CN110982816A

CN110982816A - 一种获得高硬脂酸油菜的方法

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Publication number: CN110982816A
Application number: CN201911313173.8A
Authority: CN
Inventors: 黄会斌; 周永明; 赵青; 杨庆勇; 范楚川; 张椿雨
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2019-12-18
Filing date: 2019-12-18
Publication date: 2020-04-10
Anticipated expiration: 2039-12-18
Also published as: CN110982816B

Abstract

本发明涉及植物基因工程技术领域，具体涉及一种利用基因编辑技术获得高硬脂酸油菜的方法。所述方法包括以下步骤：S1，根据甘蓝型油菜BnSAD1.A3和BnSAD1.C3基因的核苷酸序列设计并筛选五个碱基位点的靶点序列，并针对靶点序列设计引物；S2，构建五靶点基因编辑载体pBnSAD1载体；S3，pBnSAD1载体用受体材料甘蓝型油菜下胚轴遗传转化，获得高硬脂酸油菜。本发明所提供的方法可以不同程度的提高油菜硬脂酸的含量，为甘蓝型油菜高硬脂酸育种提供了新的途径，提供了新的种质资源，具有良好的应用前景。

Description

一种获得高硬脂酸油菜的方法

技术领域

本发明涉及植物基因工程技术领域，具体涉及一种利用基因编辑技术获得高硬脂酸油菜的方法。

背景技术

油菜是我国重要的油料作物和食用植物油来源。油菜的脂肪酸改良主要是从不同的用途展开，其中最受关注的是提高油菜油酸含量，改善菜籽油的品质。但是对于油菜中硬脂酸含量的遗传改良研究很少有报道。高硬脂酸(C18∶0)和油酸(C18∶1)含量的植物油是目前工业上的一大需求，可用于烘焙食品，与目前市场上的人造黄油相比更有利于人类的健康。为了获得高硬脂酸的植物油，研究者们已经在向日葵、大豆和拟南芥中获得高硬脂酸(C18∶0)的突变体，均能显著提高硬脂酸含量。到目前为止，尚未有通过对甘蓝型油菜硬酯酰基去饱和酶(S-ACP-D)基因进行突变获得高硬脂酸(C18∶0)的突变体的报道。

发明内容

本发明针对现有技术中存在的技术问题，提供一种获得高硬脂酸油菜的方法，该高硬脂酸油菜是通过基因编辑手段获得。

本发明通过以下技术方案来实现上述技术目的：

本发明所提供的获得高硬脂酸油菜的方法，包括以下步骤：

S1，根据甘蓝型油菜BnSAD1.A3和BnSAD1.C3基因的核苷酸序列设计并筛选五个碱基位点的靶点序列，并针对靶点序列设计引物；

S2，构建五靶点基因编辑载体pBnSAD1载体；

S3，pBnSAD1载体用受体材料甘蓝型油菜下胚轴遗传转化，获得高硬脂酸油菜。

其中，所述五个碱基位点的靶点序列(5＇-3＇)分别见SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8。

其中，所述靶点序列的引物序列分别见SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ IDNO：137、SEQ ID NO：18。

其中，所述BnSAD1.A3拷贝的碱基序列如SEQ ID NO：2所示；所述BnSAD1.C3拷贝的碱基序列如SEQ ID NO：3所示。

本发明步骤S2中构建五靶点基因编辑载体pBnSAD1载体的步骤包括：

e、靶点接头制备；

f、靶点接头引物与sgRNA表达盒的连接和扩增；

g、靶标sgRNA表达盒与pYLCRISPR/Cas9载体的连接；

h、转化大肠杆菌，挑选阳性克隆，测序验证，得到最终载体；

e、将连接成功的载体转入农杆菌GV3101感受态细胞，得到pBnSAD1载体农杆菌菌株。

其中，所述BnSAD1.A3和BnSAD1.C3基因是根据拟南芥fab2基因进行基因家族分析得到的。

本发明还提供了上述利用基因编辑技术获得高硬脂酸油菜的方法在油菜育种中的应用。

本发明具有以下有益技术效果：

本发明根据甘蓝型油菜BnSAD1.A3和BnSAD1.C3基因的核苷酸序列设计并筛选了五个碱基位点的靶点序列，并针对靶点序列设计引物，然后构建五靶点基因编辑载体pBnSAD1载体，并将该载体用受体材料甘蓝型油菜下胚轴遗传转化，可以不同程度的提高油菜硬脂酸的含量，本发明为甘蓝型油菜高硬脂酸育种提供了新的途径，提供了新的种质资源，具有良好的应用前景。

附图说明

图1为突变体植株PCR阳性检测鉴定结果图；

图2为阳性单株PCR编辑检测结果图；

图3为突变体植株和野生型甲9707种子中硬脂酸含量的检测结果图。

图4为五靶点基因编辑载体pBnSAD1载体的示意图。

具体实施方式

以下结合具体实施方式对本发明进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

本发明所用的试剂均市售可得，所用载体、质粒均为本领域公知公用。

下述实施例中涉及到的培养基如下：

LB培养基(1L)：蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，固体培养基加琼脂15g/L，121℃高压灭菌20min，4℃冰箱贮存备用。

DM(100ml)：MS 0.44g，蔗糖3g，定容，调PH＝5.84-5.88，灭菌，快冷使用时加抗生素AS(100μm)100μl。

M0(100ml)：1/2MS 0.22g，蔗糖3g，定容，调PH＝5.84-5.88，加Agar 0.7g，灭菌。

M1(500ml)：MS 2.2g，蔗糖15g，Mannitol 9g，2,4-D(1mg/L)0.5ml，KT(0.3mg/L)0.5ml，定容，调PH＝5.84-5.88，加Agar 3.5g，灭菌，快冷使.用时加抗生素AS(100μm)500μl。

M2(500ml)：MS 2.2g，蔗糖15g，Mannitol 9g，2,4-D(1mg/L)0.5ml，KT(0.3mg/L)0.5ml，定容，调PH＝5.84-5.88，加Agar 3.5g，灭菌，快冷使用时加STS 75μl，TMT(300mg/ml)0.5ml，HygromycinB(25mg/ml)250ul。

M3(500ml)：MS 2.2g，葡萄糖5g，木糖0.125g，MES 0.3g，定容，调PH＝5.84-5.88，加Agar 3.5g，灭菌，快冷使用时加反式-Zeatin(2.0mg/L)0.5ml，IAA(0.1mg/L)0.5ml，TMT(300mg/L)0.5ml，AgNO375μl，HygromycinB(25mg/ml)250μl。

M4(500ml)：MS 4.4g，蔗糖5g，定容，调PH＝5.84-5.88，加Agar 3.5g，灭菌，快冷使用时加TMT(300mg/L)0.5ml。

STS:[Ag(SO3)2]3-现用现配，时间过长有沉淀。

母液：

硫代硫酸钠，0.1M(1.58g溶于100mLddH2O)；AgNO3，0.1M(1.7g溶于100mLddH2O)

VNa2SO3:VAgNO3＝4:1，将AgNO3溶于硫代硫酸钠中。

2,4-D:1mg/mL母液，0.25g2,4-D加入少量95％酒精和1M的NaOH溶液，定容至250mL。

KT:0.03gKT先溶于1MHCL中，加水定容至100mL。

AS:100mmol/L母液，0.392gAS先溶于少量甲醇中，再加二甲基亚砜，定容至20mL。

TZ:反式Zeatin(玉米素)，2mg/mL母液，称0.04gTZ溶于少量75％酒精中，加水定容至20mL。

IAA:0.1mg/mL，100mgIAA溶于少量95％乙醇中，再加ddH2O定容至100mL，抽滤分装，保存于-20℃。

实施例1甘蓝型油菜Δ9硬脂酰ACP脱氢酶(SAD)基因同源基因分析

根据拟南芥TAIR数据库(https://www.arabidopsis.org/)获得fab2基因编码序列；利用fab2基因编码序列与参考基因组Darmor-bzh进行blast比对(http://www.genoscope.cns.fr/brassicanapus/)，选取相似度在90％以上和期望值为0的比对结果作为下一步研究的候选基因，最后得到BnSAD.A3和BnSAD.C3两个个拷贝。拟南芥fab2基因的碱基序列如SEQ ID NO：1所示；BnSAD.A3拷贝的碱基序列如SEQ ID NO：2所示，BnSAD.A3拷贝的碱基序列如SEQ ID NO：3所示。

实施例2突变体材料的获得

一、筛选靶点序列并设计引物

从参考基因组Darmor-bzh中获得甘蓝型油菜BnaSAD1基因的BnSAD.A3和BnSAD.C3两个拷贝的核苷酸序列。应用在线软件CRISPR-P(http://cbi.hzau.edu.cn/cgi-bin/CRISPR2/CRISPR)设计靶点，筛选出T1、T2、T3、T4、T5共五个靶点(表1)，并针对靶点序列设计引物(表2)。

表1靶点序列

表2靶点引物序列

二、构建五靶点基因编辑载体pBnSAD1载体

五靶点基因编辑载体pBnSAD1载体的制备包括以下步骤:

(1)靶点接头制备：将表2接头引物(靶点序列引物)用ddH2O溶解成10μM母液。将左右引物各取1μl加入到8μl ddH2O混合稀释到1μM，涡旋震动混匀。然后放入水浴锅90℃，处理30”，自然冷却至室温。

(2)sgRNA表达盒连接反应

1、酶切Lacz-AtU3d，AtU3d，AtU3b，AtU6-1，AtU6-29五个质粒，酶切体系见表3，室温酶切15min。

表3质粒酶切体系

2、酶切过的Lacz-AtU3d，AtU3d，AtU3b，AtU6-1，AtU6-29五个质粒与各所对应接头连接反应，室温(20-28℃)连接约10-15min，质粒与各所对应接头见表4，连接反应体系见表5。

表4质粒与各所对应接头

表5表达盒连接反应体系

3、扩增sgRNA表达盒片段。做2轮巢式PCR，第一轮PCR做2个反应，分别用U-F/接头反向引物，和用接头正向引物/gR-R；第二轮为Overlapping PCR,用位置特异引物扩增出表达盒产物。所用引物序列见表6，第一轮PCR反应体系见表7，反应程序见表8。第一轮反应结束后，将反应1和反应2的产物各取1μl加入到8μl ddH2O混合稀释，涡旋震动混匀。第二轮PCR，sgRNA表达盒特定位置引物对的使用方法：Pps-GGL/Pgs-GG2(PT1),Pps-GG2/Pgs-GG3(PT2),Pps-GG3/Pgs-GG4(PT3),Pps-GG4/Pgs-GG5(PT4)，Pps-GG5/Pgs-GGR(PT5R)，扩增相应的U#-T1-gRNA,U#-T2-gRNA,U#-T3-gRNA,U#-T4-gRNA,U#-T5-gRNA。先将各引物用ddH2O溶解成10μM母液。将Pps-GGL和Pgs-GG2引物各取1.5μl加入到7μl ddH2O混合稀释到1.5μM，涡旋震动混匀,命名为PT1。PT2，PT3，PT4，PT5R依次配置；反应体系见表9，程序见表10。

表6巢式PCR引物序列

表7第一轮PCR反应体系

表8第一轮PCR反应程序

表9第二轮反应体系

成分	加入量
		U#-T-gRNA	2ul
引物组合PT	3ul
		2mM dNTP	2μl
10*KOD Buffer	15μl
		KOD polymerase	0.3μl
ddH2O	7.7μl
		total	30μl

表10第二轮反应程序

4、巢式PCR产物纯化。将第二轮反应的五个产物混合，用北京全式金生物技术公司的EasyPure Quick Gel Extraction Kit对PCR产物进行纯化；用分光光度计测其浓度，为25ng/μl，试验需用75ng，相当于3μl。

5、双元载体与sgRNA表达盒的酶切连接反应。反应体系见表11，反应程序见表12。

表11双元载体与sgRNA表达盒的酶切连接反应体系

成分	体积	终浓度(量)
			10×T4 DNA ligase Buffer	1.5μl	1×
PYLCRISPR/CAS9 35S-H	4ul	80ng
			巢式PCR产物	3ul	75ng
Bas1	1μl	10U
			T4 DNA ligase(NEB)(400U/ul)	0.1μl	35U
ddH2O	补足到15μl
			Total	15μl

表12双元载体与sgRNA表达盒的酶切连接反应程序

6、连接产物转大肠杆菌测序确定，操作步骤如下：

a.取50μl冰浴上融化的Trans1-T1 Phage Resistant Chemically CompetentCell感受态细胞，加入10μl的连接产物,轻轻混匀，在冰浴中放置30分钟。

b.42℃水浴热激30秒，然后快速将管转移到冰浴中2分钟，该过程不要摇动离心管。

c.向每个离心管中加入500μl无菌液体LB培养基(不含抗生素)，混匀后置于37℃摇床，200rpm培养1小时，使细菌复苏。

d.吸取50μl已转化的感受态细胞加到含LB(25g/L)琼脂培养基上，将细胞均匀涂开。将平板置于37℃至液体被吸收，倒置平板，37℃过夜培养。

e.挑取单克隆，PCR阳性鉴定，体系，程序及引物如下：

PB-L：GCGCGCgGTctcGCTCGACTAGTATGG(见SEQ ID NO：31所示)

PB-R：GCGCGCggtctcTACCGACGCGTATCC(见SEQ ID NO：32所示)

表13 PCR阳性鉴定体系及程序

f.选取阳性克隆测序，确定pBnSAD1质粒无突变，可以用于后续试验。

7、将构建好的载体转入农杆菌GV3101电转感受态细胞。具体步骤如下：取一管50μl GV3101电转感受态细胞置于冰上，溶化后加入0.1μg构建好的载体质粒并用移液器轻轻吸打混匀；将含有载体质粒的感受态用移液器吸入冰上预冷的电转杯中，使用Gene pulser电转仪(购自Bio-Rad公司)在1800V电压下电击6ms；向电转杯中加入500μl液体LB混匀后将菌液转到2mL离心管中，28℃摇床中150rpm培养2hrs；取100μl菌液铺固体LB平皿(含庆大霉素25μg/ml和卡那霉素50μg/ml)，吹干后28℃培养箱中培养2-3天；挑取菌斑进行PCR检测，体系和反应程序同6-e，阳性克隆进行摇菌分装于-80℃保存或直接用于植物转化，得到pBnSAD1载体农杆菌菌株。

三、pBnSAD1载体下胚轴遗传转化

(1)灭菌

a.用75％酒精浸泡甲9707成熟晒干种子1min。

b.将洗好的种子转入无菌容器(培养盒)中，把酒精倒入废液缸，并加入适量的消毒液(84消毒液浓度无菌水:84液＝1:1)，灭菌时间为10-15min。

c.消毒后，将消毒液倒入废液缸，用无菌水(50ml左右)冲洗种子4-5遍。

(2)播种

a.用无菌镊子将灭菌好的种子播到M0，每皿10-12粒。

b.将培养皿放到无菌培养盒中，置暗光24℃下培养6天。

(3)摇菌

播种4-5天后用LB液体培养基(Kanamycin 50mg/L+Gentamicin25mg/L)培养pBnSAD1载体农杆菌菌株。在28℃，180-220rpm摇床中培养约15个小时左右。测培养后菌液的OD值，一般为0.4左右较好(用无菌三角瓶或离心管，一般配两个浓度的菌液10/15μl菌液+4ml的LB)。

(4)外植体的制备及浸染

a.准备菌液，吸取2ml培养好的菌株于无菌的2ml的离心管中，在离心机以每分钟6000转离心3min，倒掉上清；用与菌液相同体积的DM(加AS)重新悬浮一次，再在同样的条件下离心，弃上清后，再用相同体积DM(加AS)悬浮。将悬浮后的菌液用18ml的DM稀释(在灭菌培养皿中进行)。

b.剪切外植体，用无菌镊子和解剖刀切取播种6天后幼苗下胚轴，每个长度为0.8-1.0cm。在M1液体培养基中切取效果更佳，切取外植体时尽量一刀垂直切下。

c.将切好的外植体放到已经配制好浓度菌液的培养皿中，浸染15min(时间不能过长，避免外植体失水严重死亡或后期农杆菌抑制不住)，隔段时间摇晃一次，还差3min时吸去菌液。浸染时以每皿(20ml菌液)150-200个外植体较合适。

(5)将浸染后的将侵染后的外植体用灭菌后的滤纸吸干，再用镊子转到M1培养基中，每皿50-60个外植体暗光下24℃培养2天后转入M2中，24℃白光16h/暗光8h培养。

(6)20天后转到M3中，每20天继代一次，直至出现绿芽。

转入M4生根，生根时间需2-4周。长根后将小苗移栽到温室穴盘中，前期需要覆盖塑料膜防止过度失水，一周以后可以将膜揭开。最后根据气候移至大田生长。

四、获得突变体植株

(1)用CTAB方法提取植株叶片DNA，用载体上特有的序列引物扩增进行阳性检测，产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测。反应体系在PCR扩增仪上进行，PCR扩增反应体系如下：

表14突变体植株PCR阳性鉴定体系及程序

引物序列如下(5’-3’)：

PB-L：GCGCGCgGTctcGCTCGACTAGTATGG(见SEQ ID NO：31所示)

T1-R：AAACGATCTTCAAACCCATCGGA(见SEQ ID NO：10所示)检测结果如下图1，CK1为阳性对照，CK2为阴性对照。

(2)编辑检测。对检测出来的阳性单株采用15％非变性PAGE胶进行编辑检测，根据多态性来判断是否发生编辑。反应体系在PCR扩增仪上进行，PCR扩增反应体系及引物如下，部分结果见图2：

表15阳性单株PCR鉴定体系及程序

表16 PAGE检测拷贝及对应引物

(3)挑选PAGE结果中有多态性的单株TA克隆测序验证，步骤如下:PCR产物的制备：

a.于灭菌PCR管中配制如下反应体系,分别扩增,扩增引物见表17：

表17 PCR反应体系

上述PCR程序设置为98℃变性3min；98℃ 15sec，59℃ 15sec，72℃ 30sec，34个循环；72℃ 5min；25℃ 10min。

表18扩增引物

b.吸取4ul PCR产物进行水平胶检测产物的质量。如果扩增产物有多条带建议凝胶回收目的片段。

c.之后参照PEASY-Blunt Simple Cloning kit试剂盒说明书将目的基因片段连入PEASY-Blunt载体中，构建测序中间载体，交由测序公司测序。

克隆反应

a.在微型离心管中依次加入PEASY-Blunt Simple cloning Vector 1ul，PCR产物4μl(根据PCR产物量可适当增减，最多不超过4μl)，轻轻混合，室温(27℃-37℃)反应5分钟，反应结束后将离心管置于冰上。

b.加连接产物于50ul Trans1-T1感受态细胞中(在感受态细胞刚刚解冻时加入连接产物)，轻轻混匀，冰浴20-30分钟后，42℃水浴热击30秒，立即置于冰上2分钟。加入250μl平衡至室温的LB培养基，200rpm，37℃培养1小时。吸摇好的菌液50μl(依据连接片段长度大小而定)均匀的涂在含50μg/m L Kan抗性的LB平板上，在37℃培养箱中过夜培养(为了得到较多克隆，4000rpm离心1min，弃掉部分上清，保留100-150μl，轻弹悬浮菌体，取全部菌液涂板)。

菌液PCR鉴定阳性克隆：

a.挑选白色单克隆至10ul无菌水中，涡旋混合。

取2ul混合液于20ul PCR体系，用M13F/M13R通用引物扩增，PCR程序设置为94℃变性6min；94℃ 30sec，59℃ 30sec，72℃30 sec，35个循环；72℃ 10min；25℃ 10min。1％琼脂糖凝胶电泳鉴定阳性克隆。

b.挑取阳性克隆菌液进行测序。用M13F/M13R通用引物测序。测序结束后用sequencher把测序结果与野生型对应的序列分析进行比对分析。

(4)获得突变植株

对BnSAD1基因在T0代株阳性植株中编辑检测后得到突变单株。

实施例3油菜突变体植株种子硬脂酸含量测定

将实施例2中获得的突变体植株自交加代，得到纯合突变体植株。按如下步骤测定突变体种子硬脂酸含量。

样品的制备：

a.每个株系挑选3个单株，每个单株随机挑选25粒左右的饱满的种子，用研钵磨碎至粉末装入10mL的试管中，野生型甲9707种子选取同上。

b.分别加入1mL无水乙醚：石油醚(1:1)混合液以及等体积的氢氧化钾-甲醇溶液(0.5mol/L)(500ml甲醛+11.2g氢氧化钾)，室温静止60min。

c.加超纯水定容至10mL，放置10min，取500μL-600μL至进样瓶中，待测定。

d.在安捷伦公司生产的自动进样气相色谱仪上直接运行程序。

气相色谱仪参数设置：安捷伦HP7890A，检测器为氢火焰离子化检测器，自动进样1μL，分流比设置为1:45，检测器温度为250℃，进样室温度为280℃，载气为N2，流速30mL/min，尾吹为40mL/min，H2速度为30mL/min，空气流速为300mL/min，炉温设置为持续升温，180℃保持2min，然后10℃/min升至220℃保持7min。脂肪酸成分由各脂肪酸气化后的出峰时间和标准脂肪酸出峰时间对比确定，用峰面积百分比表示脂肪酸含量。

结果表明，在pBnSAD1突变体中，硬脂酸含量最高达到9.4％±1.4％，最低为2.9％±0.1％，相同条件下的野生型材料甲9707硬脂酸含量为2.1％±0.3％，增幅最高达到428.6％，最低为38.1％，达到显著性差异(图3)。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 华中农业大学

<120> 一种获得高硬脂酸油菜的方法

<160> 45

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1206

<212> DNA

<213> 拟南芥fab2(Arabidopsis thaliana)

<400> 1

atggctctaa agtttaaccc tttggtggca tctcagcctt acaaattccc ttcctcgact 60

cgtccgccaa ctccttcttt cagatctccc aagttcctct gcctcgcttc ttcttctccg 120

gctctcagct ccggccccaa gtcagttgag agtttgaaga aaccatttac gccacccagg 180

gaagtgcatg ttcaagtctt gcactccatg ccacctcaaa agatcgagat cttcaaatct 240

atggaaaact gggccgagga gaaccttctg attcacctca aggatgtgga gaagtcttgg 300

caaccccagg atttcttgcc tgaccctgca tcagatgggt ttgaagatca ggtaagagag 360

ttaagagaga gggctagaga gctccctgat gattactttg ttgttttggt gggggacatg 420

atcacagaag aagcacttcc gacctatcaa actatgttga acactttgga tggagttagg 480

gatgaaacag gtgctagtcc tacttcatgg gctatttgga ccagagcttg gactgcagaa 540

gaaaaccgac atggcgatct tctgaataaa tacctttact tgtctggtcg tgttgacatg 600

aggcagatcg aaaagaccat tcagtacttg attggatctg gaatggatcc gcggacagag 660

aataacccct accttggctt catctatacg tcattccaag aaagagcgac attcatctct 720

cacggaaaca cagcccgcca agccaaagag cacggggaca tcaaactagc ccaaatatgt 780

ggcacaatag ctgcagacga gaagcgtcat gaaacagcat acaccaagat agttgaaaag 840

ctctttgaga ttgatcctga tggtactgtc atggcttttg cagacatgat gagaaagaaa 900

atctcaatgc ctgctcactt gatgtatgat gggcgcaacg acaacctctt tgacaacttc 960

tcttccgtgg ctcagaggct cggtgtttac accgccaaag actatgcaga cattcttgag 1020

tttctggttg gtaggtggaa aatccaggac ttaaccgggc tttcaggtga aggaaacaaa 1080

gcacaagact atttatgcgg gttggctcca aggatcaaga gattggatga gagagctcaa 1140

gcaagagcca agaaaggacc caagattcct ttcagttgga tacacgacag agaagtgcag 1200

ctctaa 1206

<210> 2

<211> 2750

<212> DNA

<213> 甘蓝型油菜BnSAD1.A3(Brassica napus)

<400> 2

ataaagctat tctctattct gtggacgaaa ctcaaccttt aaaaaggagt ccaaccagag 60

aacgagagcc agagatagtg tgagagcatt agccttacag agagagagag agagagagag 120

agcttgtctc tgaaagaatc cacaaatggc attgaagctt aaccctttgg catctcagcc 180

ttacaacttc ccttcctcgg ctcgtccgcc aatctctact ttcagatctc ccaagttcct 240

ctgcctcgct tcttcttctc ccgctctcag ctccaagtct ctctctctct tgtttcgttt 300

actaatataa gagatttggt tccttgtttc attatgtttc tgggttcttg cttgattgtc 360

gattatggat cttgatctta ttgattctag cgtagtcttg tttactcaca ttggcttttt 420

aatctatcaa atggatgtgc tttttttcaa tctgggaata gtgattaaag atggggccag 480

cctctgatat tctctgtttc tcaggccatt gattcattta atgctttcat tctcttatta 540

cacaatcatc atagcattct gagattgctc cattgtataa agtctttgcc tttaccatca 600

taatcattct gtttagatta acaacatttg ctaatgatct tttagattcc ttaagagtca 660

ttaaagaatg tgactttcaa ctagcttctt gactcaaatc ctgttcttcc ccgttgttca 720

aattttcaac tttttatgtt tttgtttata tttgattttg aaatgcatgt ccacttgttg 780

cttactcctt tgatggtttt ttttttttat ttctatgcat tgagaagaga ttcttgtaac 840

gtataacttt acgtcttatt ctttcttctt aagtgagaat acaacttgcg tctatgcatg 900

cgtacttcgt ggcctcctct ctctatagtt tacgtccaaa atgttctttg atttgtttac 960

tcttttttgc ctttttatct tgtctctatc tcatcttgtc tctctacctt tcacttcctc 1020

caagtttttt ttttttgctt cacattgcta agtgaatatt gaactgcaag attgattcat 1080

atattcatat atgtaacatc tatgtgacat gatgaatgtt tatccaaatg tgttcttgtc 1140

tcatctcact atatgctgat gatgatgcct ttcttttttt tattggtgca gggaggttga 1200

gagtttgaag aagccattca caccacctaa ggaagtgcac gttcaagtcc tgcattccat 1260

gccaccccag aagatcgaga tcttcaaatc catggaagac tgggccgagc agaaccttct 1320

aactcagctc aaagacgtgg agaagtcgtg gcagccccag gacttcttac ccgaccctgc 1380

atccgatggg tttgaagatc aggtaagaga gttaagagaa agagcaagag aactccctga 1440

tgattacttc gttgttctgg tgggagacat gatcacggaa gaagcgcttc cgacctatca 1500

aaccatgctg aacactttgg atggagtgag ggatgaaact ggcgctagcc ccacttcatg 1560

ggctatttgg acaagagctt ggactgcgga agagaaccga cacggtgatc ttctcaataa 1620

gtatctttac ttgtctggac gtgttgacat gaggcagatt gaaaagacca ttcagtactt 1680

gattggttct ggaatggtaa gagagactaa tcataatcta tttcttaaca tgacttccta 1740

atcagttcta acttctatgt cacaggatcc tagaacagag aacaatcctt acctcggctt 1800

cattctattt cttaacatga cttcctaatc agttctaact tctatgtcac aggatcctag 1860

aacagagaac aatccttacc tcggcttcat ctacacttca ttccaagaaa gagccacctt 1920

catctctcac ggaaacacag ctcgccaagc caaagagcac ggagacctca agctagccca 1980

aatctgcggc acaatagctg cagacgagaa gcgtcatgag acagcttaca ccaagatagt 2040

tgagaagctc tttgagattg atcctgatgg tactgtgatg gcgtttgcag acatgatgag 2100

gaagaaaatc tcgatgcctg ctcacttgat gtacgatggg cgcgatgaaa gcctctttga 2160

caacttctct tccgtggctc agaggctcgg tgtgtacact gctaaagact atgcggacat 2220

tcttgagttt ttggttggga ggtggaagat tgagagctta accgggcttt caggtgaagg 2280

aaacaaagcg caagagtact tgtgtgggtt gactccgaga atcaggaggt tggatgagag 2340

agctcaagca agagccaaga aaggacccaa ggttcctttc agctggatac atgacagaga 2400

agtgcagctc taaaaaagga acaaagcttt aaaacctttt cactctccat tccccatttg 2460

atctgtctgc tcttgaaatt ggtgtagatt actatggttt gtgataatgt tcgtgggtct 2520

agttacaaag ttgagaagca gtgatttagt agctttgttg tttccagtct ttatatgttt 2580

ttgtgtttgg tccctttagt aaacttgttg tagttaaatc agttgaactg tctggtctgt 2640

actcagtttt cactgtggag ttttgtttca gtttgaggtt agtttcattg cagagagaac 2700

ttctttatcc attaatatga aacttgcttc aaggtatggc taacttgtag 2750

<210> 3

<211> 2665

<212> DNA

<213> 甘蓝型油菜BnSAD1.C3(Brassica napus)

<400> 3

gccgctgttt attcatctat tctgtggacg aaactcaacc tttaaaaagg agtccaacca 60

gagatagtgt gagagcatta gccttagaga gagagagaga gagctcgctt gtctctgaaa 120

gaatccacaa atggcattga agcttaacaa ccctttggca tctcagcctt acaacttccc 180

ttcctcggct cgtccgccaa tctctacttt cagatctccc aagttcctct gcctcgcttc 240

ttcttctccc gctctcagct ccaagtctgt ctcttcccct ctctctctct ccctcttgtt 300

taaggatgag atgtggttcc ttgtttcact gtgtttctgg gttcttgctt gcttgtcgat 360

ttcggatctt gattttcttg attctagcgt ggtcttgatt actcacattg gattaatcta 420

tcaaatggat gtgctttttt caatctggga atagtgatta aagatggggc cagcctctga 480

tattctctgt ttctcaggcc attgattcat ttaatgcttt cattctctta ttacacatca 540

tcatagcatt ctgagattgc tccatgtata aagtctttgc ctttaccatc ataatcattc 600

tgttaagatt aacaacattt gctaatgatc tttagattcc ttaagagtca ttaaagaatc 660

tgactttcaa ctagcttctt tactcaaatc ctgttcttcc ccccttgccc aaattttcaa 720

cttttgatgt ttttttttat tttctgtgca ttgagaggag attcttgaaa cgtgtcactt 780

ttcgtctgtt ttctttcttc ttaagtgaga atacaacttg cgtctatgca tgcgtacttc 840

gtggcctcct ctctctatag tttacgtcca aaatgtcctt tgatttgttt actctttttt 900

tgccttttta tcttgtctct atctgatctt tatctcttgt ctcttgtctc tacctttcac 960

cccctgcaag tttttttttt tttgcttcac attgccaagt gaatattgaa ctgcaagatg 1020

gattcataga tgcatatata acatctgttt agagatgtag acatgaatgt ttatccaaat 1080

gtgttcttgt ctcatctgtg tgcatcagaa ataagacctt tcatgtttgt ttcaatgaag 1140

tataactata tgctgatgat gcctctcttt tcttattatt gatgcaggga ggttgagagt 1200

ttgaagaagc cattcacacc accaaaggaa gtgcacgttc aagtcttgca ctccatgcca 1260

ccccagaaga tcgagatctt caaatccatg gaagactggg ccgagcagaa ccttctaact 1320

catctcaaag acgtggagaa gtcgtggcag ccccaggact tcttaccgga ccctgcatcc 1380

gatgggtttg aagatcaggt aagagagcta agagagaggg caagagagct ccctgatgat 1440

tacttcgttg ttcttgtggg agacatgatc acagaagaag cgcttccgac ctatcaaacc 1500

atgctgaaca ctttggatgg agtgagagat gaaactggtg ctagccccac ttcatgggct 1560

atttggacaa gagcttggac tgcagaagag aaccgacatg gtgatctttt gaataagtat 1620

ctttacttgt ctggccgtgt tgacatgagg cagattgaaa agaccattca gtacttgatt 1680

ggttcaggaa tggtaagaga gagactaatc ataatccatt tcttaacatg acttcctaat 1740

cagtacttaa cttctatgtc acaggatcct agaacagaga acaatcctta ccttggcttt 1800

atctacactt cattccaaga aagagccacc ttcatctctc acggaaacac agctcgccaa 1860

gccaaagagc acggagacct caagctagcc caaatctgcg gcacaatagc tgcagacgag 1920

aagcgtcatg agacagctta caccaagata gttgagaagc tctttgagat tgatcctgat 1980

ggtactgtgg tggcgtttgc agacatgatg aggaagaaaa tctcgatgcc tgctcacttg 2040

atgtacgatg ggcgcgatga aagcctcttt gacaacttct cttccgtggc tcagaggctc 2100

ggtgtgtaca ctgctaaaga ctatgcggac attcttgagt ttttggttgg gaggtggaag 2160

attgagaact taaccgggct ttcgggtgaa ggaaacaaag cgcaagacta cttgtgcggg 2220

ttgactccga gaatcaggag gctggatgag agagctcaag caagagccaa gaaaggaccc 2280

aaggttcctt tcagctggat acacgacaga gaagtgcagc tctaaaaagg aacaaagctt 2340

taaaaacctt ttcactctcc gtcgttcctc atttgatctg tctgctcttg aaattggtgt 2400

agattactat ggtttgtgat aatgttcgtg ggtctagtta caaagttgag aagcagtgat 2460

ttagtagctt tgttgtttcc agcctttata tgtttttgtg tttggtccct ttagtaaact 2520

tgttgtagtt aaatcagttg aactgtctgg tctgtactca gttttcactg tggagttttg 2580

tttcagtttg aggttagttt cattgcagag agaacttact tatccattaa tatgaaactt 2640

gcttcaaggt atggctaact tgtag 2665

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 靶点序列T1(Brassica napus)

<400> 4

atccgatggg tttgaagatc agg 23

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 靶点序列T2(Brassica napus)

<400> 5

aacgccacca cagtaccatc agg 23

<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> 靶点序列T3(Brassica napus)

<400> 6

tctggtggga gacatgatca cgg 23

<210> 7

<211> 23

<212> DNA

<213> 靶点序列T4(Brassica napus)

<400> 7

gtttccgtga gagatgaagg tgg 23

<210> 8

<211> 23

<212> DNA

<213> 靶点序列T5(Brassica napus)

<400> 8

tccatccaaa gtgttcagca tgg 23

<210> 9

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(T1-F)

<400> 9

gtcatccgat gggtttgaag atc 23

<210> 10

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(T1-R)

<400> 10

aaacgatctt caaacccatc gga 23

<210> 11

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(T2-F)

<400> 11

gtcaacgcca ccacagtacc atc 23

<210> 12

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(T2-R)

<400> 12

aaacgatggt actgtggtgg cgt 23

<210> 13

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(T3-F)

<400> 13

gtcatctggt gggagacatg atca 24

<210> 14

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(T3-R)

<400> 14

aaactgatca tgtctcccac caga 24

<210> 15

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(T4-F)

<400> 15

attgtttccg tgagagatga agg 23

<210> 16

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(T4-R)

<400> 16

aaacccttca tctctcacgg aaa 23

<210> 17

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(T5-F)

<400> 17

attgtccatc caaagtgttc agca 24

<210> 18

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(T5-R)

<400> 18

aaactgctga acactttgga tgga 24

<210> 19

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(U-F)

<400> 19

ctccgtttta cctgtggaat cg 22

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(gR-R)

<400> 20

cggaggaaaa ttccatccac 20

<210> 21

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Pps-GGL)

<400> 21

ttcagaggtc tctctcgact agtatggaat cggcagcaaa gg 42

<210> 22

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Pgs-GG2)

<400> 22

agcgtgggtc tcgtcagggt ccatccactc caagctc 37

<210> 23

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Pps-GG2)

<400> 23

ttcagaggtc tctctgacac tggaatcggc agcaaagg 38

<210> 24

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Pgs-GG3)

<400> 24

agcgtgggtc tcgtcttcac tccatccact ccaagctc 38

<210> 25

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Pps-GG3)

<400> 25

ttcagaggtc tctaagactt tggaatcggc agcaaagg 38

<210> 26

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Pgs-GG4)

<400> 26

agcgtgggtc tcgagtcctt tccatccact ccaagctc 38

<210> 27

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Pps-GG4)

<400> 27

ttcagaggtc tctgactaca tggaatcggc agcaaagg 38

<210> 28

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Pgs-GG5)

<400> 28

agcgtgggtc tcggtccaca tccatccact ccaagctc 38

<210> 29

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Pps-GG5)

<400> 29

ttcagaggtc tctggacttg tggaatcggc agcaaagg 38

<210> 30

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Pgs-GGR)

<400> 30

agcgtgggtc tcgaccgacg cgtatccatc cactccaagc tc 42

<210> 31

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(PB-L)

<400> 31

gcgcgcggtc tcgctcgact agtatgg 27

<210> 32

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(PB-R)

<400> 32

gcgcgcggtc tctaccgacg cgtatcc 27

<210> 33

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(BP137-F)

<400> 33

aagacgtgga gaagtcgtgg 20

<210> 34

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(BP137-R)

<400> 34

tgagaagatc accgtgtcgg 20

<210> 35

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(BP138-F1)

<400> 35

acctcggctt catctacact t 21

<210> 36

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(BP138-R1)

<400> 36

tcatgtctgc aaacgccatc 20

<210> 37

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(BP141-R)

<400> 37

ggaaccttgg gtcctttc 18

<210> 38

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(BP142-F)

<400> 38

gacttcttac cggaccctgc 20

<210> 39

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(BP142-R)

<400> 39

tcaaaagatc accatgtcgg t 21

<210> 40

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(BP143-F)

<400> 40

agagaacaat ccttaccttg gc 22

<210> 41

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(BP143-R)

<400> 41

cgtacatcaa gtgagcaggc 20

<210> 42

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(BP139-F)

<400> 42

ctatgtgaca tgatgaatgt ttatcc 26

<210> 43

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(BP139-R)

<400> 43

aatggggaat ggagagtg 18

<210> 44

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(BP144-F)

<400> 44

ctgtttagag atgtagacat gaatg 25

<210> 45

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(BP144-R)

<400> 45

agcctcctga ttctcggagt 20

Claims

1.一种获得高硬脂酸油菜的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S2，构建五靶点基因编辑载体pBnSAD1载体；

2.根据权利要求1所述的一种获得高硬脂酸油菜的方法，其特征在于，所述五个碱基位点的靶点序列(5＇-3＇)分别见SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQID NO：8。

3.根据权利要求1所述的一种获得高硬脂酸油菜的方法，其特征在于，所述靶点序列的引物序列分别见SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：137、SEQ ID NO：18。

4.根据权利要求1所述的一种获得高硬脂酸油菜的方法，其特征在于，所述BnSAD1.A3拷贝的碱基序列如SEQ ID NO：2所示；所述BnSAD1.C3拷贝的碱基序列如SEQ ID NO：3所示。

5.根据权利要求1所述的一种获得高硬脂酸油菜的方法，其特征在于，步骤S2中构建五靶点基因编辑载体pBnSAD1载体的步骤包括：

a、靶点接头制备；

b、靶点接头引物与sgRNA表达盒的连接和扩增；

c、靶标sgRNA表达盒与pYLCRISPR/Cas9载体的连接；

d、转化大肠杆菌，挑选阳性克隆，测序验证，得到最终载体；

6.根据权利要求1所述的一种获得高硬脂酸油菜的方法，其特征在于，所述BnSAD1.A3和BnSAD1.C3基因是根据拟南芥fab2基因进行基因家族分析得到的。

7.如权利要求1-7任一项权利要求所述的获得高硬脂酸油菜的方法在油菜育种中的应用。