CN110940762A - 食品中碱性染料固相萃取填料、固相萃取柱的制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种食品中碱性染料固相萃取填料、固相萃取柱的制备方法及应用。其中，固相萃取填料采用与碱性染料结构极其相似的功能离子液体1‑苄基‑3‑甲基咪唑六氟磷酸盐和1‑癸基‑3‑甲基咪唑六氟磷酸盐为主要吸附试剂，对多种碱性染料的特异性吸附能力强，对食品基质中的盐类、糖类、色素、油脂、蛋白质、淀粉等杂质不产生吸附，可以有效分离待测样品中的杂质和碱性染料。且采用硅胶固载所述功能离子液体，形成疏松的固相萃取填料，无需挤压，同样可以与待测样品提取液充分接触。样液经过填料速度快，提高了萃取效率，缩短了样品前处理时间。由该填料制成的固相萃取柱可用于高效液相色谱中进行食品中碱性染料含量的快速测定，测定结果准确、稳定。

Description

食品中碱性染料固相萃取填料、固相萃取柱的制备方法及 应用

技术领域

本发明属于食品安全检测技术领域，涉及一种食品中碱性染料固相萃取填料和固相萃取柱的制备方法，本发明同时还涉及该固相萃取柱在利用高效液相色谱进行食品中碱性染料含量快速测定中的应用。

背景技术

碱性染料是芳香碱与有机酸或无机酸所生成的盐，即有色的有机碱的盐类。其碱性基一般为氨基，成盐后为-NH₂·HCl盐基团。

1856年H.W.perkin合成的世界上第一个合成染料苯胺紫，即属碱性染料。继后又陆续出现了碱性品红(C.I.碱性紫14)、碱性蓝(C.I碱性蓝9)、结晶紫(C.I碱性紫3)、孔雀绿(C.I.碱性绿4)以及罗丹明(C.I.碱性紫10)等许多品种。碱性染料化学结构包括二芳甲烷、三芳甲烷、偶氮型及含氮杂环型(如氧杂蒽、噁嗪和噻嗪等)，其亲水基较少，因此难溶于水。溶解时需先用乙醇或乙酸溶解，再用水稀释。碱性染料对温度较为敏感，溶解稀释和染浴温度不宜过高。主要用于对带阴离子的皮革进行染色，其结合力较强。碱性染料在溶液中离解为色素阳离子和酸根阴离子，故又名盐基性染料。它的分子结构中一般都含有伯胺、仲胺、叔胺或含氮杂环，故在酸性浴液中呈弱阳离子性。

研究表明，含有芳香胺的合成染料若被皮肤吸收，会通过还原反应和活性作用使人体的DNA发生结构和功能改变，可能诱发膀胱癌、输尿管癌和肾盂癌，其潜伏期可长达20年。大量医学调查还显示，经常接触碱性染料的人膀胱癌的发病率是正常人群发病率的28倍，因此碱性染料被禁止用于食品中。但由于碱性染料具有价格低廉、色泽鲜艳、稳定性强等特点，常被不法商家用于替代食品添加剂的着色剂，给人们的饮食安全带来极大隐患。

目前，碱性染料的检测方法有表面增强拉曼光谱法（SERS）、紫外光谱法、荧光光谱法、量子点荧光淬灭法、液相色谱-质谱联用法（LC-Ms）和高效液相色谱法（HPLC）。其中，高效液相色谱法及其与质谱串联法由于自动化程度高、仪器重复性好而被广泛应用。但该方法实际操作过程中需要对样品进行繁琐的前处理工作，且食品属于含多种碱性染料的复杂基质样品，目前尚无该复杂基质样品中多种碱性染料的前处理及检测方法。

发明内容

为了解决现有技术中存在的上述技术问题，本发明的目的之一是提供一种样品前处理时间短的食品中碱性染料固相萃取填料的制备方法。

本发明的目的之二是提供一种采用上述固相萃取填料制成的固相萃取柱。

本发明的目的之三是提供上述固相萃取柱的应用，具体为将上述固相萃取柱用于高效液相色谱中进行食品中碱性染料含量的快速测定。

（一）食品中碱性染料的固相萃取及含量测定

1、食品中碱性染料固相萃取填料的制备方法

分别称取1-苄基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐10-30质量份，1-癸基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐40-60质量份，甲醇200质量份和100目硅胶粉80-120质量份置于玻璃器皿中，超声反应1h后放置过夜，于60-75℃下真空干燥10h以上，得到疏松的白色粉末状固体，即为固相萃取填料。

2、食品中碱性染料固相萃取柱的制备方法

称取上述固相萃取填料400-600mg，置于套筒中，压紧填料，依次盖上纤维板和塑料盖，最后套上耐压环，即得食品中碱性染料固相萃取柱。

3、食品中碱性染料含量的测定

（1）碱性染料的提取

于待测样品（调味料、饮料、含花青素的保健品等食品）中以质量体积比2:4:4:2-2:6:6:2依次加入乙腈、甲醇和正己烷，涡旋提取1-4min，超声提取1-4min后离心，得到上清液，中间提取液层和沉淀物；弃去上清液，取中间提取液层于鸡心瓶中，用蒸馏水洗涤所述沉淀物，将洗涤后液并入盛放提取液的鸡心瓶中旋转蒸发，至鸡心瓶中乙腈和甲醇完全蒸发，剩余水层，即为待测样品提取液；

（2）碱性染料的纯化

将步骤（1）所述待测样品提取液缓慢注入固相萃取柱，依次吸取蒸馏水和空气清洗，然后精确吸取2.00mL甲醇作为洗脱溶剂进行洗脱，接收全部流出液即得洗脱液，洗脱液摇匀后经0.45μm有机滤膜过滤，滤液以甲醇为空白进行HPLC分析，得到待测样品中各种碱性染料的峰面积值；色谱条件：色谱柱：C18 4.6×250 mm分析柱；检测器：二极管阵列检测器；流动相：pH3.5乙酸铵缓冲液:乙腈=90:10；流速：1 mL/min；柱温：35 ℃；进样量：20μL；检测波长：490 nm；

（3）标准曲线的绘制

以甲醇为溶剂，配制不同质量体积浓度的碱性染料系列混合标准溶液，采用与步骤（2）中相同的色谱条件进行测定，并由色谱图得到所述混合标准溶液中碱性染料的保留时间和不同浓度下的峰面积；以质量体积浓度C（μg/mL）为横坐标，色谱峰面积A为纵坐标，绘制混合标准溶液每种碱性染料的标准曲线；

（4）碱性染料含量的测定

根据步骤（2）中得到的待测样品中各种碱性染料的峰面积值，从步骤（3）中绘制的每种碱性染料的标准曲线上找到该峰面积值对应的碱性染料的含量，按下式计算待测样品中各碱性染料的含量X：

式中：X表示待测样品中碱性染料的含量，单位μg/g；C₁- C₀表示步骤（2）中以甲醇为空白得到的待测样品中各碱性染料的峰面积所对应的碱性染料的含量，单位μg/mL；m表示待测样品的质量，单位g；V表示步骤（2）中洗脱溶剂甲醇的体积，单位mL。

作为本发明技术方案的优选，上述步骤（1）中，所述离心为以6000-12000r/min的转速离心2-5min。旋转蒸发为在60-70℃下旋转蒸发5-10min。

（二）方法学验证实验

下面对本发明食品中碱性染料含量测定的方法进行方法学验证，以突出本发明方法的优越性。

1、线性范围

以甲醇为溶剂，配制八个不同质量体积浓度（0.01μg/mL、0.10μg/mL、0.50μg/mL、1.00μg/mL、5.00μg/mL、10.00μg/mL、50.00μg/mL、100.00μg/mL）的碱性染料混合标准溶液，按照前述步骤（3）进行测定，得到碱性染料混合标准溶液的HPLC色谱图如图2所示，并由该图2得到所述混合标准溶液中碱性染料的保留时间和不同浓度下的峰面积；以质量体积浓度C（μg/mL）为横坐标，色谱峰面积A为纵坐标，绘制混合标准溶液每种碱性染料的标准曲线；所述各标准曲线的线性范围、回归方程、相关系数、检出限（3倍信噪比）值见表1。

表1 标准曲线的线性范围、回归方程、相关系数、检出限

表1中结果表明，各碱性染料标准曲线的线性范围良好。

2、准确度（即回收率及精密度）验证

用浸泡和挥干的方法制备含有多种碱性染料的阳性样品。使阳性样品中各种碱性染料含量分别为0.05μg/g，1.0μg/g，5.0μg/g，按照前述步骤（1）至步骤（3）处理并检测样品，并按照步骤（4）中公式计算，得到样品中每种碱性染料含量。每个含量水平加标做三组平行试验，计算回收率和三组加标水平共九组实验结果回收率的RSD%值，结果见表2- 11。

表2 罗丹明-B准确度验证结果

表3 碱性橙2准确度验证结果

表4 碱性橙21准确度验证结果

表5 碱性橙22准确度验证结果

表6 碱性嫩黄准确度验证结果

表7 酸性橙准确度验证结果

表8 赤藓红准确度验证结果

表9 孔雀石绿准确度验证结果

表10 结晶紫准确度验证结果

表11 亚甲基蓝准确度验证结果

由表中结果可以看出，此方法对样品中10种碱性染料检测的回收率在85.40-94.62%之间，精密度RSD%值≤5%，满足检测方法学要求。

本发明具有以下有益效果：

1、本发明固相萃取填料采用与碱性染料结构极其相似的功能离子液体作为主要吸附试剂，功能离子液体具有富集倍数大，富集效率高，达到吸附平衡所需时间短等特点，且对多种碱性染料的特异性吸附能力强，对食品基质中的盐类、糖类、色素、油脂、蛋白质、淀粉等杂质不产生吸附，可以有效分离待测样品中的杂质和碱性染料。

2、本发明采用硅胶固载功能离子液体，形成疏松的固相萃取填料，无需挤压，同样可以与待测样品提取液充分接触。样液经过固相萃取填料速度快，单次样品固相萃取时间可降至1min，提高了萃取效率，缩短了样品前处理时间。

3、本发明的固相萃取柱制造成本低，且具有蒸汽压低，稳定，不易挥发，不易变质，物化性质稳定等特点，有利于萃取过程和检测过程的稳定性及重复性。

4、本发明的固相萃取柱，无需有机溶剂活化，上样液为水溶液，清洗液为蒸馏水，洗脱液为甲醇且仅需2mL，试剂成本低。

5、本发明利用高效液相色谱进行食品中碱性染料含量快速测定方法的方法学验证实验结果表明，此方法对待测样品中10种碱性染料的回收率为85.40-94.62%，精密度RSD%≤5%，满足检测方法学要求。

6、本发明在碱性染料的提取过程中加入乙腈，用于提取待测样品中的亚甲基蓝，孔雀石绿，结晶紫，色素，部分油脂和其他杂质，且乙腈可以使部分蛋白质变性；加入甲醇用于提取待测样品中的罗丹明，碱性橙，碱性嫩黄，酸性橙，色素及其他杂质，且甲醇同样可以使部分蛋白质变性；加入正己烷用于除去待测样品中的油脂及部分杂质，但是不会溶解样品中的碱性染料。因此，利用以上三种试剂，可以得到碱性染料纯度较高的待测样品提取液，便于进一步的纯化操作。

附图说明

图1为本发明待测样品中碱性染料的HPLC色谱图；

图2为本发明碱性染料混合标准溶液的HPLC色谱图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。

以下各实施例中1-苄基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐和1-癸基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐为参照现有制备方法自制得到，其制备方法具体如下。

（1）1-癸基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐的制备：

分别称取N-甲基咪唑20质量份，1-氯癸烷52质量份于圆底烧瓶中，在85℃油浴条件下，搅拌回流反应8h。趁热用乙酸乙酯洗涤，弃去乙酸乙酯，重复3次。减压蒸馏除去残留的乙酸乙酯，得到黄色粘稠液体，即为1-癸基-3-甲基咪唑氯化盐离子液体。将该氯化盐离子液体溶于200质量份水中，加入50质量份六氟磷酸铵，室温搅拌反应2h。反应液分为两层，弃去上层液，下层液反复用纯水洗涤，将洗涤后的液体于75℃下旋转蒸发除去多余水分，得到淡黄色粘稠液体，即为1-癸基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐离子液体。将上述淡黄色离子液体溶于150质量份甲醇中，加入10质量份活性炭，充分振摇，静置，待活性炭完全沉入底部。取上清液过大孔树脂固相萃取柱，流出液全部接收于圆底烧瓶中，75℃旋转蒸发除去甲醇，得到无色透明的粘稠液体，即为纯净的1-癸基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐离子液体。

（2）1-苄基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐

分别称取N-甲基咪唑20质量份，苄基氯52质量份于圆底烧瓶中，在85℃油浴条件下，搅拌回流反应8h。趁热用乙酸乙酯洗涤反应后的液体，弃去乙酸乙酯，重复3次。减压蒸馏除去残留的乙酸乙酯，得到黄色粘稠液体，即为1-苄基-3-甲基咪唑氯化盐离子液体。将该氯化盐离子液体溶于200质量份水中，加入50质量份六氟磷酸铵，室温搅拌反应2h。反应液分为两层，弃去上层液，下层液反复用纯水洗涤，将洗涤后的液体在75℃下旋转蒸发除去多余水分，得到淡黄色固体粉末，即为1-苄基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐离子液体。 将上述淡黄色离子液体溶于150质量份甲醇中，加入10质量份活性炭，充分振摇，静置，待活性炭完全沉入底部。取上清液过大孔树脂固相萃取柱，流出液全部接收于圆底烧瓶中，75℃旋转蒸发除去甲醇，得到白色固体粉末，即为纯净的1-苄基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐离子液体。

实施例1

固相萃取填料的制备：分别称取1-苄基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐10.0g，1-癸基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐40.0g，甲醇200g，100目硅胶粉80.0g置于表面皿中，超声反应1h后放置过夜，于60℃下真空干燥12h，得到疏松的白色粉末状固体，即为固相萃取填料。

固相萃取柱的制备：称取上述固相萃取填料400mg，置于套筒中，压紧填料，依次盖上纤维板和塑料盖，最后套上耐压环即得。

上述固相萃取柱在利用高效液相色谱进行食品中碱性染料含量快速测定中的应用，其操作包括以下步骤：

碱性染料的提取：称取2.00g辣椒油于15mL离心管中，加入5mL乙腈，5mL甲醇，2mL正己烷。涡旋提取1min，超声提取1min。以8000r/min的转速离心3min，得到上清液，中间提取液层和沉淀物，弃去上清液。取中间提取液层于鸡心瓶中，用10mL蒸馏水洗涤该沉淀物，将洗涤后液并入盛放提取液的鸡心瓶中，60℃下旋转蒸发5min，至鸡心瓶中乙腈和甲醇完全蒸发，剩余水层，即为待测样品提取液；

碱性染料的纯化：用注射器吸取所述待测样品全部提取液，缓慢注入固相萃取柱，弃去流出液，此处耗时约30s。用注射器吸取15mL蒸馏水通过上述固相萃取柱，弃去流出液，此处耗时约30s。用注射器吸取15mL空气快速通过上述固相萃取柱，弃去流出液，吸取过程耗时5s。精确吸取2.00mL甲醇，缓慢通过上述固相萃取柱，接收全部流出液即得洗脱液，洗脱液摇匀后经0.45μm有机滤膜过滤后，以甲醇为空白根据前述色谱条件进行HPLC分析，得到待测样品中各种碱性染料的峰面积值如表12所示；

碱性染料含量的测定：根据表12中各种碱性染料的峰面积值，与前述步骤（3）同法操作，得到待测样品中各碱性染料的含量（表12）。

表12 实施例1样品待测液中各种碱性染料的峰面积值及含量

实施例2

固相萃取填料的制备：分别称取1-苄基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐20.0g，1-癸基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐50.0g，甲醇200g，100目硅胶粉120.0g置于表面皿中，超声反应1h后放置过夜，于70℃下真空干燥15h，得到疏松的白色粉末状固体，即为固相萃取填料。

固相萃取柱的制备：称取上述固相萃取填料600mg，其余操作同实施例1。

上述固相萃取柱在利用高效液相色谱进行食品中碱性染料含量快速测定中的应用，其操作包括以下步骤：

碱性染料的提取：称取2.00g黑枸杞于15mL离心管中，加入5mL乙腈，6mL甲醇，2mL正己烷。涡旋提取2min，超声提取2min。以10000r/min的转速离心4min，得到上清液，中间提取液层和沉淀物，弃去上清液。取中间提取液层于鸡心瓶中，用20mL蒸馏水洗涤该沉淀物，将洗涤后液并入盛放提取液的鸡心瓶中，65℃下旋转蒸发5min，至鸡心瓶中乙腈和甲醇完全蒸发，剩余水层，即为待测样品提取液；

碱性染料的纯化：具体操作同实施例1，得到的待测样品中各种碱性染料的峰面积值如表13所示。

碱性染料含量的测定：根据表13中各种碱性染料的峰面积值，与前述步骤（3）同法操作，得到待测样品中各碱性染料的含量（表13）。

表13 实施例2样品待测液中各种碱性染料的峰面积值及含量

实施例3

本实施例的固相萃取填料这样制得：分别称取1-苄基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐30.0g，1-癸基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐60.0g，甲醇200g，100目硅胶粉100.0g置于玻璃烧杯中，超声反应1h后放置过夜，于75℃下真空干燥18h，得到疏松的白色粉末状固体，即为固相萃取填料。

固相萃取柱的制备：称取上述固相萃取填料500mg，其余操作同实施例1。

上述固相萃取柱在利用高效液相色谱进行食品中碱性染料含量快速测定中的应用，其操作包括以下步骤：

碱性染料的提取：称取2.00g桑葚于15mL离心管中，加入6mL乙腈，6mL甲醇，2mL正己烷。涡旋提取4min，超声提取4min。以12000r/min的转速离心4min，得到上清液，中间提取液层和沉淀物，弃去上清液。取中间提取液层于鸡心瓶中，用30mL蒸馏水洗涤该沉淀物，将洗涤后液并入盛放提取液的鸡心瓶中，70℃下旋转蒸发10min，至鸡心瓶中乙腈和甲醇完全蒸发，剩余水层，即为待测样品提取液；

碱性染料的纯化：具体操作同实施例1，得到的待测样品中各种碱性染料的峰面积值如表14所示。

碱性染料含量的测定：根据表14中各种碱性染料的峰面积值，与前述步骤（3）同法操作，计算待测样品中各碱性染料的含量（表14）。

表14 实施例3样品待测液中各种碱性染料的峰面积值及含量

Claims (5)

1.一种食品中碱性染料固相萃取填料的制备方法，其特征在于：分别称取1-苄基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐10-30质量份，1-癸基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐40-60质量份，甲醇200质量份和100目硅胶粉80-120质量份，置于玻璃器皿中，超声反应1h后放置过夜，于60-75℃下真空干燥10h以上，得到疏松的白色粉末状固体，即为固相萃取填料。

2.一种使用权利要求1中所得固相萃取填料制成的食品中碱性染料固相萃取柱。

3.一种如权利要求2所述的食品中碱性染料固相萃取柱在利用高效液相色谱进行食品中碱性染料含量快速测定中的应用，其特征在于包括以下步骤：

（1）碱性染料的提取

于待测样品中以质量体积比2:4:4:2-2:6:6:2依次加入乙腈、甲醇和正己烷，涡旋提取1-4min、超声提取1-4min后离心，得到上清液，中间提取液层和沉淀物；弃去上清液，取出中间提取液，用蒸馏水洗涤沉淀物，将洗涤后液与中间提取液合并后旋转蒸发，至乙腈和甲醇完全蒸发，剩余水层即为待测样品提取液；

（2）碱性染料的纯化

将待测样品提取液缓慢注入固相萃取柱，依次吸取蒸馏水和空气清洗后，精确吸取2.00mL甲醇洗脱，接收全部流出液即得洗脱液，洗脱液摇匀后经0.45μm有机滤膜过滤，滤液以甲醇为空白进行HPLC分析，得到待测样品中各种碱性染料的峰面积值；色谱条件：色谱柱：C18 4.6×250 mm分析柱；检测器：二极管阵列检测器；流动相：pH3.5乙酸铵缓冲液:乙腈=90:10；流速：1 mL/min；柱温：35 ℃；进样量：20 μL；检测波长：490 nm；

（3）标准曲线的绘制

以甲醇为溶剂，配制不同质量体积浓度的碱性染料系列混合标准溶液，采用与步骤（2）中相同的色谱条件进行测定，并由色谱图得到所述混合标准溶液中碱性染料的保留时间和不同浓度下的峰面积；以质量体积浓度C（μg/mL）为横坐标，色谱峰面积A为纵坐标，绘制混合标准溶液每种碱性染料的标准曲线；

（4）碱性染料含量的测定

根据步骤（2）中得到的待测样品中各种碱性染料的峰面积值，从步骤（3）中绘制的每种碱性染料的标准曲线上找到该峰面积值对应的碱性染料的含量，按下式计算待测样品中各碱性染料的含量X：

式中：X表示待测样品中碱性染料的含量，单位μg/g；C₁- C₀表示步骤（2）中以甲醇为空白得到的待测样品中各碱性染料的峰面积所对应的碱性染料的含量，单位μg/mL；m表示待测样品的质量，单位g；V表示步骤（2）中洗脱溶剂甲醇的体积，单位mL。

4.如权利要求3所述的食品中碱性染料固相萃取柱在利用高效液相色谱进行食品中碱性染料含量快速测定中的应用，其特征在于：步骤（1）中，所述离心为以6000-12000r/min的转速离心2-5min。

5.如权利要求3所述的食品中碱性染料固相萃取柱在利用高效液相色谱进行食品中碱性染料含量快速测定中的应用，其特征在于：步骤（1）中，所述旋转蒸发为在60-70℃下旋转蒸发5-10min。

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