CN110964070A

CN110964070A - 曲克芦丁的制备方法及其在美白护肤产品中的应用

Info

Publication number: CN110964070A
Application number: CN201911236273.5A
Authority: CN
Inventors: 彭冠杰; 何水莲
Original assignee: Guangzhou TLam Biological Technology Co ltd
Current assignee: Guangzhou TLam Biological Technology Co ltd
Priority date: 2019-12-05
Filing date: 2019-12-05
Publication date: 2020-04-07
Anticipated expiration: 2039-12-05
Also published as: CN110964070B

Abstract

本发明公开了曲克芦丁的制备方法及其在美白护肤产品中的应用。其中所述的曲克芦丁制备方法，包括粗品曲克芦丁的制备、芦丁的纯化、高纯度曲克芦丁的制备、精炼曲克芦丁等步骤。本发明的发明人发现曲克芦丁和蓝玉簪龙胆提取物在非常确定的范围内的比例组合，由于其显著的增效作用，得到的美白组合物具有明显改善的降低蓝光引起的肤色变黑的效果。

Description

曲克芦丁的制备方法及其在美白护肤产品中的应用

技术领域

本发明涉及化妆品领域，具体涉及一种曲克芦丁的制备方法及其在美白护肤产品中的应用。

背景技术

曲克芦丁具有抑制红细胞和血小板凝聚作用，防止血栓形成，同时能增加血中氧的含量，改善微循环，促进新血管生成以增进侧支循环。它对内皮细胞有保护作用，能对抗5-羟色胺和缓激肽引起的血管损伤，增加毛细血管的抵抗力，降低毛细血管的通透性，有防止因血管通透性升高而引起的水肿的作用，并有抗放射性损伤、抗炎症、抗过敏、抗溃疡等作用。

曲克芦丁的传统生产方法是以芦丁和2-氯乙醇或环氧乙烷为原料，强碱为催化剂，经乙酰化得到以三羟乙基芦丁为主的羟乙基芦丁混合物。但使用强碱催化剂，反应后期易引起水解、氧化等副反应，增加曲克芦丁的纯化难度。利用有机碱作催化剂，收率不高，工业化成本高。

光洁、白皙、红润的皮肤一直是东方女性所追求的，更是近年来我国及日本、东南亚等国妇女推崇的时尚，美白产品已经是化妆品市场最重要的品类之一。当前市场上的化妆品美白剂，大都以直接的抑制酪氨酸酶的活性为主，这种单一的抑制机理难以应付复杂的美白机制，使得这些美白产品的效果较差。

蓝光是可见光的一种，波长范围在380-500nm，是可见光中波长最短，能量最高的。太阳光是蓝光的主要来源，但也有许多人造的室内蓝光，如荧光灯，LED照明和手机、电视等。随着科技的发展，大量的LED照明产品以其节能、环保、寿命长、体积小等特点得以迅速发展，并逐步开始进入室内照明。在此背景下，人们对于 LED 照明产品的光生物辐射效应的关注与重视达到了前所未有的高度。

人们发现蓝光可以穿透角膜和晶状体并到达视网膜，过度的蓝光暴露可能会损伤视网膜中的光敏感细胞，严重的会带来视力下降，甚至失明。但是关于蓝光与美白之间的关联问题尚未有报道。

本发明的发明人在前面提到的美白化妆品领域中所进行的大量研究工作之后，出乎意料地发现了，曲克芦丁和蓝玉簪龙胆提取物在非常确定的范围内的比例组合，由于其显著的增效作用，得到的美白组合物具有明显改善的预防蓝光引起的肤色变黑的效果，从而完成了本发明。

发明内容

基于上述在生产曲克芦丁难以纯化、收率不高的技术问题，本发明提供曲克芦丁的制备方法，以及在美白护肤产品中的应用。

本发明的曲克芦丁制备方法，包括如下步骤：

（1）粗品芦丁的提取：称取槐米粉末，加入乙醇，加热，超声波处理；在搅拌下加入吐温20和硼砂；用石灰乳调至pH 8.5-9.5，趁热抽滤，得滤液，在室温下用浓盐酸调至pH 2.5-3.5，搅匀抽滤；蒸馏水洗至洗液呈中性，静置过夜，滤取沉淀并恒温干燥称重，得粗品芦丁；

（2）芦丁的纯化：将粗品芦丁加入吡啶中，搅拌至溶解，在冰水浴下缓慢滴入醋酐，65-75℃搅拌8-12h，将反应液滴入冷水中，乳白色颗粒析出，室温下静置析晶4-8h，抽滤；将滤饼用异丙醇加热至溶解，再缓慢降温析晶，抽滤；将滤饼溶于甲醇中，且缓慢滴加甲醇钠-甲醇溶液，溶液变浑浊，用冰乙酸调节pH至4.5-5.5，大量黄色沉淀析出，室温下静置，抽滤、真空干燥即得精制芦丁；

（3）高纯度曲克芦丁的制备：在高压釜中加入精制芦丁、乙二胺核心的PAMAM树枝状聚合物、甲醇、环氧乙烷，缓慢通入氮气以维持反应体系压强为0.1-0.3MPa，维持反应温度为75-85℃，HPLC监控反应，保温反应3-5ｈ，三羟乙基芦丁含量超过85％，立即降温终止反应，滴加盐酸调节反应液pH为4.0-5.0；加入活性炭加热回流0.5-1ｈ后，趁热过滤，将滤液冷却至5-10℃，搅拌结晶，呈浅黄色晶体，经过滤、真空干燥得到高纯度曲克芦丁；

（4）精炼曲克芦丁：将高纯度曲克芦丁加入无水甲醇，加热回流至完全溶解，加入针用活性炭，继续回流1-2ｈ后，趁热抽滤，将滤液降至室温静置析晶8-12h后，抽滤、干燥得到精炼曲克芦丁。

在其中一些实施例中，步骤（1）中所述槐米、乙醇、吐温20、硼砂的质量之比为1：（10-20）：（0.01-0.1）：（0.01-0.1）；所述加热的温度为50℃，所述超声波的频率为40 kHz，超声处理时间为30min。

在其中一些实施例中，步骤（2）中所述粗品芦丁、吡啶、醋酐、冷水的质量之比为1：（5-10）：（1-5）：（10-20）；所述冷水的温度为0~5℃。

在其中一些实施例中，步骤（3）中所述芦丁、PAMAM树枝状聚合物、甲醇、环氧乙烷的质量之比为（10-50）:1:（50-100）:（1-10）。

在其中一些实施例中，步骤（4）中所述高纯度曲克芦丁、无水甲醇、活性炭的质量之比为1:（10-20）：（1-5）。

本发明还提供了曲克芦丁的制备方法得到的曲克芦丁应用于美白护肤品中。

在其中一些实施例中，所述的曲克芦丁和蓝玉簪龙胆提取物组成美白组合物，所述的曲克芦丁和蓝玉簪龙胆提取物的质量之比为1：（1-10）。

本发明实施例提供的技术方案带来的有益效果是：

（1）本发明实施例所提供的曲克芦丁的生产方法制得了含量高于95%的曲克芦丁粉末，是以槐米为原料，3代PAMAM树枝状聚合物为催化剂能有效降低杂质含量和提高产品收率，配合甲醇溶剂和高压釜的使用缩短了实验路线和反应时间，适合工业化生产。

（2）槐花在我国多地广泛种植，不属于稀缺资源，且生长习性不苛刻，易栽培，来源广，故用槐花提取芦丁并不会造成恶劣的环境破坏，是可再生资源。从槐花米中提取芦丁并未使用禁用的有毒有害溶剂、催化剂，生产工艺简单，所用的溶剂、催化剂简单易得，并没产生有毒副作用的副反应，对环境友好。用芦丁酰化得到高纯曲克芦丁的制备过程，没有使用强碱催化剂，减少了反应后期易引起水解、氧化等副反应的情况，降低了曲克芦丁的纯化难度，减少了废液废料的特殊处理，对经济、环境更友好。

（3）本发明将曲克芦丁和蓝玉簪龙胆提取物在非常确定的范围内的比例组合，由于其显著的增效作用，得到的美白组合物具有吸收蓝光、降低蓝光引起的黑色素沉着的功效，以及预防蓝光对皮肤的损伤、变黑。

说明书附图

图1 曲克芦丁的蓝光吸收曲线；

图2 豚鼠蓝光照射图片；

图3 蓝光透光率测试图；

图4 美白测试图。

具体实施方式

说明书中的实施方式仅用于对本发明进行说明，其并不对本发明的保护范围起到限定作用。本发明的保护范围仅由权利要求限定，在本发明公开的实施方式的基础上所做的任何省略、替换或修改将落入本发明的保护范围。

参选以下本发明的优选实施方法的详述以及包括的实施例可更容易地理解本发明的内容。除非另有限定，本文使用的所有技术以及科学术语具有与本发明所属领域普通技术人员通常理解的相同的含义。当存在矛盾时，以本说明书中的定义为准。

如本文所用术语“由…制备”与“包含”同义。本文中所用的术语“包含”、“包括”、“具有”、“含有”或其任何其它变形，意在覆盖非排它性的包括。例如，包含所列要素的组合物、步骤、方法、制品或装置不必仅限于那些要素，而是可以包括未明确列出的其它要素或此种组合物、步骤、方法、制品或装置所固有的要素。

当量、浓度、或者其它值或参数以范围、优选范围、或一系列上限优选值和下限优选值限定的范围表示时，这应当被理解为具体公开了由任何范围上限或优选值与任何范围下限或优选值的任一配对所形成的所有范围，而不论该范围是否单独公开了。例如，当公开了范围“1至5”时，所描述的范围应被解释为包括范围“1至4”、“1至3”、“1至2”、“1至2和4至5”、“1至3和5”等。当数值范围在本文中被描述时，除非另外说明，否则该范围意图包括其端值和在该范围内的所有整数和分数。

此外，本发明要素或组分前的不定冠词“一种”和“一个”对要素或组分的数量要求(即出现次数)无限制性。因此“一个”或“一种”应被解读为包括一个或至少一个，并且单数形式的要素或组分也包括复数形式，除非所述数量明显旨指单数形式。

为了加深对本发明的理解，下面将结合实施例对本发明作进一步详述，该实施例仅用于解释本发明，并不构成对本发明保护范围的限定。

本发明所述的曲克芦丁的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）芦丁的提取：称取槐米粉末，加入乙醇，加热，超声波处理；在搅拌下加入吐温20和硼砂；用石灰乳调至pH8.5-9.5，趁热抽滤，得滤液，在室温下用浓盐酸调至pH 2.5-3.5，搅匀抽滤；蒸馏水洗至洗液呈中性，静置过夜，滤取沉淀并恒温干燥称重，得粗品芦丁；（2）芦丁的纯化：将粗品芦丁加入吡啶中，搅拌至溶解，在冰水浴下缓慢滴入醋酐，65-75℃搅拌8-12h，将反应液滴入冷水中，乳白色颗粒析出，室温下静置析晶4-8h，抽滤；将滤饼用异丙醇加热至溶解，再缓慢降温析晶，抽滤；将滤饼溶于甲醇中，且缓慢滴加甲醇钠-甲醇溶液，溶液变浑浊，用冰乙酸调节pH至4.5-5.5，大量黄色沉淀析出，室温下静置，抽滤、真空干燥即得精制芦丁；（3）高纯度曲克芦丁的制备：在高压釜中加入精制芦丁、乙二胺核心的PAMAM树枝状聚合物、甲醇、环氧乙烷，缓慢通入氮气以维持反应体系压强为0.1-0.3MPa，维持反应温度为75-85℃，HPLC监控反应，保温反应3-5ｈ，三羟乙基芦丁含量超过85％，立即降温终止反应，滴加盐酸调节反应液pH为4.0-5.0；加入活性炭加热回流0.5-1ｈ后，趁热过滤，将滤液冷却至5-10℃，搅拌结晶，呈浅黄色晶体，经过滤、真空干燥得到高纯度曲克芦丁；（4）精炼曲克芦丁：将高纯度曲克芦丁加入无水甲醇，加热回流至完全溶解，加入针用活性炭，继续回流1-2ｈ后，趁热抽滤，将滤液降至室温静置析晶8-12h后，抽滤、干燥得到含量超过95%的精炼曲克芦丁。

本发明所述的HPLC监控反应是指通过高效液相色谱法测定活性成分的含量来监控反应进程。

本发明所述的曲克芦丁的制备方法用于生产活性含量超过95%的曲克芦丁粉末，是以槐米为原料萃取获得粗品曲克芦丁，接着采用二次沉淀法（吡啶-醋酐法，异丙醇-冰乙酸法）获得精制芦丁，然后以3代PAMAM树枝状聚合物为催化剂能有效降低杂质含量和提高产品收率，配合甲醇溶剂和高压釜的使用缩短了实验路线和反应时间。

曲克芦丁的传统生产方法是以芦丁和2-氯乙醇或环氧乙烷为原料，强碱为催化剂，经乙酰化得到以三羟乙基芦丁为主的羟乙基芦丁混合物。但使用强碱催化剂，反应后期易引起水解、氧化等副反应，增加曲克芦丁的纯化难度。

而本发明是以槐花为原料，槐花在我国多地广泛种植，不属于稀缺资源，且生长习性不苛刻，易栽培，来源广，故用槐花提取芦丁并不会造成恶劣的环境破坏，是可再生资源。从槐花米中提取芦丁并未使用禁用的有毒有害溶剂、催化剂，生产工艺简单，所用的溶剂、催化剂简单易得，并没产生有毒副作用的副反应，对环境友好。用芦丁酰化得到高纯曲克芦丁的制备过程，没有使用强碱催化剂，减少了反应后期易引起水解、氧化等副反应的情况，降低了曲克芦丁的纯化难度，减少了废液废料的特殊处理，对经济、环境更友好。

曲克芦丁的制备方法中，步骤（1）中所述槐米、乙醇、吐温20、硼砂的质量之比为1：（10-20）：（0.01-0.1）：（0.01-0.1）；所述加热的温度为50℃，所述超声波的频率为40 kHz，超声处理时间为30min。

曲克芦丁的制备方法中，步骤（1）中所述粗品芦丁、吡啶、醋酐、冷水的质量之比为1：（5-10）：（1-5）：（10-20）；所述冷水的温度为0~5℃。

曲克芦丁的制备方法中，步骤（3）中所述芦丁、PAMAM树枝状聚合物、甲醇、环氧乙烷的质量之比为（10-50）:1:（50-100）:（1-10）。

曲克芦丁的制备方法中，步骤（4）中所述高纯度曲克芦丁、无水甲醇、活性炭的质量之比为1:（10-20）：（1-5）。

本发明所述涉及的蓝玉簪龙胆(Gentiana Veitchiorum Hemsl)为龙胆科龙胆属植物，生长于西藏中东部海拔2500～4800m的河滩，山坡草地，高山草甸。藏药名“邦见恩保”，是西藏地区广泛使用的传统药材，花和全草均可入药。《晶珠本草》记载其具有治毒病和各种热症的功效，花用于治疗天花，全草可治疗目赤头痛、慢性咽炎、湿热黄疸等疾病。现代生物学实践也证明，蓝玉簪对于慢性支气管炎、肺纤维化动物模型有较好的疗效。蓝玉簪龙胆所含化学成分主要包括烯醚萜类、黄酮类、甾体类等。

本发明所述的蓝玉簪龙胆提取物是蓝玉簪龙胆全草的醇溶性提取物，该提取物可以用多元醇水溶液为溶剂，其中所述的多元醇可以为乙醇、丙二醇、丁二醇、1,3-丙二醇的一种或一种以上的混合。具体的，其制备方法可以为：该提取物是用多元醇水溶液为溶剂，提取1-3次，合并提取液，过滤，即得。

以下列举一些具体实施例，但需注意，下列实施例并没有穷举所有可能的情况。并且下述实施例中所用的材料如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1

一种曲克芦丁制备方法，包括如下步骤：

（1）粗品芦丁的提取：称取槐米粉末，加入乙醇，加热到50℃，40 kHz超声波处理30min，在搅拌下加入吐温20和硼砂；其中所述槐米、乙醇、吐温20、硼砂的质量之比为1：10：0.1：0.01；用石灰乳调至pH 9.5，趁热抽滤，得滤液，在室温下用浓盐酸调至pH 2.5，搅匀抽滤；蒸馏水洗至洗液呈中性，静置过夜，滤取沉淀并恒温干燥称重，得粗品芦丁；

（2）芦丁的纯化：将粗品芦丁加入吡啶中，搅拌至溶解，在冰水浴下缓慢滴入醋酐，75℃搅拌8h，将反应液滴入5℃冷水中，乳白色颗粒析出，室温下静置析晶4h，抽滤；其中所述粗品芦丁、吡啶、醋酐、冷水的质量之比为1：10：1：20；将滤饼用异丙醇加热至溶解，再缓慢降温析晶，抽滤；将滤饼溶于甲醇中，且缓慢滴加甲醇钠-甲醇溶液，溶液变浑浊，用冰乙酸调节pH至4.5，大量黄色沉淀析出，室温下静置，抽滤、真空干燥即得精制芦丁；

（3）高纯度曲克芦丁的制备：在高压釜中加入精制芦丁、乙二胺核心的PAMAM树枝状聚合物、甲醇、环氧乙烷，其中所述芦丁、PAMAM树枝状聚合物、甲醇、环氧乙烷的质量之比为50:1:50:10；缓慢通入氮气以维持反应体系压强为0.1MPa，维持反应温度为85℃，HPLC监控反应，保温反应3ｈ，三羟乙基芦丁含量超过85％，立即降温终止反应，滴加盐酸调节反应液pH为5.0；加入活性炭加热回流0.5ｈ后，趁热过滤，将滤液冷却至10℃，搅拌结晶，呈浅黄色晶体，经过滤、真空干燥得到高纯度曲克芦丁；

（4）精炼曲克芦丁：将高纯度曲克芦丁加入无水甲醇，加热回流至完全溶解，加入针用活性炭，其中所述高纯度曲克芦丁、无水甲醇、活性炭的质量之比为1:10：5；继续回流1ｈ后，趁热抽滤，将滤液降至室温静置析晶8h后，抽滤、干燥得到精炼曲克芦丁。

实施例2

一种曲克芦丁制备方法，包括如下步骤：

（1）粗品芦丁的提取：称取槐米粉末，加入乙醇，加热到50℃，40 kHz超声波处理30min，在搅拌下加入吐温20和硼砂；其中所述槐米、乙醇、吐温20、硼砂的质量之比为1：20：0.01：0.1；用石灰乳调至pH 8.5，趁热抽滤，得滤液，在室温下用浓盐酸调至pH 3.5，搅匀抽滤；蒸馏水洗至洗液呈中性，静置过夜，滤取沉淀并恒温干燥称重，得粗品芦丁；

（2）芦丁的纯化：将粗品芦丁加入吡啶中，搅拌至溶解，在冰水浴下缓慢滴入醋酐，65℃搅拌12h，将反应液滴入0℃冷水中，乳白色颗粒析出，室温下静置析晶8h，抽滤；其中所述粗品芦丁、吡啶、醋酐、冷水的质量之比为1：5：5：10；将滤饼用异丙醇加热至溶解，再缓慢降温析晶，抽滤；将滤饼溶于甲醇中，且缓慢滴加甲醇钠-甲醇溶液，溶液变浑浊，用冰乙酸调节pH至5.5，大量黄色沉淀析出，室温下静置，抽滤、真空干燥即得精制芦丁；

（3）高纯度曲克芦丁的制备：在高压釜中加入精制芦丁、乙二胺核心的PAMAM树枝状聚合物、甲醇、环氧乙烷，其中所述芦丁、PAMAM树枝状聚合物、甲醇、环氧乙烷的质量之比为10:1:100:1；缓慢通入氮气以维持反应体系压强为0.3MPa，维持反应温度为75℃，HPLC监控反应，保温反应5ｈ，三羟乙基芦丁含量超过85％，立即降温终止反应，滴加盐酸调节反应液pH为4.0；加入活性炭加热回流1ｈ后，趁热过滤，将滤液冷却至5℃，搅拌结晶，呈浅黄色晶体，经过滤、真空干燥得到高纯度曲克芦丁；

（4）精炼曲克芦丁：将高纯度曲克芦丁加入无水甲醇，加热回流至完全溶解，加入针用活性炭，其中所述高纯度曲克芦丁、无水甲醇、活性炭的质量之比为1:20：1；继续回流2ｈ后，趁热抽滤，将滤液降至室温静置析晶12h后，抽滤、干燥得到精炼曲克芦丁。

实施例3

一种曲克芦丁制备方法，包括如下步骤：

（1）粗品芦丁的提取：称取槐米粉末，加入乙醇，加热到50℃，40 kHz超声波处理30min，在搅拌下加入吐温20和硼砂；其中所述槐米、乙醇、吐温20、硼砂的质量之比为1：15：0.05：0.05；用石灰乳调至pH 9，趁热抽滤，得滤液，在室温下用浓盐酸调至pH 3，搅匀抽滤；蒸馏水洗至洗液呈中性，静置过夜，滤取沉淀并恒温干燥称重，得粗品芦丁；

（2）芦丁的纯化：将粗品芦丁加入吡啶中，搅拌至溶解，在冰水浴下缓慢滴入醋酐，70℃搅拌10h，将反应液滴入3℃冷水中，乳白色颗粒析出，室温下静置析晶6h，抽滤；其中所述粗品芦丁、吡啶、醋酐、冷水的质量之比为1：8：2：15；将滤饼用异丙醇加热至溶解，再缓慢降温析晶，抽滤；将滤饼溶于甲醇中，且缓慢滴加甲醇钠-甲醇溶液，溶液变浑浊，用冰乙酸调节pH至5，大量黄色沉淀析出，室温下静置，抽滤、真空干燥即得精制芦丁；

（3）高纯度曲克芦丁的制备：在高压釜中加入精制芦丁、乙二胺核心的PAMAM树枝状聚合物、甲醇、环氧乙烷，其中所述芦丁、PAMAM树枝状聚合物、甲醇、环氧乙烷的质量之比为30:1:75:5；缓慢通入氮气以维持反应体系压强为0.2MPa，维持反应温度为80℃，HPLC监控反应，保温反应4ｈ，三羟乙基芦丁含量超过85％，立即降温终止反应，滴加盐酸调节反应液pH为4.5；加入活性炭加热回流0.8ｈ后，趁热过滤，将滤液冷却至7℃，搅拌结晶，呈浅黄色晶体，经过滤、真空干燥得到高纯度曲克芦丁；

（4）精炼曲克芦丁：将高纯度曲克芦丁加入无水甲醇，加热回流至完全溶解，加入针用活性炭，其中所述高纯度曲克芦丁、无水甲醇、活性炭的质量之比为1:15：3；继续回流1.5ｈ后，趁热抽滤，将滤液降至室温静置析晶10h后，抽滤、干燥得到精炼曲克芦丁。

实施例4

一种蓝玉簪龙胆提取物，其制备方法如下：

将蓝玉簪龙胆的全草烘干、粉碎，然后过40目筛，获得植物粉末；将植物粉末中加入体积分数为70%的乙醇水溶液，其中乙醇水溶液的添加量为植物粉末的20倍，慢速搅拌下浸泡24小时，过滤，即得提取物。

实施例5

一种美白保湿精华，包括如下质量百分含量的组分：

制备工艺：1、主锅：将A1-A8组分搅拌均匀，加热至80℃，搅拌至完全溶解后保温15min；2、降温至45℃，将B1、B2组分加入主锅，搅拌均匀，冷却至30℃，得美白保湿精华。

实施例6

一种美白保湿乳，包括如下质量百分含量的组分：

制备工艺：

1、主锅：将A1-A6组分搅拌均匀，加热至78℃，搅拌至完全溶解后保温15min；

2、油相锅：将B1-B6组分投入油相锅，加热至78℃，搅拌均匀至完全溶解；

3、主锅：将油相锅内物料倒入主锅，78℃恒温搅拌20min，3500rpm均质30min，体系降温至45℃；

4、将混合均匀的C1-C6、D1-D2加入主锅，搅拌均匀；3500rpm均质均质5min。

实施例7

一种美白保湿霜，包括如下质量百分含量的组分：

制备工艺：

1、主锅：将A1-A7组分搅拌均匀，加热至80℃，搅拌至完全溶解后保温15min；

2、油相锅：将B1-B5组分投入油相锅，加热至80℃，搅拌均匀至完全溶解；

3、主锅：将油相锅内物料倒入主锅，80℃恒温搅拌15min，3500rpm均质30min；

4、体系降温至45℃，将C1、C2、C3加入主锅，搅拌均匀，冷却至30℃，得美白保湿霜。

测试1 吸光度测试

采用紫外-可见光分光光度计对实施例1所制得的曲克芦丁进行吸光度测试，测试波长为200-700nm。具体测试结果见图1。从图1可见，曲克芦丁在380-500nm的蓝光区域有一定吸收能力。

测试2 蓝光测试

分别以5J/cm²、15J/cm²、20J/cm²、50J/cm²、70J/cm²、90J/cm²不同剂量的415nm蓝光照射剃光毛的豚鼠皮肤，5天后拍照，如图2所示。从图2可以看到豚鼠皮肤受试部位有明显的色素沉着，并且剂量越大，色素沉着越明显。

测试3 蓝光透过率测试

配制0.025%、0.03%、0.05%、0.1%的实施例2所制得的曲克芦丁水溶液，并以水为对照，使用紫外-可见分光光度计在380-500nm范围测定其透光率。实验结果如附图3所示。从图3可见，本发明实施例所制得的曲克芦丁能有效阻挡380nm-420nm的紫外线和蓝光，且浓度低至0.025% 亦能有效阻挡380nm-412nm 的紫外线和蓝光。

测试4 美白效果测试

一、美白组合物对黑素细胞酪氨酸酶活性和黑素合成的影响

将实施例2所制得的曲克芦丁和实施例4所制得的蓝玉簪龙胆提取物按照重量比1:5混合，获得美白组合物，然后用水稀释为50mg/L、100mg/L、200mg/L的美白组合物水溶液，作为待测组。配制200mg/L的曲克芦丁作为对比组1，配制200mg/L的实施例4所制得的蓝玉簪龙胆提取物作为对比组2。

（1）黑素细胞酪氨酸酶活性的测定

B16V小鼠黑素瘤细胞接种于96孔板中，接种密度为10⁴个/孔，培养12小时后，待细胞贴壁后，吸去培养液，分别加入含不同浓度测试物质的培养基各200μL，于37℃恒温CO₂培养箱56h，加入1% Triton X-100 50μL，并振荡30min溶解细胞，加入L-多巴溶液（2g/L）100μL，反应4h后，测定475nm的吸收值。计算酪氨酸酶活性%=药物处理组A₄₇₅/空白对照A₄₇₅*100，曲酸为阳性对照组。

（2）黑素含量的测定

B16V黑素瘤细胞培养至足够实验数量时，弃去培养液，用PBS液清洗2次，加入培养液，10⁴个/孔，加入96孔板中，每孔加入100μL。培养12h后，吸出培养基，设置对照组和空白对照组，培养基中均含5%胎牛血清，于37℃恒温CO₂培养箱中培养56h后，吸去培养液用 0.25%胰酶消化，以1000r/min离心5min弃上清液，每个处理因素下的细胞加入200μL含10%二甲基亚砜（DMSO）的NaOH（1mol/L）溶液，于65℃水浴，使细胞内黑素颗粒完全溶解在溶液中，使用分光光度计测量475 nm处吸光度A值。计算黑素含量%=药物处理组A₄₇₅/空白对照A₄₇₅*100。

具体酪氨酸酶活性和黑色含量的测算值见表1。由表1可见，曲克芦丁和蓝玉簪龙胆提取物混合得到的美白组合物具有良好的抑制酪氨酸酶活性、减少黑素生产的作用。

表1 不同浓度的美白组合物对黑素细胞酪氨酸酶活性和黑素合成的影响

二、美白组合物对人工晒黑的皮肤色素沉着的影响

以实施例7所制得的美白保湿霜作为待测组，并制备阳性组和空白组。其中阳性组与实施例7所制得的美白保湿霜的区别在于含有1wt%的曲酸，且不含曲克芦丁、蓝玉簪龙胆提取物。其中空白组与实施例7所制得的美白保湿霜的区别在于不含曲克芦丁、蓝玉簪龙胆提取物。

将豚鼠背部皮肤剃毛后，采用90J/cm²剂量的415nm蓝光照射，诱导背部皮肤色素沉着，7天后皮肤色素沉着稳定后，开始外用待测美白保湿霜，其中每日早晚各涂抹一次，使用量为0.01g/cm²。采用CM2600D色度计在使用制剂前（基础值）、1周、3周、6周、8周和16周测量皮肤色度L*值，通过前后数值△L*来评估制剂的美白功效。其中△L*值=（第几周L*值一基础L*值)。

具体测试结果见图4。从图4可见，试验组和阳性对照组在第3周开始，各点△L*值与空白组△L*值比较，差异均有统计学意义(P<O．05)，第16周，阳性对照组△L*值与试验组△L*值比较，差异有统计学意义(P<0．05)。由此可见，本发明实施例的美白保湿霜从第3周起实现了良好的美白作用。

以上实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims

1.一种曲克芦丁制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的曲克芦丁的制备方法，其特征在于，步骤（1）中所述槐米、乙醇、吐温20、硼砂的质量之比为1：（10-20）：（0.01-0.1）：（0.01-0.1）；所述加热的温度为50℃，所述超声波的频率为40 kHz，超声处理时间为30min。

3.根据权利要求1所述的曲克芦丁的制备方法，其特征在于，步骤（2）中所述粗品芦丁、吡啶、醋酐、冷水的质量之比为1：（5-10）：（1-5）：（10-20）；所述冷水的温度为0~5℃。

4.根据权利要求1所述的曲克芦丁的制备方法，其特征在于，步骤（3）中所述芦丁、PAMAM树枝状聚合物、甲醇、环氧乙烷的质量之比为（10-50）:1:（50-100）:（1-10）。

5.根据权利要求1所述的曲克芦丁的制备方法，其特征在于，步骤（4）中所述高纯度曲克芦丁、无水甲醇、活性炭的质量之比为1:（10-20）：（1-5）。

6.权利要求1-5任一项所述的曲克芦丁的制备方法得到的曲克芦丁在美白护肤品中的应用。

7.根据权利要求6所述的曲克芦丁在美白护肤品中的应用，其特征在于，所述的曲克芦丁和蓝玉簪龙胆提取物组成美白组合物，所述的曲克芦丁和蓝玉簪龙胆提取物的质量之比为1：（1-10）。