CN110946990B - 一种禽用呼吸道微生态喷雾制剂及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种禽用呼吸道微生态喷雾制剂及其应用。具体而言，所述禽用呼吸道微生态喷雾制剂中的原料组分为植物乳杆菌，枯草芽孢杆菌抗菌肽，载体。本发明还提供了该禽用呼吸道微生态喷雾制剂在预防禽类呼吸道疾病中的应用及其使用方法，该呼吸道微生态喷雾制剂可抑制呼吸道黏膜致病菌的生长，刺激气管黏膜免疫，促进IgA的分泌，直接消灭病原微生物，预防呼吸道疾病效果显著。
Description
技术领域
本发明属于微生态技术领域，具体涉及一种禽用呼吸道微生态喷雾制剂及其应用。
背景技术
禽类呼吸道疾病一年四季均可发生，尤以春、秋季节多发，长期以来受多种因素的影响，应用常规治疗给药方法往往效果不佳，分析原因多为以下三点：
1.春、秋季节气候应激因素的影响。春、秋季节气候干燥，气温忽冷忽热，昼夜温差大，各种应激因素增多，很容易破坏上呼吸道黏膜的完整性，使之排异能力下降，导致各种病原菌乘虚而入引起发病。
2.家禽的生理特点，导致呼吸道疾病很难治愈。从家禽的解剖结构可以看出，鼻腔对于呼吸道来说就是门户，如果黏膜受损，就会引起一系列的病变。如在鸡舍环境温度高时，鸡为了蒸发散热就会张口呼吸，鸡所呼入的气体有3/4先进入气囊，很容易发生气囊的病变。而由于气管、气囊上只有微量的血管和神经，药物的组织浓度低，吸收利用率差，往往不易治愈。
3.呼吸道疾病治疗效果与给药方式有很大的关系。在禽类的给药方法上，最常用的是饮水、拌料。饮水和拌料给药，药物多数需以扩散方式透过胃肠黏膜而被吸收进入血液循环，后随血液分布到相应部位发挥作用，但气管、气囊上只有微量血管和神经，运输到组织的药物很少，致使药物的组织分布浓度极低；且药物口服后必须经口、胃部到达小肠，在这个过程中，药物易受胃肠道内多种酶和酸碱度的影响，使药物的生物利用率明显降低，所以很难达到有效治疗的目的。
通过反复临床实践，应用本发明喷雾制剂进行喷雾给药防治鸡呼吸道疾病，取得了良好的效果。喷雾给药方式不仅方法简便，省时省力，而且可使药物瞬间直达病灶部位，起到治疗作用，明显提高药物的生物利用率；同时还可避免药物对胃肠道的不良刺激，减轻对肝、肾的损害。对严重混合感染、濒临死亡、不吃不喝、严重气囊炎的鸡群，喷雾给药能快速控制死亡，迅速缓解呼吸道症状，减少鸡群应激反应，有利于疾病恢复。
发明内容
本发明提供了一种禽用呼吸道微生态喷雾制剂及其应用。
所述的禽用呼吸道微生态喷雾制剂，其原料成分主要由植物乳杆菌、枯草芽孢杆菌抗菌肽、载体组成。
所述禽用呼吸道微生态喷雾制剂，其各原料成分的重量分数为：植物乳杆菌1-10份、枯草芽孢杆菌抗菌肽120-170份，载体补充至200份。优选地，所述喷雾制剂的各原料成分的重量份数为：植物乳杆菌2-8份、枯草芽孢杆菌抗菌肽130-160份，载体补充至200份。更优选地，所述喷雾制剂的各原料成分的重量份数为：植物乳杆菌4-6份、枯草芽孢杆菌抗菌肽140-150份，载体补充至200份。
所述植物乳杆菌为植物乳杆菌RP1，分类命名为植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)，菌株号为RP1，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为武汉大学，保藏号是CCTCC NO：M2018802，保藏日期为2018.11.19。
所述植物乳杆菌的菌数为1×108～1×1011CFU/g。
所述枯草芽孢杆菌抗菌肽所含水分≤10％。
所述枯草芽孢杆菌抗菌肽是由枯草芽孢杆菌经发酵产生的含38个氨基酸残基的抗菌短肽，易溶于水，可与饲料混合，也可用于饮用水中，且热稳定好，安全性高。
所述载体为一种或一种以上药学上可接受的水溶性载体(载体中水分≤10％)。
所述载体为酵母水解物、酵母细胞壁多糖、葡萄糖、果寡糖、壳寡糖、低聚木糖中的一种或几种。
本发明所述的一种禽用呼吸道微生态喷雾制剂的制备方法，其具体步骤为：
(1)按组方量称取各原料成分的固体粉末。
(2)将植物乳杆菌和载体充分混合后加入枯草芽孢杆菌抗菌肽混匀。
(3)向步骤(2)混合物中加入一定量水充分溶解为制剂，即得。
步骤(3)中所述水的加入量为原料成分重量的5-15倍。
优选地，步骤(3)中所述水的加入量为原料成分重量的10倍。
本发明所述的一种禽用呼吸道微生态喷雾制剂可用于禽类呼吸道疾病的预防。
本发明所述的一种禽用呼吸道微生态喷雾制剂的使用方法，具体为，将本发明的禽用呼吸道微生态喷雾制剂中的原料成分用水充分溶解，使用专门的喷雾器喷雾。喷雾时关闭通风设备和照明设备，喷头应位于鸡头上方30cm，斜向上方喷雾，雾滴大小应控制在30-40um。喷雾时间应在每天傍晚，喷雾时长在30-60min。
有益效果：
1、本发明所述喷雾制剂可抑制呼吸道黏膜致病菌的生长，降低致病菌感染呼吸道的可能，能够保护禽类呼吸道黏膜完整性，从而达到预防和治疗呼吸道疾病的效果。
2、本发明将抑菌作用强的枯草芽孢杆菌抗菌肽与具有调节菌群平衡的植物乳杆菌联合使用，可以调节呼吸道黏膜的菌群结构，增加益生菌的比例，降低致病菌的比例，促进呼吸道黏膜的生长发育，增加呼吸道黏膜纤毛的排异能力；可以刺激气管黏膜免疫，促进IgA的分泌，直接消灭病原微生物。
附图说明
图1鸡每日咳嗽次数的折线图。
具体实施方式
下面结合实施案例对本发明作更进一步的说明，但本发明的实施方式不限于此，下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
实施例1禽用呼吸道微生态喷雾制剂的制备
分别称取各原料粉末：植物乳杆菌1g，枯草芽孢杆菌抗菌肽120g，酵母水解物79g；将植物乳杆菌和酵母水解物充分混合，再与枯草芽孢杆菌抗菌肽混匀，加入1L水充分溶解，即得喷雾制剂。
实施例2禽用呼吸道微生态喷雾制剂的制备
分别称取各原料粉末：植物乳杆菌2g，枯草芽孢杆菌抗菌肽130g，低聚木糖68g；将植物乳杆菌和低聚木糖充分混合，再与枯草芽孢杆菌抗菌肽混匀，加入1.5L水充分溶解，即得喷雾制剂。
实施例3禽用呼吸道微生态喷雾制剂的制备
分别称取各原料粉末：植物乳杆菌5g，枯草芽孢杆菌抗菌肽145g，葡萄糖50g；将植物乳杆菌和葡萄糖充分混合，再与枯草芽孢杆菌抗菌肽混匀，加入2L水充分溶解，即得喷雾制剂。
实施例4禽用呼吸道微生态喷雾制剂的制备
分别称取各原料粉末：植物乳杆菌8g，枯草芽孢杆菌抗菌肽160g，果寡糖32g；将植物乳杆菌和果寡糖充分混合，再与枯草芽孢杆菌抗菌肽混匀，加入2.5L水充分溶解，即得喷雾制剂。
实施例5禽用呼吸道微生态喷雾制剂的制备
分别称取各原料粉末：植物乳杆菌10g，枯草芽孢杆菌抗菌肽170g，葡萄糖20g；将植物乳杆菌和葡萄糖充分混合，再与枯草芽孢杆菌抗菌肽混匀，加入3L水充分溶解，即得喷雾制剂。
对比例1
对比例1产品为根据中国专利(CN109528856A)：一种预防鸡呼吸道疾病的喷雾剂中的实施例制备所得。
对比例2
对比例2产品为根据中国专利(CN108079057A)：一种用于预防畜禽禽流感的喷雾药剂的制备方法中的实施例3制备所得。
实施例6本发明产品和对比例产品的抑菌对比试验
实验材料：营养琼脂养基、营养肉汤培养基、培养皿、12mm打孔器等
实验产品：本发明实施例2、实施例3、实施例4、对比例1、对比例2
指示菌种：大肠杆菌标准菌株、金黄色葡萄球菌标准菌株、沙门氏菌标准菌株
实验步骤：
(1)活化菌种：将指示菌种活化两代，得到生长良好的指示菌种菌液。
(2)制作指示菌种固体培养基：将营养琼脂培养基121℃高压灭菌15min，待其冷却至40-50℃时，将活化好的指示菌种菌液接种到营养琼脂培养基中，保证此时培养基中活菌数在105-106CFU/mL，混合均匀，快速倒入培养皿中，制得大肠杆菌固体培养基、金黄色葡萄球菌固体培养基和沙门氏菌固体培养基，每种指示菌固体培养基制作5个。用12mm的打孔器分别在指示菌固体培养基上均匀打4个孔。
(3)将5组实验产品分别注入到3种指示菌固体培养基的孔中，每种稀释液注4个孔，作为4个平行，每孔70uL。将培养皿正放置于37℃恒温培养箱培养24h。用游标卡尺测量抑菌圈的直径，计算平均值。
实验结果：
表1抑菌试验结果
注：本试验所用打孔器直径为12mm。
由表1抑菌实验结果可知本发明实施例2、实施例3和实施例4产品对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和沙门氏菌的抑菌圈直径明显大于对比例1、对比例2，其中本发明实施例4产品对大肠杆菌的抑菌圈直径比对比例1和对比例2分别大25.40％和32.75％，对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径比对比例1和对比例2分别大21.12％和29.27％，对沙门氏菌的抑菌圈直径比对比例1和对比例2分别大59.90％和29.30％。
实验结论：
本发明产品与对比例1、对比例2产品对于大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和沙门氏菌的抑菌圈直径的大小可表明其抑菌效果，抑菌圈直径越大，抑菌效果越好。上述实验结果可以说明本发明产品具有优良的抑菌效果。
实施例7
本发明产品和对比例1、对比例2产品对肉鸡呼吸道黏膜纤毛摆动能力的影响
实验材料：手术剪、水浴锅、脱脂棉、洛氏液、冷光源灯、塑料培养皿(20cm)、碳素墨水、秒表、两脚规、游标卡尺
实验产品：本发明实施例3产品、对比例1、对比例2
实验动物：1日龄肉雏鸡100只
实验步骤：
(1)将雏鸡随机均分为4组，A、B、C、D组，A、B、C组分别对应本发明实施例3、对比例1、对比例2产品，D组为空白对照。4组鸡都在相同的适宜的饲养管理条件下饲养。
(2)在鸡8日龄时，将本发明实施例3、对比例1、对比例2三组产品进行喷雾给药，连用7天。
(3)在鸡22日龄时，将4组鸡处死，立即取气管2cm，纵向剪成两片。将气管片置37℃洛氏液湿润的棉片上，气管黏膜面朝上。将气管片和棉片一同放入培养皿中，呈30°倾斜，喉头端朝上，四周用37℃水浴恒温，上用冷光源照射，标本放置稳定5min后，以针头蘸少许墨汁放至气管片下端直接观察，用秒表计时5min，用两脚规和游标卡尺测量墨汁运行距离，记录并计算4组鸡气管上墨汁运行的平均距离。
实验结果：
表2鸡气管上墨水运行距离实验结果
| 组别 | 5min墨水运行距离(mm) |
| A | 10.12 |
| B | 6.34 |
| C | 7.76 |
| D | 5.11 |
由表2墨水运行距离实验结果可知A、B、C组鸡气管上墨汁5min运行的平均距离比D组都长，且A组明显长于B组和C组。
实验结论：
鸡气管上的墨汁作为示踪物，其有运行痕迹表明气管纤毛具有排异功能，在相同时间内运行距离越远说明气管纤毛的排异功能越强。上述实验结果可以说明本发明产品能促进雏鸡气管发育，提高鸡气管纤毛的排异功能。
实施例8
本发明产品和对比例产品对鸡气管黏膜IgA含量的影响
实验材料：手术剪、10mL离心管、-20℃冰箱、IgA检测试剂盒(默沙克)、离心机、移液枪、紫外分光光度计
实验产品：本发明实施例3、实施例4产品、对比例1、对比例2
实验动物：1日龄肉雏鸡100只
实验步骤：
(1)将雏鸡随机均分为5组，A、B、C、D、E组。A、B、C、D组分别对应本发明实施例3产品、本发明实施例4产品、对比例1产品、对比例2产品，E组为空白对照。5组鸡都在相同的适宜的饲养管理条件下饲养。
(2)在鸡8日龄时，将本发明实施例3、实施例4、对比例1、对比例2四组产品进行喷雾给药，连用7天。
(3)在鸡22日龄时，将5组鸡处死，立即取气管4cm，置于离心管中，迅速放置在-20℃冰箱冷冻。
(4)按照IgA检测试剂盒的使用说明处理气管并检测5组鸡气管IgA的含量，处理实验数据。计算平均值。
实验结果：
表3鸡气管IgA含量检测结果
| 组别 | IgA含量(ug/g) |
| A | 251.32 |
| B | 277.56 |
| C | 217.52 |
| D | 197.68 |
| E | 176.76 |
A、B组的IgA含量明显高于C、D组。
实验结论：
鸡气管黏膜IgA可以直接与病原微生物结合，起到杀灭病原微生物的作用，IgA含量越高，说明鸡气管黏膜抵御病原微生物入侵的能力越强。由上述实验结果可以说明，本发明产品可以明显促进IgA的分泌。
实施例9临床应用实验
实验产品：按照本发明实施例3配制的产品
实验动物：1栋罗斯308肉鸡25000只
实验步骤：
(1)将该栋鸡从中间分为两组，分别是试验组和对照组，每组12500只。
(2)试验组在8-14日龄连续喷雾给药7天。
(3)在鸡8-21日零期间，每晚熄灯后计入鸡舍，分别记录试验组和对照组鸡每分钟咳嗽次数。统计数据，计算平均值，结果如表4和图1所示。
实验结果：
表4鸡咳嗽次数记录结果
| 日龄 | 试验组(次/min) | 对照组(次/min) |
| 8 | 30 | 30 |
| 9 | 34 | 40 |
| 10 | 39 | 50 |
| 11 | 46 | 65 |
| 12 | 45 | 80 |
| 13 | 50 | 96 |
| 14 | 43 | 118 |
| 15 | 51 | 109 |
| 16 | 60 | 110 |
| 17 | 68 | 112 |
| 18 | 64 | 115 |
| 19 | 67 | 109 |
| 20 | 65 | 118 |
| 21 | 70 | 120 |
实验结论：鸡群每分钟咳嗽次数代表了目前鸡群发生上呼吸道疾病的程度，每分钟咳嗽次数越少，发生上呼吸道疾病的鸡越少。由上述实验结果可以发现，试验组鸡群在8-21日龄阶段，鸡群每分钟咳嗽次数明显少于对照组，说明本发明产品起到了预防呼吸道疾病的作用。
Claims (8)
1.一种禽用呼吸道微生态喷雾制剂，其特征在于，所述喷雾制剂中的原料成分由植物乳杆菌、枯草芽孢杆菌抗菌肽、载体组成；所述喷雾制剂中各原料成分的重量份数为：植物乳杆菌1-10份、枯草芽孢杆菌抗菌肽120-170份，载体补充至200份；所述植物乳杆菌的菌数为植物乳杆菌RP1，保藏号是CCTCC NO：M 2018802。
2.根据权利要求1所述的禽用呼吸道微生态喷雾制剂，其特征在于，所述喷雾制剂中各原料成分的重量份数为：植物乳杆菌2-8份、枯草芽孢杆菌抗菌肽130-160份，载体补充至200份。
3.根据权利要求1-2中任一所述的禽用呼吸道微生态喷雾制剂，其特征在于，所述喷雾制剂中各原料成分的重量份数为：植物乳杆菌4-6份、枯草芽孢杆菌抗菌肽140-150份，载体补充至200份。
4.根据权利要求1-3中任一所述的禽用呼吸道微生态喷雾制剂，其特征在于，所述植物乳杆菌的菌数为1×108~1×1011 CFU/g。
5.根据权利要求1-3中任一所述的禽用呼吸道微生态喷雾制剂，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌抗菌肽所含水分≤10%。
6.根据权利要求1-3中任一所述的禽用呼吸道微生态喷雾制剂，其特征在于，所述载体为一种或一种以上药学上可接受的水溶性载体。
7.根据权利要求6所述的禽用呼吸道微生态喷雾制剂，其特征在于，所述载体为酵母水解物、酵母细胞壁多糖、葡萄糖、果寡糖、壳寡糖、低聚木糖中的一种或几种。
8.根据权利要求1-7中任一所述的禽用呼吸道微生态喷雾制剂在用于制备预防禽类呼吸道疾病的药物中的应用。
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