CN110937588B - 用于固定化酶的分级孔炭微球载体及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

一种用于固定化酶的分级孔炭微球载体及其制备方法和应用，属于固定化酶领域。该用于固定化酶的分级孔炭微球载体具有介孔‑大孔两级孔结构，且介孔结构存在于大孔孔壁上，形成三维互通的孔结构；在其表面和孔内壁上存在含氧官能团；其介孔孔径为10‑50nm，大孔孔径为50<大孔孔径≤220nm，比表面积为306‑631m2/g。其制备方法采用水热合成结合反向悬浮聚合法，再通过活性处理在分级孔炭微球表面及孔壁内构建含氧官能团，制备方法操作简单，成本较低，可控性强，重复性好。用本发明的用于固定化酶的分级孔炭微球载体固定果胶酶具有活性高、稳定性好、易回收等优点。

Description

用于固定化酶的分级孔炭微球载体及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于固定化酶技术领域，公开一种用于固定化酶的分级孔炭微球载体及其制备方法和应用。
背景技术
固定化酶(immobilizedenzyme)是20世纪60年代发展起来的新技术，被广泛用于食品生产、生物制药、生物传感器、医药工业、环保技术及生物技术等多种领域，如何提高固定酶活性、稳定性，重复使用性及其可再生性一直是研究的重点及难点。其中，载体作为固定化酶的重要组成部分，其结构和性能对固定化酶的性能和应用均具有重要的影响。
目前用于固定化酶的载体主要有无机材料、有机材料和无机有机复合材料，主要通过包埋法、吸附法、共价键结合法等将酶固定在载体上。包埋法只适合用于小分子底物和产物的酶催化反应；共价键结合法通常是通过酶分子表面氨基残基与载体上的活性基团的化学反应连接在一起，稳定性较好但会引起酶蛋白结构发生改变，使酶活性中心受损，进而导致酶活降低；吸附法操作简单，对于酶构象影响较小，但单纯的物理吸附法存在酶和载体相互作用较弱，酶易流失，稳定性较差等问题。因此如何控制固定化酶的微环境，提高固定化酶的固定化率和稳定性，是固定化酶技术领域的发展方向。
介孔炭材料的生物相容性好，无毒，物化性能稳定且具有丰富的孔结构，可为酶分子提供多点吸附和存储空间，而单一的介孔结构不利于大分子酶的吸附及酶和底物的接触，甚至可能造成阻塞现象。
针对上述问题，设计具有介孔-大孔结构的分级孔炭材料，介孔结构为酶的吸附提供吸附位点及存储空间，大孔结构提高酶和底物的接触，利于传质过程，避免发生阻塞现象。利用炭材料表面官能团丰富易活化处理构建含氧官能团的特性，结合孔结构的控制协同提升固定化酶的稳定性及活性。此外相比于块状和粉体材料而言，炭微球外表光滑规整、流动性好、强度高、耐磨且易于回收，因此本发明公开的用于固定化酶的分级孔炭微球载体及其制备和应用，对于固定化酶的工业化应用推广具有重要意义。
发明内容
针对上述现有技术存在的问题，本发明提供了一种用于固定化酶的分级孔炭微球载体及其制备方法和应用，该用于固定化酶的分级孔炭微球载体尤其适用于固定果胶酶，本发明的用于固定化酶的分级孔炭微球载体是一种微观孔结构和宏观球状形貌可控的分级孔炭微球，其具有介孔-大孔两级孔结构，且介孔结构存在于大孔孔壁形成三维互通的孔结构，其中介孔结构为酶的固定提供活性位点及存储空间，大孔结构利于底物和酶的接触和传质过程。本发明的用于固定化酶的分级孔炭微球载体的制备方法采用水热合成结合反向悬浮聚合法，再通过活性处理在炭微球表面及孔壁内构建含氧官能团，制备方法操作简单，成本较低，可控性强，重复性好。用本发明的用于固定化酶的分级孔炭微球载体固定果胶酶具有活性高、稳定性好、易回收等优点。
本发明的一种用于固定化酶的分级孔炭微球载体，具有介孔-大孔两级孔结构，且介孔结构存在于大孔孔壁上，形成三维互通的孔结构；在用于固定化酶的分级孔炭微球载体的表面和孔内壁上存在含氧官能团；
所述的用于固定化酶的分级孔炭微球载体的介孔孔径为10-50nm，大孔孔径为50<大孔孔径≤220nm，优选为80-220nm；比表面积为306-631m2/g。
所述的用于固定化酶的分级孔炭微球载体的宏观粒径分布在0.5-3.0mm。
所述的用于固定化酶的分级孔炭微球载体的制备方法，包括以下步骤：
步骤1：溶解
按摩尔比，称量各个物料；其中，按摩尔比，间苯二酚：P123表面活性剂：甲醛：盐酸：扩孔剂：蒸馏水：乙二醇＝1：(0.36-0.6)：2：(0.1-0.3)：(0-0.4)：86：(43-86)；
将乙二醇和蒸馏水混合，得到乙二醇和蒸馏水的混合体系；
将间苯二酚和P123表面活性剂溶解于乙二醇和蒸馏水的混合体系中，搅拌至溶液澄清，加入质量浓度为37％的盐酸水溶液，得到反应混合物；
步骤2：预聚
向反应混合物中加入质量浓度为37％的甲醛溶液后，再加入扩孔剂，在25-40℃进行搅拌预聚，得到预聚混合液；
步骤3：聚合
将预聚混合液置于含有石蜡油的反应釜中，在80-90℃搅拌聚合直至预聚混合液出现球状物质，搅拌速率为50-300r/min，得到球状聚合物；
步骤4：炭化
将球状聚合物老化2d后干燥，再在600-1000℃炭化1-5h，得到分级孔炭微球；所述的炭化气氛为氮气；
步骤5：表面活性处理
将分级孔炭微球置于表面改性溶剂中浸泡24h以上，取出洗涤至中性后干燥，在分级孔炭微球的表面和孔壁上构建含氧官能团，得到用于固定化酶的分级孔炭微球载体。
所述的步骤1中，搅拌的搅拌速率为300-500r/min。
所述的步骤2中，搅拌预聚时间为20-60min。
所述的步骤2中，扩孔剂优选为TMB或PEG。
所述的步骤3中，搅拌聚合时间优选为10-20min。
所述的步骤3中，所述的反应釜优选为聚四氟反应釜。
所述的步骤4中，干燥的温度为120-180℃，时间为24h以上。
所述的步骤4中，制备的分级孔炭微球其结构完整，分级孔炭微球的宏观粒径为0.5-3mm。
所述的步骤5中，表面改性溶剂根据含氧官能团类型确定，可以选用H2O2溶液或HNO3溶液。所述的H2O2溶液优选为10-30wt.％H2O2水溶液；所述的HNO3溶液优选为1-4mol/L的HNO3水溶液。
本发明的用于固定化酶的分级孔炭微球载体的应用，为将其用于固定酶，优选为果胶酶。
所述的固定酶的方法，包括以下步骤：
步骤一：
按配比，称量用于固定化酶的分级孔炭微球载体和酶，用缓冲液将酶配制成7-15U/mL的酶溶液；
按质量比，用于固定化酶的分级孔炭微球载体：酶＝1：(2-5)；
步骤二：
将用于固定化酶的分级孔炭微球载体和酶溶液混合，进行振荡吸附反应，反应温度为25-45℃，反应时间为30-150min，振荡速率为100-200r/min，振荡吸附后，将振荡产物用缓冲液洗涤直到上清液中检测不到酶活为止，得到分级孔炭微球载体固定化酶，备用。
所述的步骤一中，当酶为果胶酶时，缓冲液为柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液或醋酸缓冲液，其pH值为3-7。
本发明制备的分级孔炭微球载体固定化酶，固定化酶的固定化率最高可达到90％，酶活回收率最高可达到92.84％，在4℃储存60d后固定化酶的残余酶活最高可达到80％以上。重复使用10次后固定化酶的残余酶活仍为90％。
当本发明的固定酶为果胶酶时，得到的是分级孔炭微球载体固定化果胶酶。
本发明的一种用于固定化酶的分级孔炭微球载体及其制备方法和应用，相比于现有技术，其有益效果在于：
1、本发明的用于固定化酶的分级孔炭微球载体，存在介孔-大孔两级孔结构，且介孔存在于大孔孔壁上形成三维互通的孔结构。介孔结构为酶的固定提供多点吸附活性位和存储空间，控制吸附速率；大孔结构提高酶和底物的接触，更有利于传质过程。以蒸馏水和乙二醇为混合溶液，通过相分离原理形成大孔结构，嵌段共聚物P123在炭化后形成介孔结构，介孔存在于大孔孔壁上形成三维互通的孔结构，并可通过扩孔剂的添加进一步调控固定化酶载体的孔径。
2、通过控制煅烧温度及活化处理在用于固定化酶的分级孔炭微球载体表面及孔内壁构建含氧官能团，结合孔结构的控制通过亲和吸附将酶固定在分级孔炭微球上，降低了固定化过程中对酶活性中心的影响。
3、本发明用于固定化酶的分级孔炭微球载体，通过调控孔结构及其表面及孔内壁构建含氧官能团的协同作用使得酶的固定化效果优异，酶的固定化率、酶活回收率、固定化酶的稳定性及重复使用性均显著改善。酶的固定化率最高可达到90％，酶活回收率最高可达到92.84％，在4℃储存60d后固定化酶的残余酶活最高可达到80％以上。重复使用10次残余酶活最高为90％。
4、本发明制备过程简单易行，所使用的原料廉价易得，设备简单。适合大规模生产，在固定化酶领域具有巨大的应用前景。本发明固定酶载体材料还可用于固定其它酶。
附图说明
图1为本发明实施例1中分级孔炭微球的孔径分布图；
图2为本发明实施例1制得分级孔炭微球的微观形貌图；
图3为本发明实施例2中分级孔炭微球的孔径分布图；
图4为本发明实施例3中分级孔炭微球的孔径分布图；
图5为本发明实施例3中分级孔炭微球的微观形貌图；
图6为本发明实施例4中固定果胶酶的重复使用性；
图7为本发明实施例5中固定果胶酶的重复使用性。
具体实施方式
下面结合附图和实例对本发明进一步详细说明，但本发明的保护范围不仅限于这些实例。
以下实施例中，果胶酶的来源为植物、微生物、自己提取或是市售的商品化果胶酶。
实施例1：
一种用于固定化酶的分级孔炭微球载体的制备方法，所述的一种用于固定化酶的分级孔炭微球载体，其介孔结构的平均孔径为15nm，大孔结构为100nm，比表面积630m2/g，用于固定化酶的分级孔炭微球载体的宏观直径为2mm，用于固定化酶的分级孔炭微球载体的孔径分布图如图1所示，微观形貌图如图2所示，经活化后用于固定化酶的分级孔炭微球载体表面和孔壁上存在大量的羧基，具体制备方法如下：
步骤1：溶解
按摩尔比，称量各个物料；将乙二醇和蒸馏水混合，得到乙二醇和蒸馏水的混合体系；其中，按摩尔比，间苯二酚：P123：甲醛：盐酸：TMB：水：乙二醇的摩尔比为1：0.36：2：0.2：0.4：86：43；
将间苯二酚和P123表面活性剂溶解于乙二醇和蒸馏水的混合体系中，在搅拌速率为500r/min下剧烈搅拌完全溶解，加入37％盐酸水溶液搅拌均匀后，得到反应混合物；
步骤2：预聚
向反应混合物中滴加37％甲醛溶液，再加入TMB；在35℃水浴锅中搅拌预聚60min，得到预聚混合液；
步骤3：聚合
再将预聚混合液倒入含有石蜡油的反应釜中，85℃温度下搅拌，搅拌速度为200rpm，得到球状聚合物；
步骤4：炭化
将球状聚合物老化2d后于120℃烘箱中干燥24h，再经900℃炭化4h，炭化气氛为氮气，得到结构完整的分级孔炭微球；
步骤5：表面活性处理
将所制备的分级孔炭微球浸泡在2mol/LHNO3溶液浸泡24h，洗涤至中性后干燥备用。
实施例2：
一种用于固定化酶的分级孔炭微球载体的制备方法，所述的一种用于固定化酶的分级孔炭微球载体，其介孔结构的平均孔径为25nm，大孔结构为150nm，比表面积在393m2/g，用于固定化酶的分级孔炭微球载体的宏观直径为2mm，用于固定化酶的分级孔炭微球载体的孔径分布图如图3所示，经活化后的用于固定化酶的分级孔炭微球载体上存在大量的羧基，具体制备方法如下：
步骤1：溶解
按摩尔比，称量各个物料；将乙二醇和蒸馏水混合，得到乙二醇和蒸馏水的混合体系；其中，按摩尔比，间苯二酚：P123：甲醛：盐酸：TMB：水：乙二醇的摩尔比为1：0.4：2：0.1：0.4：86：70；
将间苯二酚和P123表面活性剂溶解于乙二醇和蒸馏水的混合体系中，在搅拌速率为500r/min下剧烈搅拌完全溶解，加入37％盐酸水溶液搅拌均匀后，得到反应混合物；
步骤2：预聚
向反应混合物中滴加37％甲醛溶液，使得在35℃水浴锅中搅拌预聚40min，得到预聚混合液；
步骤3：聚合
再将预聚混合液倒入含有石蜡油的反应釜中，85℃温度下搅拌，搅拌速度为200rpm，得到球状聚合物；
步骤4：炭化
将球状聚合物老化2d后于140℃烘箱中干燥24h，再经900℃炭化4h，炭化气氛为氮气，得到结构完整的分级孔炭微球；
步骤5：表面活性处理
将所制备的分级孔炭微球浸泡在2mol/LHNO3溶液浸泡24h，洗涤至中性后干燥备用。
实施例3：
一种用于固定化酶的分级孔炭微球载体的制备方法，所述的一种用于固定化酶的分级孔炭微球载体，其介孔结构的平均孔径为20nm，大孔结构为200nm，比表面积在313m2/g，用于固定化酶的分级孔炭微球载体的宏观直径为3mm，用于固定化酶的分级孔炭微球载体的孔径分布如图4所示，微观形貌图如图5所示，其表面存在大量的羧基，具体制备方法如下：
步骤1：溶解
按摩尔比，称量各个物料；将乙二醇和蒸馏水混合，得到乙二醇和蒸馏水的混合体系；其中，按摩尔比，间苯二酚：P123：甲醛：盐酸：TMB：水：乙二醇的摩尔比为1：0.4：2：0.1：0.6：86：80；
将间苯二酚和P123表面活性剂溶解于乙二醇和蒸馏水的混合体系中，在搅拌速率为500r/min下剧烈搅拌完全溶解，加入37％盐酸水溶液搅拌均匀后，得到反应混合物；
步骤2：预聚
向反应混合物中滴加37％甲醛溶液，使得在35℃水浴锅中搅拌预聚60min，得到预聚混合液；
步骤3：聚合
再将预聚混合液倒入含有石蜡油的反应釜中，85℃温度下搅拌，搅拌速度为150rpm，得到球状聚合物；
步骤4：炭化
将球状聚合物老化2d后于140℃烘箱中干燥24h，再经900℃炭化4h，炭化气氛为氮气，得到结构完整的分级孔炭微球；
步骤5：表面活性处理
将所制备的分级孔炭微球浸泡在20wt％H2O2溶液浸泡24h，洗涤至中性后干燥备用。
实施例4：
以实施例1的用于固定化酶的分级孔炭微球载体固定果胶酶，具体方法如下：
将果胶酶加入pH值为4.0的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液中，配制成10U/mL的果胶酶溶液，然后向150mL果胶酶溶液中加入10g用于固定化酶的分级孔炭微球载体，在摇床上于40℃振荡反应120min，振荡速率为150r/min，在4000rpm下离心5min后，将所得分级孔炭微球载体固定化酶用pH值为4.0的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液洗涤直至上清液中检测不到酶活，所制得固定化酶的固定化率为85％。将其在4℃中储存，储存60d后固定化酶的残余酶活为80％，表明固定化酶具有较好的储存性。
将10g分级孔炭微球载体固定化酶加入150mL果胶溶液中在摇床中振荡吸附，振荡温度为40℃，振荡速率为150r/min，振荡反应时间为120min后在4000rpm下离心5min得到分级孔炭微球载体固定化酶，用pH值为4.0的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液洗涤后再加入新的果胶酶溶液中，重复上述步骤，测定每次反应的酶活。固定化酶的重复使用性如图6所示，由图可知，随着重复使用次数的增加，分级孔炭微球载体固定化酶的活性逐渐降低，重复使用10次后分级孔炭微球载体固定化酶的残余酶活仍为88％，表明分级孔炭微球载体固定化酶有较好的重复使用性。
实施例5：
以实施例3的用于固定化酶的分级孔炭微球载体固定果胶酶，具体方法如下：
将果胶酶加入pH值为4.0的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液中，配制成13U/mL的果胶酶溶液，然后向150mL果胶酶溶液中加入10g用于固定化酶的分级孔炭微球载体，在摇床中振荡反应120min，振荡速率为120r/min，在4000rpm下离心5min后所得分级孔炭微球载体固定化酶用pH值为4.0的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液洗涤直至上清液中检测不到酶活，所制得分级孔炭微球载体固定化酶的固定化率为90％。将其在4℃中储存，储存60d后分级孔炭微球载体固定化酶的残余酶活为75％，表明分级孔炭微球载体固定果胶酶具有较好的储存性。
将10g分级孔炭微球载体固定化果胶酶加入150ml果胶溶液中在摇床中振荡吸附，振荡温度为40℃，振荡速率为150r/min，振荡反应时间为120min后在4000rpm下离心5min得到分级孔炭微球载体固定化酶，用pH值为4.0的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液洗涤后再加入新的果胶酶溶液中，重复上述步骤，测定每次反应的酶活。分级孔炭微球载体固定化酶的重复使用性如图7所示，由图可知，随着重复使用次数的增加，分级孔炭微球载体固定化酶的活性逐渐降低，但重复使用10次后分级孔炭微球载体固定化果胶酶的残余酶活仍为90％，表明分级孔炭微球载体固定化果胶酶有较好的重复使用性。
实施例6：
以实施例1的分级孔炭微球为载体固定果胶酶，其方法为：将果胶酶加入pH值为4.0的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液中，配制成12U/mL的果胶酶溶液，然后向150mL果胶酶溶液中加入10g用于固定化酶的分级孔炭微球载体，在摇床上于40℃振荡反应120min，振荡速率为150r/min，在4000rpm下离心5min后，将所得分级孔炭微球载体固定化酶用pH值为4.0的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液洗涤直至上清液中检测不到酶活，所制得分级孔炭微球载体固定化酶的固定化率为88％，对其稳定性进行测试，具体如下：
(1)游离酶和固定化酶的pH稳定性
向相同体积，不同pH值(2、3、4、5、6、7)的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液中添加果胶，使得果胶最终的浓度为7U/mL，再分别加入等量酶活的分级孔炭微球载体固定化酶或游离酶，在40℃振荡反应120min，测定游离酶和分级孔炭微球载体固定化酶在不同pH条件下的酶活，以检测酶活最高值为100％，计算不同pH条件下的相对酶活，结果如表1所示。
表1不同pH条件下的相对酶活
Figure BDA0002310589060000081
从表1可知，游离酶和分级孔炭微球载体固定化酶的相对酶活变化趋势相似，最大酶活均出现在pH为4时，但分级孔炭微球载体固定化酶在较宽的pH范围内保持相对稳定，表明酶的固定化显著提高了酶的耐受性，进而扩大酶的应用范围。
(2)游离酶和固定酶的温度稳定性
向相同体积，pH值为4的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液中添加果胶，使得果胶最终的浓度为7U/mL，再分别加入等量酶活的分级孔炭微球载体固定化酶或游离酶，将上述反应液分别在20℃、30℃、40℃、50℃、60℃下振荡吸附反应120min，测定游离酶和分级孔炭微球载体固定化酶在不同温度下的酶活。以检测酶活最高值为100％，计算不同温度下的相对酶活，结果如表2所示。
表2不同温度条件下的相对酶活
Figure BDA0002310589060000082
由表2可知，游离酶和分级孔炭微球载体固定化酶的最大酶活均出现在40℃，在60℃时，游离酶的相对酶活只有最高酶活的40％，而分级孔炭微球载体固定化酶在60℃时的相对酶活为75％。与游离酶相比，分级孔炭微球载体固定化酶的热稳定性得到显著改善。

Claims (10)

1.一种用于固定化酶的分级孔炭微球载体，其特征在于，该用于固定化酶的分级孔炭微球载体具有介孔-大孔两级孔结构，且介孔结构存在于大孔孔壁上，形成三维互通的孔结构；在用于固定化酶的分级孔炭微球载体的表面和孔内壁上存在含氧官能团；
所述的用于固定化酶的分级孔炭微球载体的介孔孔径为10-50nm，大孔孔径为50nm<大孔孔径≤220nm，比表面积为306-631m2/g；
所述的用于固定化酶的分级孔炭微球载体，采用以下步骤制得：
步骤1：溶解
按摩尔比，称量各个物料；其中，按摩尔比，间苯二酚：P123表面活性剂：甲醛：盐酸：扩孔剂：蒸馏水：乙二醇=1：(0.36-0.6)：2：(0.1-0.3)：(0-0.4)：86：(43-86)；
将乙二醇和蒸馏水混合，得到乙二醇和蒸馏水的混合体系；
将间苯二酚和P123表面活性剂溶解于乙二醇和蒸馏水的混合体系中，搅拌至溶液澄清，加入质量浓度为37%的盐酸水溶液，得到反应混合物；
步骤2：预聚
向反应混合物中加入质量浓度为37%的甲醛溶液后，再加入扩孔剂，在25-40℃进行搅拌预聚，得到预聚混合液；
步骤3：聚合
将预聚混合液置于含有石蜡油的反应釜中，在80-90℃搅拌聚合直至预聚混合液出现球状物质，搅拌速率为50-300r/min，得到球状聚合物；
步骤4：炭化
将球状聚合物老化2d后干燥，再在600-1000℃炭化1-5h，得到分级孔炭微球；炭化气氛为氮气；
步骤5：表面活性处理
将分级孔炭微球置于表面改性溶剂中浸泡24h以上，取出洗涤至中性后干燥，在分级孔炭微球的表面和孔壁上构建含氧官能团，得到用于固定化酶的分级孔炭微球载体。
2.根据权利要求1所述的用于固定化酶的分级孔炭微球载体，其特征在于，所述的用于固定化酶的分级孔炭微球载体的宏观粒径分布在0.5-3.0 mm。
3.权利要求1或2所述的用于固定化酶的分级孔炭微球载体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1：溶解
按摩尔比，称量各个物料；其中，按摩尔比，间苯二酚：P123表面活性剂：甲醛：盐酸：扩孔剂：蒸馏水：乙二醇=1：(0.36-0.6)：2：(0.1-0.3)：(0-0.4)：86：(43-86)；
将乙二醇和蒸馏水混合，得到乙二醇和蒸馏水的混合体系；
将间苯二酚和P123表面活性剂溶解于乙二醇和蒸馏水的混合体系中，搅拌至溶液澄清，加入质量浓度为37%的盐酸水溶液，得到反应混合物；
步骤2：预聚
向反应混合物中加入质量浓度为37%的甲醛溶液后，再加入扩孔剂，在25-40℃进行搅拌预聚，得到预聚混合液；
步骤3：聚合
将预聚混合液置于含有石蜡油的反应釜中，在80-90℃搅拌聚合直至预聚混合液出现球状物质，搅拌速率为50-300r/min，得到球状聚合物；
步骤4：炭化
将球状聚合物老化2d后干燥，再在600-1000℃炭化1-5h，得到分级孔炭微球；炭化气氛为氮气；
步骤5：表面活性处理
将分级孔炭微球置于表面改性溶剂中浸泡24h以上，取出洗涤至中性后干燥，在分级孔炭微球的表面和孔壁上构建含氧官能团，得到用于固定化酶的分级孔炭微球载体。
4.根据权利要求3所述的用于固定化酶的分级孔炭微球载体的制备方法，其特征在于，所述的步骤2中，搅拌预聚时间为20-60min；扩孔剂为TMB或PEG。
5.根据权利要求3所述的用于固定化酶的分级孔炭微球载体的制备方法，其特征在于，所述的步骤3中，搅拌聚合时间为10-20min。
6.根据权利要求3所述的用于固定化酶的分级孔炭微球载体的制备方法，其特征在于，所述的步骤4中，干燥的温度为120-180℃，时间为24h以上。
7.根据权利要求3所述的用于固定化酶的分级孔炭微球载体的制备方法，其特征在于，所述的步骤5中，表面改性溶剂根据含氧官能团类型确定，选用H2O2溶液或HNO3溶液。
8.权利要求1或2所述的用于固定化酶的分级孔炭微球载体的应用，其特征在于，为将用于固定化酶的分级孔炭微球载体用于固定酶。
9.根据权利要求8所述的用于固定化酶的分级孔炭微球载体的应用，其特征在于，所述的固定酶的方法，包括以下步骤：
步骤一：
按配比，称量用于固定化酶的分级孔炭微球载体和酶，用缓冲液将酶配制成7-15U/mL的酶溶液；
按质量比，用于固定化酶的分级孔炭微球载体：酶=1：(2-5)；
步骤二：
将用于固定化酶的分级孔炭微球载体和酶溶液混合，进行振荡吸附反应，反应温度为25-45℃，反应时间为30-150min，振荡速率为100-200r/min，振荡吸附后，将振荡产物用缓冲液洗涤直到上清液中检测不到酶活为止，得到分级孔炭微球载体固定化酶，备用。
10.根据权利要求9所述的用于固定化酶的分级孔炭微球载体的应用，其特征在于，制备的分级孔炭微球载体固定化酶，固定化酶的固定化率最高可达到90%，酶活回收率最高可达到92.84%，在4℃储存60d后固定化酶的残余酶活最高可达到80%以上，重复使用10次后固定化酶的残余酶活仍为90%。
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