CN110981834A

CN110981834A - 一种一氧化氮前体化合物的制备方法及其安全性评价

Info

Publication number: CN110981834A
Application number: CN201911333018.2A
Authority: CN
Inventors: 陈胜昔
Original assignee: Hangzhou Jinchi Medical Instrument Co ltd
Current assignee: Hangzhou Jinchi Medical Instrument Co ltd
Priority date: 2019-12-20
Filing date: 2019-12-20
Publication date: 2020-04-10

Abstract

本发明公开了一种新的一氧化氮前体化合物的制备及应用。所述化合物内含4个一氧化氮分子，在细胞内可分解释放出高达4分子一氧化氮。同时所述化合物对细胞的毒性非常低。作为一个安全高效的一氧化氮前体化合物，所述化合物可用于舒张血管、降低血压、治疗勃起功能障碍、缓解类风湿关节炎疼痛、治疗糖尿病、增加美容健美效果等多种临床症状。本发明公开了一个新的一氧化氮前体化合物的结构，提高了一氧化氮转运和释放的效率。

Description

一种一氧化氮前体化合物的制备方法及其安全性评价

技术领域

本发明涉及一种一氧化氮前体化合物的制备方法和安全性评价，具体而言涉及在苯二亚甲基二哌嗪分子中键合四分子一氧化氮生成一氧化氮前体化合物或其类似物。

背景技术

研究背景：

一氧化氮(NO)是由一个氧原子和一个氮原子组成的无色无味化合物。常温、常压下为一种有毒气体。然而，微量的一氧化氮分子在生物体内是一种必不可少的信使分子。在正常情况下，人的血管内皮细胞在一氧化氮合成酶(NOS)的作用下可产生一氧化氮信使分子。它可以快速渗透出细胞膜向外扩散，从而进入平滑肌细胞，使平滑肌细胞松弛，舒张血管，最终降低血压。另外，一氧化氮分子也会渗透出细胞膜进入血小板细胞，降低血小板活性，阻止血栓的形成，从而降低动脉粥样硬化发生的几率。因此一氧化氮前体药物在心脑血管疾病的防治方面发挥着重要的作用。

近些年，关于枸橼酸西地那非的大量研究使人们认识到阴茎海绵体内一氧化氮信使分子的释放可使海绵体内血管平滑肌松弛，导致血液充盈。因此，一氧化氮前体药物也可用于治疗或改善勃起功能障碍。另外，一氧化氮分子也可以激活免疫反应，促进胶原蛋白的合成、调节多种生理功能。

然而，一氧化氮分子在体内很不稳定，生物半衰期约为3-5s左右。因此一氧化氮分子本身不能作为药物使用，必须以前体药物的形式使用，如硝酸甘油等。一分子硝酸甘油在线粒体醛脱氢酶的催化下产生一分子的一氧化氮，其一氧化氮的转化效率较低。近些年报道了一个含二分子一氧化氮的化合物，JS-K。该化合物在细胞内可释放两个一氧化氮分子，对多种肿瘤细胞均有显著的抑制活性。该化合物已完成了一期临床实验。但由于其对多种细胞均有杀伤作用，毒性比较大，因此其并不适用于一氧化氮前体药物。

因此开发一种高效、低毒的一氧化氮前体化合物，从而提高其生物利用度并其降低毒性，将会极大的提高其药用价值。

发明内容

本发明的目的是设计并制备一系列如图1所示的化合物及其衍生物。并就其有效性和细胞安全性进行评价。

为了实现上述目的，本发明的第一方面，提供一系列通式(I)所示的一氧化氮前体化合物及其在药学上可接受的盐，所述化合物包含4分子一氧化氮分子，两个2，4-二硝基保护基和一个二亚甲基苯基链接基团。

进一步的，所述二亚甲基苯基链接基团可以为二亚甲基联苯基团、二亚甲基并苯基团等芳香烃或其衍生物。

本发明的第二方面，提供一种由所述的一氧化氮前体化合物和类似物制成的药物复合物及其在药学上可接受的盐作为药学活性成分制备的药物复合物，单独或结合一种或几种药学上可接受的、惰性的、无毒的赋形剂或载体。

本发明的第三方面，提供一种由所述的一氧化氮前体化合物和类似物制成的药物剂型，所述药物剂型包括散剂、片剂、颗粒剂、胶囊剂、溶液剂、乳剂、混悬剂、注射剂、冻干粉针剂。

本发明的第四方面，提供制备以上所述的一氧化氮前体化合物和其类似物的方法，包括下列步骤：

以1，1’-(1，4-苯-二亚甲基)-二哌嗪(2)为原料合成中间体1，1’-(1，4-苯-二亚甲基)-二哌嗪-一氧化氮钠盐(3)；

以中间体3为原料合成一氧化氮前体化合物1。

本发明的第五方面，提供以上所述的一氧化氮前体化合物和类似物制成的药物复合物及其在药学上可接受的盐在一氧化氮释放和细胞安全性方面的应用。

在本发明实施例中，所述化合物1可以释放4倍摩尔比的一氧化氮分子。所述化合物1对前列腺癌细胞DU145的抑制作用不明显，远低于对照化合物JS-K的细胞毒性。

附图说明

构成本发明的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解，使得本发明的其它特征、目的和优点变得更明显。本发明的示意性实施例附图及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

图1是一氧化氮前体化合物1的结构图示；

图2是一氧化氮前体化合物1的合成路线图示；

图3是一氧化氮前体化合物1的酶催化释放实验结果；以及

图4是一氧化氮前体化合物1对前列腺癌细胞的抑制活性的实验结果。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。

需要说明的是，本申请的说明书和权利要求书及上述附图中的术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含，例如，包含了一系列原料或步骤，不必限于清楚地列出的那些原料或步骤，而是可包括没有清楚地列出的或对于这些原料或步骤固有的其它原料或步骤。

如下给出以上所述的一氧化氮前体化合物的制备方法的具体实施方式：

实施例1：1，1’-(1，4-苯-二亚甲基)-二哌嗪-一氧化氮钠盐(3)的制备

称取82mg 1，1’-(1，4-苯-二亚甲基)-二哌嗪，溶于15mL甲醇-乙醚(1∶3)混合溶剂，加入0.78mL甲醇钠溶液(1M)。在高压反应瓶中通入NO气体(60psi)，在室温下反应24h。析出的白色固体用滤纸过滤，用无水乙醚洗涤，低压干燥，获得24.6mg(27％)1，1’-(1，4-苯-二亚甲基)-二哌嗪-一氧化氮钠盐(3)。该中间体没有进行进一步的纯化，直接用于下一步反应。

实施例2：一氧化氮前体化合物1的制备

实施例1获得的中间体3(24.6mg)加入1mL 5％NaHCO₃溶液，在冰浴中将20.8mg 2，4-二硝基氟苯溶于1mL 1，4-二噁烷，并将上述两个溶液缓慢混合。该反应在室温下搅拌过夜。然后加入5mL水，用10mL乙酸乙酯提取两次。有机相合并，用无水MgSO₄干燥，过滤后减压蒸馏。获得的粗品用硅胶柱纯化，用乙酸乙酯/甲醇(19∶1)洗脱。蒸除溶剂，得黄色固体产物8.1mg，产率20％。TLC R_f0.12(19∶1乙酸乙酯/甲醇)；¹H NMR(DMSO-d₆)δ1.45(s，18H)，2.38(t，8H，J＝4.8Hz)，3.42(8H，t，J＝5.2Hz)，3.49(s，4H)and 7.26(s，4H)，7.67(d，2H，J＝9.2Hz)，8.47(dd，1H，J＝9.2Hz and 2.8Hz)and 8.85(d，1H，J＝2.4Hz)；¹³C NMR(DMSO-d₆)δ52.6，53.0，62.2，117.4，122.3，129.1，129.3，136.5，137.0，141.8and 154.1.

实施例3：一氧化氮前体化合物1释放一氧化氮的测定

在100μL PBS，pH 7.4反应溶液中，加入1μM一氧化氮前体化合物1，1单位谷胱甘肽S-转移酶(GST)，50μM还原型谷胱甘肽(GSH)，和5μM NO荧光探针DAF-FM DA。用荧光光度计在室温下检测荧光强度。激发波长为495nm；检测波长为515nm；光栅宽度为2.5nm。用JS-K取代一氧化氮前体化合物1做为对照化合物。

实施例4：一氧化氮前体化合物1的细胞安全性测定

在37℃，5％CO₂培养箱中培养DU145前列腺癌细胞。培养液为RPMI 1640培养基，使用前加入10％胎牛血清(FBS)和1％抗生素-抗真菌混合抗生素。

收获指数生长的DU145前列腺癌细胞，将其铺在96孔板中，浓度为2×10⁴个细胞/孔。在37℃下孵育24小时后，用不同浓度的JS-K，和一氧化氮前体化合物1处理细胞72小时。然后向每个孔中加入20μL的MTT(5mg/mL)，将培养板在37℃下孵育2小时。弃去上清液，向各孔中加入100μL DMSO。15分钟后在490nm记录吸光度。通过下式获得细胞生长率：细胞生长率(％)＝OD处理×100％/OD空白对照。数据报告为三次独立实验的平均值，每次实验均为三次。

实验结果：根据图4所示的MTT实验结果，JS-K对DU145前列腺癌细胞的半数抑制浓度为6.2μM；一氧化氮前体化合物1在实验浓度下对DU145前列腺癌细胞几乎无显著抑制。

从实施例4的实验结果中，可以看出，所述的一氧化氮前体化合物1对细胞的生长安全性较高。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一系列如通式(1)所示的化合物及其衍生物。其特征在于，所述化合物包含4分子一氧化氮分子，两个2，4-二硝基保护基和一个二亚甲基苯基链接基团。

2.根据权利要求1所述的一氧化氮前体化合物的类似物及其在药学上可接受的盐，其特征在于，所述二亚甲基苯基链接基团可以为二亚甲基联苯基团、二亚甲基并苯基团等芳香烃或其衍生物。

3.根据权利要求1至2任意一项的式(1)所述的化合物或这些化合物所形成的在药学上可接受的盐作为药学活性成分制备的药物复合物，单独或结合一种或几种药学上可接受的、惰性的、无毒的赋形剂或载体。

4.根据权利要求1至2任意一项的式(1)所述的一氧化氮前体化合物和类似物及其在药学上可接受的盐为原料生成的药物剂型，其特征在于，所述药物剂型包括散剂、片剂、颗粒剂、胶囊剂、溶液剂、乳剂、混悬剂、注射剂、冻干粉针剂。

5.根据权利要求1所述的一氧化氮前体化合物的制备方法。其特征在于，将1，1’-(1，4-苯-二亚甲基)-二哌嗪和一氧化氮气体加成并保护制备通式(I)化合物。

6.根据权利要求1至4中任一项所述的一氧化氮前体化合物、衍生物及其制剂在医疗保健中的应用。

7.根据权利要求6所述的医疗保健中的应用，其特征在于，所述应用为舒张血管、降低血压、治疗勃起功能障碍、缓解类风湿关节炎疼痛、治疗糖尿病、增加美容健美效果等。