tétrahydro-furo [3, 4-d] [1, 3] dioxole-4-carboxylique (C) L'hydroxyde de potassium (1,84 g, 32,8 mmol) est dissous dans 700 mL d'H20, l'alcool B (3,38 g, 11 mmol) puis le permanganate de potassium (5,19 g, 32,8 mmol) 20 dissous dans de l'eau sont ajoutés. La réaction est laissée sous agitation pendant 3 jours. L'excès d'oxydant KMnO4 est enlevé en ajoutant 120 mL d'H2O2 à 6,5 %. La solution est filtrée sur un fritté contenant de la célite. L'eau est évaporée jusqu'à avoir environ 25 50 mL. Le mélange est acidifié avec de l'acide chlorhydrique jusqu'à obtention d'un pH égal à 3. Le précipité obtenu est filtré sur fritté. On obtient 1,73 g (49 %) d'acide C. RMN 'H : (500,13 MHz, DMSO) : S = 8.26 (s, 1H), 8.1 (s, 1H), 7.29 (s, 2H), 6.33 30 (s, 1H), 5.54 (d, 1H, J = 6 Hz), 5.47 (d, 1H, J = 5.8 Hz), 4.69 (s, 1H), 1.53 (s, 3H), 1.36 (s, 3H).

Synthèse de l'analogue photoactivable A4 Le schéma de synthèse qui a été suivi est donné à la figure 3. Les techniques usuelles de la chimie organique ont été employées pour réaliser la synthèse.

De manière plus détaillée, le mode opératoire de la synthèse est le suivant : Synthèse de l'acide 6-(6-amino-purin-9-yl)-2,2-dimèthyl-tétrahydro- furo [3, 4-d] [1, 3] dioxole-4- carboxylique [2-({4-[4-(4-amino-phényl)-buta-1,3-diènyl]-phènyl}-éthyl-amino)-éthyl] -amide (Al)

Sous argon, la partie chromophore-ligand 11 (0,09 g, 0,29 mmol), l'analogue de l'adénosine 2'-phosphate C (0,093 g, 0,29 mmol), la triéthylamine (0,043 g, 0,435 mmol), le HBTU (0,164 g, 0,435 mmol) et 10 mL de DMF distillé sont mélangés. La réaction est agitée pendant 3 jours. Le DMF est distillé sous vide. Le produit est recristallisé dans l'éther. La poudre marron obtenue est filtrée sur fritté. On obtient 0,1 g (57 %) de produit Al. RMN 1H : (300,13 MHz, CDC13) : 8.45(s, 1H), 8.01(s, 1H), 7.62(d, 2H, J =8.1Hz), 7.40(d, 2H, J= 8.1Hz), 6.88-7.72(m, 3H), 6.52-6.72(m, 6H), 6.3(s, 1H), 6.04(bl, 4H), 5.6(m, 1H), 5.02(m, 1H), 4.54(m, 1H), 3.24-3.43(m, 6H), 1.63(s, 3H), 1.42(s, 3H), 1.1(t, 3H, J = 7.2Hz). RMN 13C : (75 MHz, CDC13) : = 167.29, 157.22, 152.97, 150.71, 147.06, 140.38, 140.36, 133.72, 130.01, 128.03, 127.11, 126.87, 126.09, 117.08, 115.14, 113.68, 112.41, 87.67, 84.01, 81.88, 49.68, 44.51, 34.37, 26.96, 25.62, 12.44.

Synthèse de l'acide 5-(6-amino-purin-9-yl)-3,4-dihydroxy-tétrahydro-furan-2-carboxylique [2-({4-[4-(4-amino-phényl)-buta-1,3-diènyl]-phényl}-éthyl-amino)-éthyl] -amide (A2)

A température ambiante, Al (0,12 g, 0,197 mmol) est additionné à un mélange THF-H20 (1 mL/0,5 mL) et à 3 mL d'acide trifluoracétique. Après 13 h, les solvants sont évaporés. On obtient 0,108 g (96 %) de produit A2. RMN 1H : (500,13 MHz, CDC13) : 8.58(s, 1H), 8.33(s, 1H), 8.04(d, 2H, J = 8Hz), 7.57(d, 2H, J = 8Hz), 6.88- 7.12 (m, 4H), 6.47-6.82 (m, 7H), 6.08(m, 5H), 4.95(m, 2H), 4.15(m, 2H), .2Hz), 4.15 (m, 1H), 3.33-3.48(m, 6H), 1.08(t, 3H, J = 7.2Hz).

Synthèse de l'acide phosphorique mono-[5-[2-({4-[4-(4-amino-phényl)-buta-1,3-diènyl]-phényl}-éthyl-amino) -éthylcarbamoyl]-2-(6-amino-purin-9-yl)-4-hydroxytétrahydro-furan-3-yl] ester

Etape 1 : La bis(benzyloxy)(diisopropylamino)phosphine (0,1 g, 0,29 mmol) et le 1-H-tétazole (0,307 g, 0,44 mmol) sont mélangés dans 3 mL de CH2C12 pendant 30 minutes. Le mélange obtenu est ajouté au diol A2 (0,165 g, 0,29 mmol). La réaction est suivie par spectroscopie de masse basse résolution (MS(APCI)). Après 2 h, MS(APCI) montre la conversion totale de A2 et l'apparition du phosphite désiré. Le mélange obtenu est ensuite agité à 25 C sous atmosphère d'oxygène. Après 24 h, 20 mL d' H2O et 60 mL de CH2C12 sont ajoutés. La phase organique est extraite à l'eau, puis lavée avec 15 mL d'une solution aqueuse de NaHCO3 saturée. La phase organique est séchée sur MgSO4, filtrée et concentrée pour donner une huile. On obtient 0,167 g (69 %) de produit A3, qui est un mélange de deux isomères 2 et 3. L'isomère 2 correspond à un groupement en position 2. L'isomère 3 correspond à un groupement phosphite en position 3.

Etape 2 : Le produit A3 (0,05 g, 0,65 mmol) est dissous dans du CH2C12 anhydre. Le Me3SiBr est ajouté. Le mélange est agité et laissé à 0 C pendant 12 h. De l'eau est rajoutée et la réaction est laissée encore 1 h. La phase organique est extraite, séchée sur MgSO4 et filtrée. On obtient 0,034 g (88 %) de produit A4. RMN 1H : (300,13 MHz, CDC13) : 8 . 6 (s, 1H), 8.2(s, 1H), 7.61(d, 2H, J = 8Hz), 7.41(d, 2H, J = 8Hz), 6.88- 7.73(m, 3H), 6.52-6.73(m, 6H), 6.3(m, 1H) 5.3-5.36(m, 1H) , 4.36(m, 0.5H), 4.32(m, 0.5H), 3.5(m, 6H), 3.3-3.5(m, 6H), 1.1(t, 3H, J= 7.2Hz).

Analyse des propriétés de l'analogue photoactivable

Exemple 2 : Propriétés spectroscopique de l'analogue (excitation sélective) (cf. figure 4) La mesure du coefficient d'extinction molaire de l'analogue nous donne EM=6x104M-1. cm-1 valeur très favorable par rapport à 6.6.103M-1.cm-1 pour le NADPH ( %max =340nm). Les propriétés spectroscopiques (Xmax, Erg) de l'analogue sont compatibles avec une excitation sélective de l'analogue par une impulsion pompe à 400 nm.

Exemple 3 : Fixation de l'analogue à la protéine La figure 5a présente les spectres de l'analogue en solution seul et en présence de la protéine. L'absorption de la protéine est due à la présence des flavines et présente un maximum à 455 nm et un épaulement à 475 nm. Le maximum d'absorption de l'analogue en solution se situe à 373 nm et se déplace légèrement vers le rouge (382 nm) en présence de la protéine.

Exemple 4 : Mesure des spectres d'excitation et de fluorescence à l'équilibre De façon similaire aux tests de fixation de l'analogue par mesures d'absorption nous avons mesuré les effets de la présence de la protéine sur le spectre d'excitation et d'émission de fluorescence de l'analogue. Les résultats montrent (figure 5b) qu'en présence de 5 équivalents de protéine on observe un déplacement du maximum du spectre d'excitation vers le rouge de quatre nanomètres en passant de 370 à 374 nm. L'effet est plus marqué pour le spectre de fluorescence puisque l'on observe un déplacement de 10 nm en passant de 523 nm pour l'analogue seul en solution à 533 nm en présence de la protéine.

Exemple 5 : Mesure de l'anisotropie de fluorescence Les courbes de la figure 6 montrent que l'anisotropie de fluorescence du chromophore est plus grande pour le chromophore lorsque celui-ci est dissous dans du glycérol visqueux que lorsqu'il est dans un tampon aqueux. Cela confirme donc que lorsque ses mouvements de rotations sont restreints, son anisotropie augmente. De plus pour les valeurs d'excitation inférieurs à 470 nm lorsque celui-ci est mis en solution en présence de la protéine son anisotropie augmente. La restriction des mouvements du chromophore indique que celui-ci s'est fixé à la protéine.

Exemple 6 : Tests qualitatifs de compétition entre l'analogue photoactivable et le NADPH sur le domaine 15 réductase de la NO-Synthase (eNOS-Red) Avant d'étudier les premières étapes du transfert d'électrons au sein du domaine réductase de la NO- Synthase il est important de savoir si l'analogue A4 se fixe bien au site naturel de fixation du NADPH. La 20 réduction des flavines entraîne une baisse importante de l'absorption à 455 nm. Il est donc possible de suivre la cinétique de la réduction des flavines par absorption. Nous supposons que la vitesse de diffusion du NADPH jusqu'à son site de fixation dans la protéine 25 est l'étape limitante de la réduction des flavines. Si la fixation de l'analogue sur la protéine a bien lieu, alors elle devrait empêcher celle du NADPH et l'analogue se comportant comme un inhibiteur. La vitesse globale de réduction des flavines devrait alors 30 dépendre du rapport NADPH/analogue et sa mesure représente un bon moyen de savoir si l'analogue occupe le site naturel du NADPH sur la protéine. Une concentration équivalente de protéine a été utilisée en l'absence et en présence d'analogue.

Lorsqu'on ajoute NADPH, une baisse très rapide de l'absorption à 455 nm est observée (cf. figure 7). Nous constatons sur la courbe k05041 une phase de déclin très rapide. Par comparaison, la vitesse de réduction des flavines par le NADPH est plus lente lorsque l'analogue est présent et le taux de réduction est plus faible comparé à celui observé en l'absence d'analogue. Les données sont ajustées par une exponentielle T = (216 20s). Il est à noter que ces valeurs sont obtenues pour un rapport NADPH/analogue = 5.7 :1, et n'ont pas été optimisées en variant le rapport des deux. L'interaction de l'analogue avec la protéine est donc spécifique et l'analogue se fixe au niveau du site de fixation naturel du NADPH.

Etude de l'initiation de la catalyse

Exemple 7 : Comparaison des spectres de différence : avant - après laser avec eNOSred native ou de l'analogue seul: L'irradiation de l'analogue à l'aide de lumière visible ou par excitation laser induit des modifications d'absorption, présentées à la figure 8. L'analogue dans un tampon Tris montre une baisse d'absorption avec un maximum à 382.5 nm. L'absorption de l'analogue en présence de eNOSred baisse à la fois à 391 nm (bande de l'analogue) et à 455 nm (bande des flavines oxydées de la protéine). Le rapport des variations d'absorption indique qu'un analogue a été consommé par flavine modifiée (c respectifs d'environ 6x 104 et 2.2 x 104 M-1 cm-1), en accord avec un transfert d'électron. Dans ces expériences, rien n'est rajouté pour réduire l'analogue oxydé après transfert d'électron et/ou réoxyder les flavines, en d'autre terme pour rendre le système cyclique. La conséquence est que l'analogue et la protéine sont consommés après transfert d'électron photoinduit.

Exemple 8 : Spectre transitoire de l'analogue fixé à eNOSred (obtenu 600ps après l'impulsion laser) ajusté par la somme des espèces réduites + oxydées, en accord avec un transfert d'électron (figure 9) Le spectre transitoire obtenu après déclin des états excités de l'analogue peut être calculé par la somme suivante : cation radical de l'analogue (oxydé) + dication + flavine réduite - flavine oxydée. Ceci est en accord avec un transfert d'électron ayant lieu en environ une centaine de ps. Les spectres du cation radical et du dication de l'analogue sont obtenus indépendamment par oxydation douce à l'aide de SbCls dans CH2C12 les spectres de la flavine réduite sont publiés (Dunford, et al., Eur. J. Biochem. 271, 2548-2560 (2004)).

Claims

Revendications

1. Analogue photoactivable du NADH, du NADPH, du NAD+ ou du NADP+ de formule : A-L-B où A est un chromophore qui présente, à une longueur d'onde ?comprise entre 300 et 700 nm, un coefficient 10 d'extinction molaire (CM) supérieur à 20 000 M-1. cm-1, où B est un analogue de l'adénosine ou de l'adénosine 2'-phosphate ; où L est présent ou non et L est un groupement espaceur, 15 ou son sel.

2. Analogue photoactivable du NADH, du NADPH, du NAD+ ou du NADP+ selon la revendication 1 caractérisé en ce que L est un groupement espaceur constitué de 1 à 8 20 chaînons.

3. Analogue photoactivable selon la revendication 1 ou 2 caractérisé en ce que l'analogue photoactivable est un analogue du NADH ou du NAD+ de formule : A-L T R3 25 R2 R1 où T est O ou S, préférentiellement O ; où R1 est OH; où R2 est H, OH, OCH3, NH2, préférentiellement OH ;5où R3 est une base purine ou pyrimidine, en particulier adénine, guanine, hypoxanthine, thymine, uracile ou cytosine, préférentiellement adénine.

4. Analogue photoactivable selon la revendication 1 ou 2 caractérisé en ce que l'analogue photoactivable est un analogue du NADPH ou du NADP+ de formule A-L TYR3 R2 Y1 où T est O ou S, préférentiellement O ; où Yl est H2PO4 ou HSO4r préférentiellement H2PO4i où R2 est H, OH, OCH3, NH2, préférentiellement OH ; où R3 est une base purine ou pyrimidine, en particulier adénine, guanine, hypoxanthine, thymine, uracile ou cytosine, préférentiellement adénine.

5. Analogue photoactivable selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 caractérisé en ce que sM est compris entre 20000 et 100000 M-1 . cm-1 .

6. Analogue photoactivable selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 caractérisé en ce que A présente une structure de type push-pull, push-push ou pull-pull.

7. Analogue photoactivable selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 caractérisé en ce que A est un chromophore excitable à au moins deux photons qui 25présente, à une longueur d'onde ,comprise entre 700 et 1100 nm, un a2 supérieur à 30 GM, préférentiellement supérieur à 100 GM.

8. Analogue photoactivable selon l'une quelconque des revendications 1 à 7 de formule : R4-Ar-Z-Ar'-Xl-L-B ; où R4 est un groupement électro-donneur ou un groupement électro-attracteur; où Ar et Ar' sont des groupements aryles identiques ou non , substitués ou non; où Z est un connecteur conjugué ; où Xl est un groupement électro-donneur ou un groupement électro-attracteur.

9. Analogue photoactivable selon la revendication 8 de formule : où R'1, R'2, R'3, R'4, R'5, R'6; R'7, R'8, R'9 sont indépendamment choisis dans le groupe de fonctions constitué par H, OH, NH2, CO2H, alkyle linéaire en C1-C8, groupement organique hydrosoluble ; 25 où n est compris entre 1 et 3. N L-B R'920

10. Analogue photoactivable selon la revendication 9 de formule : NH2 H N N R'9 H2 où Y2 est OH ou H2PO4.

11 Procédé de synthèse d'un analogue photoactivable selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisé en ce que l'on fait réagir un réactif de formule : A-L'-X2, où L' est présent ou non et L' est un groupement espaceur, sur un réactif de formule X3-B de façon à obtenir un produit de formule A-L-B, où X2 et X3 sont des groupements fonctionnels qui peuvent réagir l'un avec l'autre.

12. Procédé pour initier la catalyse d'une réaction de manière synchrone par une enzyme à NADH, à NADPH, NAD+ et/ou NADP+ à l'aide d'un analogue photoactivable selon l'une quelconque des revendications 1 à 10 comprenant les étapes suivantes . 1) l'enzyme et un analogue photoactivable selon l'une quelconque des revendications 1 à 10 sont mis en présence l'un de l'autre ; 2) l'analogue est excité par irradiation lumineuse, en particulier par impulsion laser.13. Procédé d'imagerie d'une enzyme à NADH, NADPH, NAD+ et/ou NADP+ comprenant les étapes suivantes : 1) l'enzyme et un analogue photoactivable selon 5 l'une quelconque des revendications 1 à 10 sont mis en présence l'un de l'autre ; 2) l'analogue est excité par irradiation lumineuse, en particulier par impulsion laser ; 3) la fluorescence induite par l'irradiation est 10 détectée et/ou les produits issus de la réaction catalytique initiée par l'analogue photoactivable sont détectés. 14. Procédé selon la revendication 12 ou 13, 15 caractérisé en ce que le procédé a lieu au sein d'une cellule ou d'un tissu. 15. Méthode pour étudier par spectroscopie résolue dans le temps le mécanisme d'une enzyme à NADH, NADPH, NAD+ 20 et/ou NADP+ caractérisée en ce que le procédé selon la revendication 12 est mis en oeuvre. 16. Méthode pour étudier par cristallographie résolue dans le temps le mécanisme d'une enzyme à NADH, NADPH, 25 NAD+ et/ou NADP+ caractérisée en ce que le procédé selon la revendication 12 est mis en oeuvre.