CN110904268A - 用于检测高油酸转基因大豆的探针引物组合、试剂盒及方法 - Google Patents
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Abstract
一种用于检测高油酸转基因大豆的探针引物组合，包含一对连接依赖探针和一对通用引物；所述连接依赖探针基于一定原则针对高油酸转基因大豆外源基因设计获得，所述通用引物只对连接依赖探针有特异性，对于大豆基因组序列无特异性。本发明还提供了高油酸转基因大豆的检测方法及试剂盒。利用本发明提供的外源插入片段左边界侧翼序列及特异性检测方法，对转基因大豆事件E2D8037‑3、亲本、其它转基因大豆事件及常见农作物，进行特异性检测，从而实现对转基因大豆及其产品的有效监督管理。
Description
技术领域
本申请涉及基因工程技术领域，具体而言涉及一种检测高油酸转基因大豆事件E2D8037-3的MLPA的探针引物组合、方法及试剂盒。
背景技术
对转基因产品的检测可以从DNA水平、转入新基因的mRNA转录水平、表达蛋白水平、代谢物水平等几个方面进行。目前国内外对转基因产品检测技术的研究主要集中在核酸和蛋白两个水平上，实际检测工作中，以DNA为基础的检测技术以其较高的灵敏度和较好的特异性得到了广泛应用。
RNAi干扰(RNA interference，RNAi)是指由双链RNA(double-stranded RNA，dsRNA)诱导细胞内同源mRNA高效特异性降解，从而使特定基因表达受抑制或使其沉默的现象。RNAi干扰转基因产品与常规转基因产品的研发过程相似，都需要利用载体和元件，经基因枪、农杆菌转化或花粉管通道等方法，使外源基因整合到植物基因组中。因此，目前对RNAi干扰新型转基因产品的特异性检测也参照传统转基因作物。
转化事件特异性PCR检测是通过检测外源插入载体与受体基因组的连接区序列实现的。由于转化过程中外源基因插入具有随机性，因此，对每一个转基因作物品系，外源插入载体与受体基因组的连接区序列都不相同，并且连接区序列是单拷贝的，所以转化事件特异性检测方法具有非常高的特异性和准确性。
在转化事件特异性的检测技术中，普通PCR技术是应用最为广泛的。PCR是一种在体外对特定区段的DNA复制的方法。此方法具有直接、简便、快速、灵敏等特点，随着PCR技术的迅速发展，国内外许多科研单位及监督管理机构将PCR技术应用于转基因产品的检测，并制定基于普通PCR技术的定性检测国家标准。在公开号为CN108456679A的中国专利申请中通过基因组重测序技术和PCR技术，获得转基因大豆事件E2D8037-3外源插入片段左、右边界侧翼序列，并依据其序列特征，建立该转化事件特异性检测方法。然而普通PCR反应中使用的Taq酶缺乏3'→5'端外切酶活性，使PCR扩增有一定程度的错误掺入，另外，由于在扩增时引物的非特异性容易产生交叉扩增，当实验室污染后，容易出现假阳性的结果。
多重连接依赖探针扩增技术(Multiplex ligation dependent probeamplification,MLPA)是一种高通量、针对靶核酸序列进行定性定量分析的技术。MLPA具有两步，第一步利用简单的杂合和连接，第二部利用PCR扩增技术，该技术的特色之一是仅扩增连接完好的探针,而不是扩增样本靶序列。对于第一步探针与靶序列的杂交和连接，大大提高了多重反应的特异性，这是由于只有长、短探针同时与靶序列完全互补杂交后才可以被连接成为一条完整的单链；若其中一条探针的杂交序列不能完全与待测序列互补，甚至只差一个碱基，也会因为探针杂交不完全而使连接反应无法进行。
对现有专利和文献检索分析后，目前尚无针对高油酸转基因大豆E2D8037-3的MLPA检测相关的文章和专利等文献，如何对高油酸转基因大豆进行检测是当前亟需解决的问题。
发明内容
现有的基于普通PCR的转基因检测方法已不能满足高特异性和高通量的要求。因此，需要针对不同的转化事件开发和建立特异性更高的检测方法和试剂盒.针对上述技术问题，本发明针对转基因大豆E2D8037-3的左边界侧翼序列设计了连接依赖探针，建立该转化事件特异性精准检测方法，为转基因大豆事件E2D8037-3及其衍生品种或品系商业化应用及监督管理提供技术支持和依据。
本发明公开了一种用于检测高油酸转基因大豆的探针引物组合，包含一对连接依赖探针和一对通用引物；其中，所述连接依赖探针基于下述方法之一得到：
1)上游连接依赖探针的杂交序列基于外源基因序列设计，下游连接依赖探针的杂交序列基于大豆基因组设计；
2)上游连接依赖探针的杂交序列包含左边界序列中的插入位点，既包含部分外源基因序列也包含部分大豆基因组序列，下游连接依赖探针的杂交序列基于大豆基因组设计；
3)上游连接依赖探针的杂交序列基于外源插入基因设计，下游连接依赖探针的杂交序列跨过插入位点，既包含部分外源基因序列也包含部分大豆基因组序列；
所述通用引物只对连接依赖探针有特异性，对于大豆基因组序列无特异性。
在根据本发明的一个实施方案中，所述探针序列分别为SEQ ID NO:2和SEQ IDNO:3；
在根据本发明的一个实施方案中，所述通用引物分别为SEQ ID NO:4和SEQ IDNO:5。
在根据本发明的一个实施方案中，所述外源基因序列为SEQ ID NO:1。
本发明进一步提供了一种高油酸转基因大豆的检测方法，包括：
1)提取样本基因组；优选地，所述样本基因组通过CTAB法提取获得；
2)将步骤1所述的样本基因组与上述的探针引物组合中的连接依赖探针与样本基因组混合后进行探针连接反应；
3)将步骤2)得到的探针连接产物与上述的探针引物组合中的通用引物混合，进行扩增反应；
4)检测扩增反应后的反应液中是否存在目标外源基因。
在根据本发明的一个实施方案中，所述探针连接反应过程为
预变性95℃，3min；
变性95℃，15s，退火60℃，5min；
循环重复变性-退火步骤一定次数；优选为20个循环；
DNA连接酶热失活98℃，5min。
在根据本发明的一个实施方案中，通用单引物PCR扩增过程为：
预变性95℃，8min；
变性95℃，15s，退火60℃，60min；
循环重复变性-退步骤一定次数，优选为45个循环：
终止延伸，72℃，10min。
在根据本发明的一个实施方案中，步骤4)通过凝胶电泳检测扩增反应后的反应液的。
本发明还提供了一种用于检测高油酸转基因大豆的试剂盒，包含连接依赖探针溶液、通用引物溶液；其中，所述连接依赖探针溶液中的连接依赖探针的核苷酸序列分别为SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3；所述通用引物溶液中的通用引物的核苷酸序列分别为SEQ IDNO:4和SEQ ID NO:5。
在根据本发明的一个实施方案中，所述试剂盒还包含DNA连接酶和DNA聚合酶。
在根据本发明的一个实施方案中，所述试剂合中所述DNA连接酶为Ampligase DNA连接酶；优选地，所述DNA聚合酶为Ex Taq DNA聚合酶。
本发明具有以下有益效果：
1)本发明利用转基因大豆事件E2D8037-3外源插入片段左边界侧翼序列特征，建立MLPA检测技术中连接依赖探针设计原则；
2)利用转基因大豆事件E2D8037-3外源插入片段左边界侧翼序列特征，建立转基因大豆事件E2D8037-3特异性定性MLPA检测方法和制备检测试剂盒，确定该检测体系灵敏度。
3)利用本发明提供的外源插入片段左边界侧翼序列及特异性检测方法，对转基因大豆事件E2D8037-3、亲本、其它转基因大豆事件及常见农作物，进行特异性检测，从而实现对转基因大豆及其产品的有效监督管理。
附图说明
图1为MLPA连接依赖探针设计原理示意图；
图2为MLPA转基因大豆事件E2D8037-3检测特异性验证实验电泳图，其中，M:DNA分子量标准(DL2000),1-2：转基因大豆E2D8037-3种子，3-4：转基因大豆GTS40-3-2，5-6：栽培大豆Williams82(亲本)，7-8：玉米叶片，9-10：棉花叶片，11-12：空白对照；
图3为MLPA转基因大豆事件E2D8037-3检测灵敏度实验电泳图；其中，M:DNA分子量标准(DL2000),1-2：5ng，3-4：0.5ng，5-6：0.05ng，7-8：0.005ng，9-10：0.0005ng，11-12：空白对照。
具体实施方式
以下实施例用于说明本申请，但不用来限制本申请的范围。
下面将更详细地描述本申请的具体实施例。提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本申请，并且能够将本申请的范围完整的传达给本领域的技术人员。
如在通篇说明书及权利要求当中所提及的“包含”或“包括”为一开放式用语，故应解释成“包含但不限定于”。说明书后续描述为实施本申请的较佳实施方式，然所述描述乃以说明书的一般原则为目的，并非用以限定本申请的范围。本申请的保护范围当视所附权利要求所界定者为准。
实施例1.转基因大豆的MLPA连接依赖探针和通用引物设计
通过Primer Premier等引物设计软件针对E2D8037-3左边界侧翼序列外源基因(核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示)和大豆基因组连接区域设计连接依赖探针(设计原理见图1)。其中连接依赖探针中的杂交序列可依照下述三种设计方式之一进行：
1，上游和下游连接依赖探针的杂交序列正好分别位于插入位点两侧，即上游连接依赖探针的杂交序列基于外源基因序列设计，下游连接依赖探针的杂交序列基于大豆基因组设计；
2，上游连接依赖探针的杂交序列包含左边界序列中的插入位点，既包含部分外源插入基因序列也包含部分大豆基因组序列，下游连接依赖探针的杂交序列基于大豆基因组设计；
3，上游连接依赖探针的杂交序列基于外源插入基因设计，下游连接依赖探针的杂交序列跨过插入位点，既包含部分外源插入基因序列也包含部分大豆基因组序列；
通用引物的设计原则是其不能于大豆玉米基因组产生特异性结合。
基于上述原则本申请设计了下述探针和通用引用组合：
包括一对连接依赖探针(LP-F/R),一对通用引物(UP-F/R)，其中连接依赖探针对于检测E2D8037-3具有特异性，而通用引物只对连接依赖探针有特异性，对于E2D8037-3无特异性。上述连接依赖探针和引物的核苷酸序列分别为：
SEQ ID NO:2(LP-F):CAGGCGCCGCATTTTTATTGCcaataaatttcaattt gtgattattt
SEQ ID NO:3(LP-R):ataacatggtggagcacgacaCTACGGCAAATGTCAT CGACG
SEQ ID NO:4(UP-F):CAGGCGCCGCATTTTTATTGC
SEQ ID NO:5(UP-R):CGTCGATGACATTTGCCGTAG
实施例2.转基因大豆事件E2D8037-3特异性MLPA PCR检测方法
采用CTAB法提取转基因大豆E2D8037-3种子基因组，首先将种子材料采用研磨仪粉碎成粉末；称取60±10mg粉末加入到1.5mL的离心管中；加入1200μL(65℃预热)CTAB裂解缓冲液，于65℃水浴中孵育40min，期间颠倒混匀5次。室温条件下，12000g离心10min，取上清液转至另一新离心管中；加入等体积的Tris饱和酚/氯仿/异戊醇(V/V/V＝25/24/1)抽提两次，用氯仿/异戊醇(V/V＝24/1)抽提一次，12000g离心10min；小心吸取上清液，加入2/3体积的异丙醇，小心混匀；-20℃沉淀30min；12000g离心10min，弃去上清液，将液体尽量吸净；加入700μL 70％乙醇洗涤沉淀；12000g离心5min，弃掉上清液，将液体尽量吸净；晾干沉淀。加入50μL双蒸水或TE缓冲液溶解沉淀；加入2.5μL RNase A(10mg/mL)，37℃水浴孵育30min。
测定基因组的浓度并调整为50ng/μL，然后将此浓度的基因组10倍倍比稀释，制备成系列梯度浓度的标准DNA模板。按照表1配置反应体系。
表1MLPA转化时间特异性检测反应体系
探针连接程序设置为：预变性(95℃，3min)；20个循环：变性(95℃，15s)，退火(60℃，5min)；DNA连接酶热失活(98℃，5min)；
通用单引物PCR扩增程序设置为：预变性(95℃，8min)；45个循环：变性(95℃，15s)，退火(60℃，60min)；终止延伸(72℃，10min)。
采用2％的琼脂糖凝胶电泳检测MLPA产物，紫外下观察电泳条带。
实施例3转基因大豆事件E2D8037-3特异性MLPA检测灵敏度
制备了五个不同E2D8037-3基因组浓度(5ng/μL，0.5ng/μL，0.05ng/μL，0.05ng/μL，0.005ng/μL)的样品，以这些样品为模板进行扩增。采用2％的琼脂糖凝胶电泳检测MLPA产物，紫外下观察电泳条带。该方法的检测灵敏度可低至0.5ng。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本申请作了详尽的描述，但在本申请基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本申请精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本申请要求保护的范围。
序列表
<110> 昆明理工大学
<120> 用于检测高油酸转基因大豆的探针引物组合、试剂盒及方法
<130> 201905
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 895
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
gccaccactc ccaatgacaa cattttttcg taataacatt tgacgttaat ttgatatgga 60
gtatgaacac attttcttac atagttgtac taaacataat tttattggta aaaattaatt 120
aaaaaaatat aaaagtatgt atatggttta acaaataagg aatgacatta acattatttt 180
ggaatgccaa taaatttcaa tttgtgatta tttataacat ggtggagcac gacacacttg 240
tctactccaa aaatatcaaa gatacagtct cagaagacca aagggcaatt gagacttttc 300
aacaaagggt aatatccgga aacctcctcg gattccattg cccagctatc tgtcacttta 360
ttgtgaagat agtggaaaag gaaggtggct cctacaaatg ccatcattgc gataaaggaa 420
aggctatcgt tcaagatgcc tctaccgaca gtggtcccaa agatggaccc ccacccacga 480
ggagcatcgt ggaaaaagaa gacgttccaa ccacgtcttc aaagcaagtg gattgatgtg 540
atatctccac tgacgtaagg gatgacgcac aatcccacta tccttcgcaa gacccttcct 600
ctatataagg aagttcattt catttggaga ggacctcgag aattaattct caacacaaca 660
tatacaaaac aaacgaatct caagcaatca agcattctac ttctattgca gcaatttaaa 720
tcatttcttt taaagcaaaa gcaattttct gaaaattttc accatttacg aacgggggat 780
ctaccatgag cccagaacga cgcccggccg acatccgccg tgccaccgag gcggacatgc 840
cggcggtctg caccatcgtc aaccactaca tcgagacaag cacggtcaac ttccg 895
<210> 2
<211> 47
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
caggcgccgc atttttattg ccaataaatt tcaatttgtg attattt 47
<210> 3
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
ataacatggt ggagcacgac actacggcaa atgtcatcga cg 42
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
caggcgccgc atttttattg c 21
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 5
cgtcgatgac atttgccgta g 21
Claims (10)
1.一种用于检测高油酸转基因大豆的探针引物组合，其特征在于，包含一对连接依赖探针和一对通用引物；其中，所述连接依赖探针基于下述方法之一得到：
1)上游连接依赖探针的杂交序列基于外源基因序列设计，下游连接依赖探针的杂交序列基于大豆基因组设计；
2)上游连接依赖探针的杂交序列包含左边界序列中的插入位点，既包含部分外源基因序列也包含部分大豆基因组序列，下游连接依赖探针的杂交序列基于大豆基因组设计；
3)上游连接依赖探针的杂交序列基于外源插入基因设计，下游连接依赖探针的杂交序列跨过插入位点，既包含部分外源基因序列也包含部分大豆基因组序列；
所述通用引物只对连接依赖探针有特异性，对于大豆基因组序列无特异性。
2.如权利要求1所述的探针引物组合，其特征在于，所述探针序列分别为SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3。
3.如权利要求2所述的探针引物组合，其特征在于，所述通用引物分别为SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5。
4.如权利要求1-3中任一项所述的探针引物组合，其特征在于，所述外源基因序列为SEQ ID NO:1。
5.一种高油酸转基因大豆的检测方法，其特征在于，包括：
1)提取样本基因组；
2)将步骤1所述的样本基因组与如权利要求1-3中任一项所述的探针引物组合中的连接依赖探针与样本基因组混合后进行探针连接反应；
3)将步骤2)得到的探针连接产物与权利要求1-3中任一项所述的探针引物组合中的通用引物混合，进行扩增反应；
4)检测扩增反应后的反应液中是否存在目标外源基因。
6.如权利要求5所述的检测方法，其特征在于，所述探针连接反应过程为：
预变性 95℃，3min；
变性 95℃，15s，退火60℃，5min；
循环重复变性-退火步骤一定次数；
DNA连接酶热失活98℃，5min。
7.如权利要求5或6所述的检测方法，其特征在于，通用单引物PCR扩增过程为：
预变性 95℃，8min；
变性 95℃，15s，退火60℃，60min；
循环重复变性-退步骤一定次数；
终止延伸，72℃，10min。
8.如权利要求5或6所述的检测方法，其特征在于，步骤4)通过凝胶电泳检测扩增反应后的反应液的。
9.一种用于检测高油酸转基因大豆的试剂盒，其特征在于，包含连接依赖探针溶液、通用引物溶液；其中，所述连接依赖探针溶液中的连接依赖探针的核苷酸序列分别为SEQ IDNO:2和SEQ ID NO:3；所述通用引物溶液中的通用引物的核苷酸序列分别为SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5。
10.如权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，还包含DNA连接酶和DNA聚合酶。
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| CN201911402163.1A CN110904268A (zh) | 2019-12-30 | 2019-12-30 | 用于检测高油酸转基因大豆的探针引物组合、试剂盒及方法 |
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|---|---|---|---|---|
| CN103397087A (zh) * | 2013-06-24 | 2013-11-20 | 深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心 | 转基因成分mlpa检测的探针及制备其长探针的引物 |
| CN108456679A (zh) * | 2018-02-03 | 2018-08-28 | 吉林省农业科学院 | 高油酸转基因大豆事件e2d8037-3外源插入片段侧翼序列及其应用 |
-
2019
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Non-Patent Citations (2)
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| 肖静等: "《现代医学检验技术》", 31 January 2018, 天津科学技术出版社 * |
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