CN110951839B - 一种用于检测幽门螺杆菌的巢式荧光pcr方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种非疾病诊断目的的用于检测幽门螺杆菌的巢式荧光PCR方法，涉及生物检测技术领域，包括巢式荧光PCR反应的外引物、巢式荧光PCR反应的内引物、荧光PCR反应的探针序列和Block序列，所述外引物序列为SEQ ID NO1：5’‑CGGTTAAATACCGACCTGCATGAATGGCGTAACGAG‑3’，SEQ ID NO2：5’‑GCTAACAGAAACATCAAGGGTGGTATCTCAAGGATGGC‑3，所述内引物序列为SEQ ID NO3:5’‑ATGGGAGCTGTCTCAACCAGAG‑3’，SEQ ID NO4:5’‑CTCCATAAGAGCCAAAGCCCTTACT‑3’，所述探针的序列为SEQ ID NO5：5’‑FAM‑AGCACTGCTAATGGGAATATCATGCGC‑BHQ1‑3’，所述Block序列为SEQ ID NO6：5’‑CTCGTTACGCCATTCATGC‑P‑3’，SEQ ID NO7：5’‑GCCATCCTTGAGATACCACC‑P‑3’。本发明操作简单，准确性高。
Description
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种用于非疾病诊断目的的检测幽门螺杆菌的巢式荧光PCR方法。
背景技术
幽门螺杆菌(Helicobacter pylroi，简称H.pylori或HP)，是一种螺旋形、微厌氧的细菌。可寄生在人的胃部，并可随粪便少量的排出体外，全世界有超过半数的人感染HP。实验人员通常希望从粪便中检测幽门螺杆菌，但粪便中幽门螺杆菌含量低，而其他的杂菌含量高并且种类也极其丰富，因此在做PCR检测的时候很容易将其他菌误检为幽门螺杆菌，从而出现假阳性结果。
巢式PCR技术可以增加反应的特异性和灵敏度。传统的巢式PCR反应是先用外引物扩增目的片段，扩增完成后将PCR管打开，取出少许PCR扩增产物加入装有内引物的PCR体系中再次进行扩增。此方法的问题在于第一次PCR后开盖会引起气溶胶，对后续实验的污染，从而导致以后检测结果出现假阳性。
因此急需提供一种操作简单，准确性高的检测幽门螺杆菌的巢式荧光PCR方法。
发明内容
本发明的目的是针对现有检测幽门螺杆菌的巢式荧光PCR方法的不足，提供一种非疾病诊断目的的用于检测幽门螺杆菌的巢式荧光PCR方法。
本发明提供了如下的技术方案：
一种非疾病诊断目的的用于检测幽门螺杆菌的巢式荧光PCR方法，包括巢式荧光PCR反应的外引物、巢式荧光PCR反应的内引物、荧光PCR反应的探针序列和Block序列，所述外引物序列为SEQ ID NO1：5’-CGGTTAAATACCGACCTGCATGAATGGCGTAACGAG-3’，SEQ ID NO2：5’-GCTAACAGAAACATCAAGGGTGGTATCTCAAGGATGGC-3，所述内引物序列为SEQ ID NO3:5’-ATGGGAGCTGTCTCAACCAGAG-3’，SEQ ID NO4:5’-CTCCATAAGAGCCAAAGCCCTTACT-3’，所述探针的序列为SEQ ID NO5：5’-FAM-AGCACTGCTAATGGGAATATCATGCGC-BHQ1-3’，所述Block序列为SEQ ID NO6：5’-CTCGTTACGCCATTCATGC-P-3’，SEQ ID NO7：5’-GCCATCCTTGAGATACCACC-P-3’。
所述外引物的退火温度范围为68℃-70℃，所述外引物在PCR反应体系中的浓度为20nM-80nM，所述内引物的退火温度范围为55℃-60℃，所述内引物在PCR反应体系中的浓度为100nM-400nM，所述内引物浓度为外引物浓度的5-10倍。
优选的，所述探针的退火温度在65℃-68℃，探针在PCR反应体系中的浓度为100nM-400nM。
优选的，所述Block序列3’端均经磷酸化修饰，所述Block序列与所述外引物的3’端序列互补，且互补的退火温度为55℃-60℃，所述Block序列在PCR反应体系中的浓度为200nM-800nM，所述Block序列浓度为所述外引物浓度的10倍。
本发明的有益效果是：在整个操作过程中不需要打开PCR的管盖就可以进行两次反应的巢式荧光PCR，操作简单，这大大降低了开盖污染的可能性，从而在无污染的情况下实现了巢式荧光PCR高特异性扩增，提高了检测结果的准确性。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1是本发明中巢式荧光PCR反应体系中的功能性序列；
图2是本发明在高温退火时外引物的PCR反应；
图3是本发明在低温退火时内引物的PCR反应；
图4是本发明中外引物、内引物在高温PCR的过程中扩增情况；
图5是本发明中外引物、内引物在低温PCR的过程中扩增情况；
图6是检测粪便中幽门螺杆菌的PCR扩增情况。
具体实施方式
巢式荧光PCR反应体系中的功能性序列如图1所示；高温时发生的退火反应，此时只有外引物进行了PCR扩增，结果如图2所示；低温时发生的退火反应，此时内引物和探针进行了荧光PCR反应，外引物被Block封闭，不能进行反应，结果如图3所示。
实施例1
配制三种PCR MIX反应液，其中Taq酶和dNTP均选择康为世纪生物技术有限公司的产品，配制方法如表1：
表1 PCR MIX反应液的配置
将配制好的PCR MIX1和PCR MIX2对初始模板DNA进行荧光PCR反应，程序为95℃10min，95℃ 15S，70℃ 1min，10个循环。取反应完成后的“MIX1产物”2ul、“MIX2产物”2ul、“稀释20倍的初始模板DNA”2ul，分别加入到三管PCR MIX3中进行荧光PCR反应，反应程序为：95℃ 10min，95℃ 15S，60℃ 1min(采集荧光)，40个循环。结果如图4所示，对比MIX3的荧光扩增曲线Ct值，以“MIX2产物”为模板的扩增曲线Ct值与“稀释20倍的初始模板DNA”的Ct值基本一致，MIX2在高温的PCR反应中内引物没有进行扩增。以“MIX1产物”为模板的扩增曲线要比其余两个的扩增曲线小10个Ct值，MIX1在高温的PCR反应中外引物进行了良好的扩增。说明外引物在高温PCR的过程中有扩增，而内引物在高温PCR过程中无扩增。
实施例2
配制三种PCR MIX反应液，其中Taq酶和dNTP均选择康为世纪生物技术有限公司的产品，配制方法如表2：
表2 PCR MIX反应液的配置
将配制好的PCR MIX 4和PCR MIX 5对初始模板DNA进行荧光PCR反应，程序为：95℃ 10min，95℃ 15S，60℃ 1min，10个循环。取反应完成后的“MIX4产物”2ul、“MIX5产物”2ul、“稀释20倍的初始模板DNA”2ul，分别加入到三管PCR MIX3中进行荧光PCR反应，反应程序为：95℃ 10min，95℃ 15S，60℃ 1min(采集荧光)，40个循环。结果如图5所示，对比MIX3的荧光扩增曲线Ct值，以“MIX4产物”为模板的扩增曲线Ct值与“稀释20倍的初始模板DNA”的Ct值基本一致，MIX4在低温的PCR反应中外引物没有进行扩增。以“MIX5产物”为模板的扩增曲线要比其余两个的扩增曲线小10个Ct值，MIX5在低温的PCR反应中内引物进行了良好的扩增。说明外引物在低温PCR的过程中无扩增，而内引物在低温PCR过程中有良好扩增。
实施例3
按照表3配方配制巢式荧光PCR反应体系：
表3
| 试剂 | 体系 |
| 5*buffer | 8ul |
| dNTP(10mM) | 0.8ul |
| SEQ ID NO1(2uM) | 0.8ul |
| SEQ ID NO2(2uM) | 0.8ul |
| SEQ ID NO3(10uM) | 0.8ul |
| SEQ ID NO4(10uM) | 0.8ul |
| SEQ ID NO5(10uM) | 0.8ul |
| SEQ ID NO6(10uM) | 1.6ul |
| SEQ ID NO7(10uM) | 1.6ul |
| Taq(5U/ul) | 0.4ul |
| 模板 | 2ul |
| 水 | 21.6ul |
取经粪便提取的幽门螺杆菌DNA作为模板进行反应，反应程序为：95℃，10min，95℃ 15s，70℃ 1min，10个循环，95℃ 15s，60℃ 1min(采集荧光)，40个循环。检测结果如图6所示，可以检测出粪便中的幽门螺杆菌DNA，并且将Ct值提前10个左右。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (1)
1.一种非疾病诊断目的的用于检测幽门螺杆菌的巢式荧光PCR方法，其特征在于，所述巢式荧光PCR方法是将巢式PCR的外引物扩增与内引物扩增在同一反应体系中分时段进行，所述反应体系包括巢式荧光PCR反应的外引物、巢式荧光PCR反应的内引物、荧光PCR反应的探针序列和Block序列，所述外引物序列为SEQ ID NO1：5’-CGGTTAAATACCGACCTGCATGAATGGCGTAACGAG-3’，SEQ ID NO2：5’-GCTAACAGAAACATCAAGGGTGGTATCTCAAGGATGGC-3，所述内引物序列为SEQ ID NO3:5’-ATGGGAGCTGTCTCAACCAGAG-3’，SEQ ID NO4:5’-CTCCATAAGAGCCAAAGCCCTTACT-3’，所述探针的序列为SEQ ID NO5：5’-FAM-AGCACTGCTAATGGGAATATCATGCGC-BHQ1-3’，所述Block序列为SEQ ID NO6：5’-CTCGTTACGCCATTCATGC-P-3’，SEQ ID NO7：5’-GCCATCCTTGAGATACCACC-P-3’；反应程序为：95℃，10min，95℃15s，68℃-70℃1min，10个循环，95℃15s，55℃-60℃1min，40个循环；其中所述外引物的退火温度范围为68℃-70℃，所述外引物在PCR反应体系中的浓度为20nM-80nM，所述内引物的退火温度范围为55℃-60℃，所述内引物在PCR反应体系中的浓度为100nM-400nM，所述内引物浓度为外引物浓度的5-10倍，所述探针的退火温度在65℃-68℃，探针在PCR反应体系中的浓度为100nM-400nM，所述Block序列3’端均经磷酸化修饰，所述Block序列与所述外引物的3’端序列互补，且互补的退火温度为55℃-60℃，所述Block序列在PCR反应体系中的浓度为200nM-800nM，所述Block序列浓度为所述外引物浓度的10倍。
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