CN110904035A - 促进精原干细胞增殖的培养方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种促进精原干细胞增殖的培养方法，其包括：培养过程中应用了细叶石斛酚A。细叶石斛酚A在细胞培养液中的终浓度为100‑300mg/L。步骤为：（1）精原干细胞的分离与纯化；（2）细胞饲养层的制备；制备Sertoli细胞饲养层；（3）诱导共培养：将分离获得的精原干细胞制备成悬液，将精原干细胞接种于Sertoli细胞饲养层上。

Description

促进精原干细胞增殖的培养方法及其应用

技术领域

本发明涉及一种促进精原干细胞增殖的培养方法及其应用，属于细胞培养技术领域。

背景技术

随着社会生活节奏及生活环境的快速变化，男性不育的比率不断增加。精原干细胞(spermatogonial stemcells，SSCs)是位于睾丸生精管基膜上具有永生化和多能化潜能的一类原始生精细胞，是精子形成的前体细胞。一方面可以不断自我更新换代，另一方面又可以分化与增殖，进而扩增为男性精子细胞形成成熟精子。所有精原干细胞均位于雄性睾丸生精上皮基膜内侧，包括多种类型，A型、B型及In型。研究认为，精原干细胞是先从A型过渡到In型，再分化至B型。精原干细胞经过有丝分裂产生初级精母细胞，再分化为次级精母细胞，最终形成成熟的精子，最终保持男性精子数量及活力。研究精原干细胞对于治疗男性无精子症具有广阔的临床应用价值。体外建立快速、有效的培养方法以获得满足临床治疗应用的精原干细胞，是进行精原干细胞移植有待解决的主要问题。

细叶石斛Dendrobium hancockii Rolfe 是兰科（Orchidaceae）石斛属Dendrobium Sw. 多年生草本植物，又名姬竹叶石斛，生于海拔700～1 500 m 的山地林中树干上或山谷岩石上，在我国主要分布于陕西秦岭以南、甘肃南部、湖北东南部、湖南东南部、广西西北部、贵州南部至西南部和云南东南部，在贵州主要分布于罗甸、望谟、册亨、安龙和兴义。石斛属植物多为传统名贵中药，含有类型多样的化学成分，除了特征性成分生物碱外，主要还有联苯类、菲类、芴酮类、黄酮类和萜类等，药理研究表明石斛属植物有多种生物活性，如增强免疫力、缓解糖尿病及其并发症、抗肿瘤、抗氧化和延缓衰老、护肝抗炎、神经系统保护作用等。

本发明旨在提供一种促进精原干细胞增殖的培养方法及其应用，在辅助生殖领域具有很大的应用潜力。

发明内容

本发明的目的是提供一种促进精原干细胞增殖的培养方法及其应用，在辅助生殖领域具有很大的应用潜力。

细叶石斛Dendrobium hancockii Rolfe 是兰科（Orchidaceae）石斛属Dendrobium Sw. 多年生草本植物，又名姬竹叶石斛，生于海拔700～1 500 m 的山地林中树干上或山谷岩石上，在我国主要分布于陕西秦岭以南、甘肃南部、湖北东南部、湖南东南部、广西西北部、贵州南部至西南部和云南东南部，在贵州主要分布于罗甸、望谟、册亨、安龙和兴义。石斛属植物多为传统名贵中药，含有类型多样的化学成分，除了特征性成分生物碱外，主要还有联苯类、菲类、芴酮类、黄酮类和萜类等，药理研究表明石斛属植物有多种生物活性，如增强免疫力、缓解糖尿病及其并发症、抗肿瘤、抗氧化和延缓衰老、护肝抗炎、神经系统保护作用等。

遵义医科大学药学院从细叶石斛中分离得到一种新的化合物细叶石斛酚A：3,α-二羟基- 4,5,3′-三甲氧基联苄，其分子式为C17H20O5，其HMBC结构如下：

。

本发明团队意外发现细叶石斛酚A可以应用于促进精原干细胞增殖，在辅助生殖医疗技术领域具有很大的应用潜力。

本发明所需要解决的技术问题可以通过以下技术方案来实现。

一种促进精原干细胞增殖的培养方法，其包括：

培养过程中应用了细叶石斛酚A。

作为优选，其步骤如下：

（1）精原干细胞的分离与纯化：

作为优选，其具有方法为：每次实验取幼鼠5只，试验重复3次。幼鼠颈椎脱臼处死，75%乙醇溶液浸泡消毒5 min，无菌操作条件下取出小鼠睾丸组织，用无菌PBS冲洗，去除附睾、白膜，将散开的曲细精管用剪刀剪成小段，无菌PBS反复洗涤，沉淀后弃去上清液，加入10倍量睾丸组织的1 g/L Ⅳ型胶原酶溶液和少量的1 g/L的DnaseⅠ溶液，置于37 ℃条件下消化30 min，加入等量0.25%胰蛋白酶溶液消化10 min，最后加入使用10%胎牛血清的培养基终止消化。将细胞悬液以1 000 r/min低温离心5 min，弃去上清液，再重复以上操作2次。最后加入等量含双抗、体积分数为10%胎牛血清的培养基悬浮制成单细胞悬液。用400目细胞筛过滤，置于37 ℃、体积分数为5% CO₂培养箱中孵育，根据培养基颜色变化及细胞贴壁速度进行再纯化。

（2）细胞饲养层的制备：

4h后将未贴壁细胞除去，同时吸去培养液， 10%胎牛血清的DMEM培养液于培养箱中培养48 h，加入低渗Tris-HCl缓冲液(20 mmol/L)处理5 min，用Hank’s液洗涤2次，再加入培养液于培养箱中培养。取生长密集的Sertoli细胞培养皿，除去培养液，加入10倍体积丝裂霉素C(10μg/L)于培养箱中培养细胞3 h，再加入等量0.25%胰蛋白酶溶液消化10 min，重新加入培养基，将细胞接种于孔板中，于培养箱中培养，待细胞贴壁后作为饲养层。

（3）诱导共培养：

将分离获得的精原干细胞制备成悬液，加入以细胞密度1×10⁵/ml将精原干细胞接种于Sertoli细胞饲养层上，2 d换培养液1次，在细胞培养液中加入细叶石斛酚A。

所述细胞培养液为：含有10%胎牛血清的美国Gibco公司出产的DMEM培养基 ，在此基础上加入细叶石斛酚A。

作为优选，细叶石斛酚A在细胞培养液中的终浓度为100-300mg/L。

本发明的优点：

本发明发现细叶石斛酚A可以应用于促进精原干细胞增殖，进而提供了一种简单易行的精原干细胞体外增殖的方法，在辅助生殖医疗技术领域具有很大的应用潜力。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

本发明的具体实施例如以下说明。

实验于2018年6月至2019年10月在河北北方学院附属第一医院实验室完成。

实施例1

一种促进精原干细胞增殖的培养方法，其包括：

（1）精原干细胞的分离与纯化：

选择8周龄SPF级雄性昆明小白鼠15只，体质量35-40 g。每次实验取幼鼠5只，试验重复3次。幼鼠颈椎脱臼处死，75%乙醇溶液浸泡消毒5 min，无菌操作条件下取出小鼠睾丸组织，用无菌PBS冲洗，去除附睾、白膜，将散开的曲细精管用剪刀剪成小段，无菌PBS反复洗涤，沉淀后弃去上清液，加入10倍量睾丸组织的1 g/L Ⅳ型胶原酶溶液和少量的1 g/L的DnaseⅠ溶液，置于37 ℃条件下消化30 min，加入等量0.25%胰蛋白酶溶液消化10 min，最后加入使用10%胎牛血清的培养基终止消化。将细胞悬液以1 000 r/min低温离心5 min，弃去上清液，再重复以上操作2次。最后加入等量含双抗、体积分数为10%胎牛血清的培养基悬浮制成单细胞悬液。用400目细胞筛过滤，置于37 ℃、体积分数为5% CO₂培养箱中孵育，根据培养基颜色变化及细胞贴壁速度进行再纯化。

（2）细胞饲养层的制备：

4h后将未贴壁细胞除去，同时吸去培养液， 10%胎牛血清的DMEM培养液于培养箱中培养48 h，加入低渗Tris-HCl缓冲液(20 mmol/L)处理5 min，用Hank’s液洗涤2次，再加入培养液于培养箱中培养。取生长密集的Sertoli细胞培养皿，除去培养液，加入10倍体积丝裂霉素C(10μg/L)于培养箱中培养细胞3 h，再加入等量0.25%胰蛋白酶溶液消化10 min，重新加入培养基，将细胞接种于孔板中，于培养箱中培养，待细胞贴壁后作为饲养层。

（3）诱导共培养：

将分离获得的精原干细胞制备成悬液，加入以细胞密度1×10⁵/ml将精原干细胞接种于Sertoli细胞饲养层上，2 d换培养液1次，在细胞培养液中加入细叶石斛酚A。每次换液也加入含有相同浓度的叶石斛酚A细胞培养液。

细叶石斛酚A在细胞培养液中的终浓度处理分为3个平行组，每24 h观察细胞培养形态及增殖状况。

实验共有4组，分别为空白对照组(单纯细胞培养基)，实验组1(步骤（3）细胞培养基+100 mg/L细叶石斛酚A)，实验组2(细胞培养基+200 mg/L细叶石斛酚A)，实验组3(细胞培养基+300 mg/L细叶石斛酚A)。细胞连续培养7天。

实施例2

碱性磷酸酶染色检测 细胞培养7 d后，将待染色的精原干细胞用磷酸盐缓冲液洗涤3次，每次5 min，常温下用40 g/L多聚甲醛固定20 min，磷酸盐缓冲液洗涤3次，每次5 min，加入pH 9.0的Tris-HCl溶液25 mL洗涤1次，然后用BCIP/NBT底物显色试剂盒按说明书操作染色，避光条件下培育30 min，用磷酸盐缓冲溶液洗涤终止反应，于倒置显微镜下观察细胞形态。

结果显示：精原干细胞于培养箱中培养7 d，细胞生长快速，数量增长明显，细胞形成克隆团，碱性磷酸酶染色呈红棕色，细胞生长形态呈集落样和葡萄串样，细胞团数量增加明显，符合精原干细胞的增殖特征。

实施例3

各个试验组培养7天，细胞培养7 d后，用胰酶消化液对细胞进行消化，PBS洗2次，收集细胞清洗液，加入FITC标记的Annexin-V室温避光孵育30 min，加入PI试剂，避光孵育5min，加入适量缓冲溶液，按照试剂盒说明书在流式细胞仪上进行检测，使用流式细胞仪检测各组细胞的生长周期判断细胞增殖检测精原干细胞的活性率。

统计学处理：使用SPSS16.0,进行统计学分析，计量资料的结果表示为均值±标准差,采用组间t检验。当P＜0．05，表明差异具有统计学意义。具体结果如表1所示。

表1 流式细胞仪检测精原干细胞的活性率 （%）

	7d的活性率
		空白对照组	61.77±10.82
实验组1组	91.42±16.93<sup>*</sup>
		实验组2组	95.31±12.33<sup>*</sup>
实验组3组	99.56±14.62<sup>*</sup>

注：t检验,*：P<0.05 (与空白对照组比较)

精原干细胞活性率：实验组与空白对照组比较，差异均有显著性意义(P < 0.05)。含有细叶石斛酚A的培养基，随着浓度的增加，其精原干细胞的活性率更高。

实施例4

荧光免疫鉴定已知抗原的表达

精原干细胞中的GFRa-1蛋白均表达于细胞膜和细胞质中，主要表达于细胞膜中。

将培养7d后的精原干细胞接种于玻片上，在细胞与玻片融合达70%时，PBS漂洗2次，用40 g/L多聚甲醛溶液在常温下孵育15 min，0.1 % Tris X-100进行破膜处理10 min，PBS漂洗，牛血清蛋白封闭。一抗在4 ℃条件下孵育过夜，PBS漂洗，加入二抗室温孵育1 h，PBS漂洗，用DAPI复染核10 min，使用荧光猝灭剂封固，荧光显微镜下进行观察。一抗为GFRa-1多克隆抗体，二抗为Cy1标记的IgG。

免疫组化荧光显示在体外培养7d的精原干细胞与同批小鼠睾丸组织内的精原干细胞的形态学及生物学特征一致。以不加一抗的磷酸盐缓冲液的染色细胞作为阴性对照，结果均呈阴性。

GFRa-1染色的具体结果如表2所示。

表2 以GFRa-1为标志物检测精原干细胞的阳性率（%）

	GFRa-1阳性率
		空白对照组	7.54±1.23
实验组1组	18.84±2.84<sup>*</sup>
		实验组2组	20.96±2.40<sup>*</sup>
实验组3组	22.22±3.28<sup>*</sup>

注：t检验,*：P<0.05 (与空白对照组比较)

精原干细胞标志物GFRa-1阳性率：实验组与空白对照组比较，差异均有显著性意义(P<0.05)。提示体外培养的精原干细胞状态以未分化型细胞为主，仅有少量状态呈现为分化型精原干细胞。含有细叶石斛酚A的培养基，随着浓度的增加，GFRa-1阳性率更高，间接提示添加细叶石斛酚A，其精原干细胞的活性更高。

需要说明的是，以上所述仅为本发明的优选具体的实施例，若依本发明的构想所作变动，其产生的功能作用，仍未超出说明书所涵盖的精神时，均应在本发明的范围内。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。

Claims (6)

1.一种促进精原干细胞增殖的培养方法，其包括：

培养过程中应用了细叶石斛酚A。

2.权利要求1所述的培养方法，其特征在于：

细叶石斛酚A在细胞培养液中的终浓度为100-300mg/L。

3.权利要求2所述的培养方法，其特征在于：

（1）精原干细胞的分离与纯化；

（2）细胞饲养层的制备；

制备Sertoli细胞饲养层；

（3）诱导共培养：

将分离获得的精原干细胞制备成悬液，将精原干细胞接种于Sertoli细胞饲养层上。

4.权利要求3所述的培养方法，其特征在于：

步骤（3）诱导共培养：

将分离获得的精原干细胞制备成悬液，以细胞密度1×10⁵/ml将精原干细胞接种于Sertoli细胞饲养层上，2d换培养液1次，在细胞培养液中加入细叶石斛酚A。

5.权利要求4所述的培养方法，其特征在于，其步骤如下：

步骤（3）中，细叶石斛酚A在细胞培养液中的终浓度为100-300mg/L。

6.权利要求5所述的培养方法，其特征在于，其步骤如下：

所述细胞培养液为：含有10%胎牛血清的美国Gibco公司出产的DMEM培养基 ，在此基础上加入细叶石斛酚A。