CN110892866A - 一种提高子叶胚得出率的油菜小孢子培养基和培养方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及植物组织培养技术领域，公开了一种提高子叶胚得出率的油菜小孢子培养基和培养方法，所述培养基为固液双层培养基，所述培养基上层为NLN13液体培养基，所述培养基下层为B5培养基改良的固体培养基。所述培养方法采用两步法培养油菜小孢子，第一步采用NLNM液体培养基培养，第二步采用固液双层培养基培养。本发明显著提高了子叶胚的得出率，而且保证了子叶胚的质量，进而提高小孢子培养获得双单倍体植株的效率。

Description

一种提高子叶胚得出率的油菜小孢子培养基和培养方法

技术领域

本发明涉及植物组织培养技术领域，特别涉及一种提高子叶胚得出率的油菜小孢子培养基和培养方法。

背景技术

自1982年德国的Lichter首次报道从甘蓝型油菜中成功分离得到游离的小孢子，利用小孢子培养诱导单倍体继而加倍获得双单倍体(DHs)后。小孢子培养创建的双单倍体目前已经应用到油菜重要农艺性状的遗传图谱构建、重要性状QTLs定位以及双单倍体育种实践中。

虽然在甘蓝型油菜中已经建立了适用性强的小孢子培养技术体系，但是针对不同基因型差异的材料，在小孢子培养过程中产生高质量子叶胚的能力存在巨大差别。以前研究结果显示小孢子培养后得到的胚大多数是球形胚、心型胚或者类似于胚的结构(embryo-like structures，ELS)，只有少数是子叶胚。子叶胚在成苗培养基上能够快速生长获得生长势强、根系发达的植株，而其它类型的胚以及类似于胚的结构转移到再生培养基上难以一次成苗，甚至褐化死亡，这样极大程度上降低了小孢子培养获得双单倍体植株的效率。

发明内容

有鉴于此，本发明通过改进了培养基和培养方法，显著提高了油菜小孢子培养中子叶胚得出率且保证了子叶胚的质量。

为了达到上述目的，本发明一方面提供了

一种用于油菜小孢子培养的固液双层培养基，所述培养基上层为NLN13液体培养基，所述培养基下层为B5培养基改良的固体培养基；

所述NLN13液体培养基为：每1000mL包含2.5g KNO₃，2.5g MgSO₄·7H₂O，2.5gKH₂PO₄，10g Ca(NO₃)₂·4H₂O，0.556g FeSO₄·7H₂O，0.746g Na₂·EDTA，0.166g KI，1.24gH₃BO₃，3.474g MnSO₄.H₂O，2.118g ZnSO₄.7H₂O，0.05g Na₂MoO₄.2H₂O，0.005g CuSO₄.5H₂O，0.005g CoCl₂.6H₂O，1g烟酸，0.4g甘氨酸，0.1g盐酸硫氨，0.1g盐酸吡哆素，0.1g叶酸，0.01g生物素，130g蔗糖，0.1g肌醇，0.8g谷胺酰胺，0.1g丝氨酸，0.03g谷胱甘肽；

所述固体培养基为：每1000mL含有B5基本培养基，0.1～0.75g活性炭，0.1～0.75mg 6-BA，3g蔗糖，0.55g Phytagel；

优选的，所述固体培养基中活性炭的含量为0.1g/L。

优选的，所述固体培养基中6-BA的含量为0.25mg/L。

本发明第二方面提供了一种提高子叶胚得出率的油菜小孢子培养方法，该方法采用上述的固液双层培养基，具体包括以下步骤：

S1、小孢子的收集和分离：摘取主花序和分支的花蕾，经低温预处理、灭菌、清洗后，加入小孢子抽提缓冲液提取小孢子，过滤，离心，收集小孢子细胞，用NLNM液体培养基垂悬；

S2、小孢子热激预处理：调整步骤S1所述NLNM液体培养基中的小孢子细胞数目后，放入培养皿中，封口，置于31±1℃培养箱中暗培养48小时；

S3、小孢子细胞培养：将步骤S2处理后的小孢子细胞离心重悬后，放入培养皿中封口并暗培养一段时间，然后将小孢子悬浮液转移至权利要求1所述的固液双层培养基中暗培养，每1～2周补充NLN13液体培养基，待胚大小肉眼可见，将含有固-液双层培养基的培养皿置于摇床上于19～25℃下暗培养3～4周。

优选的，所述NLNM液体培养基为：每1000mL包含2.5g KNO₃，2.5g MgSO₄·7H₂O，2.5g KH₂PO₄，10g Ca(NO₃)₂·4H₂O，0.556g FeSO₄·7H₂O，0.746g Na₂·EDTA，0.166g KI，1.24g H₃BO₃，3.474g MnSO₄.H₂O，2.118g ZnSO₄.7H₂O，0.05g Na₂MoO₄.2H₂O，0.005gCuSO₄.5H₂O，0.005g CoCl₂.6H₂O，1g烟酸，0.4g甘氨酸，0.1g盐酸硫氨，0.1g盐酸吡哆素，0.1g叶酸，0.01g生物素，65g蔗糖，0.1g肌醇，0.8g谷胺酰胺，0.1g丝氨酸，0.03g谷胱甘肽，4g甘露醇。

优选的，所述含有固-液双层培养基的培养皿在摇床上的培养温度为于23℃。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：本发明采用两步法培养油菜小孢子，第一步采用NLNM液体培养基培养，第二步采用固液双层培养基培养，通过对固液双层培养基中下层固体培养基和上层液体培养基成分的设计，显著提高了子叶胚的得出率，而且保证了子叶胚的高质量。

附图说明

图1为液体培养基和固-液双层培养基上油菜小孢子出胚情况图；

图2为三个品系小孢子细胞液体以及固液双层培养基上的出胚数目统计图；

图3为不同震荡时间与出胚类型及数目统计图。

具体实施方式

为了更好地理解本发明，以下通过具体实施例对本发明作进一步阐述，但并不作为对本发明的限定。

需要说明的是，从目前已有的研究中可知，培养基中各组分的含量对实验的结果影响很大，因此实施例中所有的重量称重均采用万分之一天平称量。

实施例1

将三个油菜F1杂交组合(6R×ZS11)、(7DH×ZS11)、(ZR×R11)种植在田间，每个组合种植6行，共计50个单株。蕾薹期喷施叶面肥，提高抗逆能力，预防早衰，防控菌核病。

(1)小孢子的分离和收集

在田间摘取三个油菜F1杂交组合材料的主花序和分支的花蕾，放入事先铺上润湿滤纸的塑料盒中，将塑料盒置于4℃展示柜中处理1天，次日选取长度3mm-4.2mm油菜花蕾，此时雄蕊中的小孢子处于单核晚期至二核小孢子早期，将30-40个花蕾置于50％(V/V)次氯酸钠溶液中灭菌10min，之后转移到无菌ddH₂O中浸泡3次，每次10min。

将灭菌处理后的花蕾放入50ml无菌离心管中，加入10ml小孢子抽提缓冲液，用研磨棒挤压花蕾，使得小孢子从雄蕊中释放到抽提缓冲液中，补充抽提缓冲液定容到40ml。含有小孢子的抽提缓冲液经过75μm的过滤网过滤。通过过滤网去除研磨后颗粒较大的花蕾组织，收集过滤后的液体，置于控温15℃离心机中700rpm离心5min，保留沉淀物，去除上层液体，加入40ml抽提缓冲液，轻轻垂悬沉淀中的小孢子细胞，置于控温15℃离心机中700rpm再次离心5min，收集小孢子细胞，用NLNM液体培养基轻轻垂悬后沉淀。

上述抽提缓冲液的配置方法为：将17g蔗糖溶解在100ml ddH₂O中，高温灭菌，4℃保存。

(2)小孢子热激预处理

使用细胞计数仪将垂悬在NLNM液体培养基中的小孢子细胞调整为20×10⁴小孢子细胞/ml，每个直径为60×20mm培养皿中加入10-12ml小孢子悬浮液体，培养皿用Parafilm封口，置于31±1℃培养箱中暗培养48小时，这个步骤的目的是通过热激胁迫促进单核小孢子细胞结构重塑，向雄性单性生殖方向发育。

(3)小孢子细胞培养

经过2天的预培养后，将小孢子细胞悬浮液置于温度15℃离心机中500rpm离心5min，收集得到的小孢子按照10×10⁴小孢子细胞/ml密度调整，取5ml小孢子悬浮液加入到直径60×15mm的培养皿中，该培养皿中的培养基仍为NLNM培养基，培养皿用Parafilm封口，置于塑料容器中，在25℃下暗培养2周。

将小孢子悬浮培养液转移到固液双层培养基的90×15mm培养皿中继续生长。固液双层培养基组成：上层是NLN13液体培养基，下层是固体培养基。为保证小孢子悬浮液能够均匀分散在上层液体培养基中，上层NLN13液体培养基体积与转移的小孢子悬浮液的体积为1:1。小孢子细胞均匀分布在固-液双层培养基上，置于25℃暗培养2周，其中每1-2周补充NLN13液体培养基5ml。

当胚大小肉眼可见，将含有固-液双层培养基的培养皿置于23℃暗室内的摇床上培养，转速为25rpm。经过4周培养后，统计各个培养皿中出胚数和高质量子叶胚数。

上述NLNM液体培养基为：

调节PH值5.85-5.9，定容至1000ml后0.22μmol抽滤除菌。

上述NLN13液体培养基为：

调节PH值5.85-5.9，定容至1000ml后0.22μmol抽滤除菌。

其中，培养基母液配方具体为：

①大量元素(20X)1000ml

KNO₃ 2.5g

MgSO₄·7H₂O 2.5g

KH₂PO₄ 2.5g

Ca(NO₃)₂·4H₂O 10g

②铁盐(20X)1000ml

FeSO₄·7H₂O 0.556g

Na₂·EDTA 0.746g

③微量元素(200X)1000ml

④有机成分(200X)1000ml

由以上对培养基配置以及母液配置方法可知，本实施例中所述NLNM液体培养基的具体成分为：每1000mL包含2.5g KNO₃，2.5g MgSO₄·7H₂O，2.5g KH₂PO₄，10g Ca(NO₃)₂·4H₂O，0.556g FeSO₄·7H₂O，0.746g Na₂·EDTA，0.166g KI，1.24g H₃BO₃，3.474g MnSO₄.H₂O，2.118g ZnSO₄.7H₂O，0.05g Na₂MoO₄.2H₂O，0.005g CuSO₄.5H₂O，0.005g CoCl₂.6H₂O，1g烟酸，0.4g甘氨酸，0.1g盐酸硫氨，0.1g盐酸吡哆素，0.1g叶酸，0.01g生物素，65g蔗糖，0.1g肌醇，0.8g谷胺酰胺，0.1g丝氨酸，0.03g谷胱甘肽，4g甘露醇。

同样的，NLN13液体培养基的具体成分为：每1000mL包含2.5g KNO₃，2.5g MgSO₄·7H₂O，2.5g KH₂PO₄，10g Ca(NO₃)₂·4H₂O，0.556g FeSO₄·7H₂O，0.746g Na₂·EDTA，0.166gKI，1.24g H₃BO₃，3.474g MnSO₄.H₂O，2.118g ZnSO₄.7H₂O，0.05g Na₂MoO₄.2H₂O，0.005gCuSO₄.5H₂O，0.005g CoCl₂.6H₂O，1g烟酸，0.4g甘氨酸，0.1g盐酸硫氨，0.1g盐酸吡哆素，0.1g叶酸，0.01g生物素，130g蔗糖，0.1g肌醇，0.8g谷胺酰胺，0.1g丝氨酸，0.03g谷胱甘肽。

上述固液双层培养基中的固体培养基的成分为：每1000mL包含0.32g B5基本培养基粉末，0.1g活性炭，0.1mg 6-BA，3g蔗糖，0.55g Phytagel，调节PH值5.85-5.9，定容至1000mL，高温灭菌分装到90×15mm培养皿中，每个培养皿分装15mL。

上述B5基本培养基可采用市售的任一一款B5培养基，如本实施例中，B5基本培养基为Gamborg B-5 Basal Medium，LotAMR0398031B，产地Phyto TechnologyLaboratories。

采用上述同样的方法，仅将步骤(3)中的固液双层培养基换成液体培养基，作为对照组。其中，该液体培养基的成分与上述固液双层培养基的上层液体培养基的成分完全一致。

实验结果：

通过统计分析不同品系的小孢子细胞在固液双层培养基和液体培养基上的出胚数和高质量子叶胚数目的差异，如图1所示，其中A为在固液双层培养基上小孢子培养生成子叶胚，B为在液体培养基上小孢子培养成大量非子叶胚结构。虽然三个品系在液体培养基上出胚总数高于固液双层培养基上的出胚数，但是三个品系固液双层培养基上子叶胚数占总出胚数的比率分别为72.1％，87.0％和85.6％，高于液体培养基上子叶胚数目，如表1和图1～2(图中，L代表NLN13液体培养基，SL代表固液双层培养基)所示。

表1

实施例2

采用与实施例1一致的方法，选取120个花蕾分离得到小孢子在25℃暗培养2周，之后转移到含有固液双层培养基的培养皿上培养。不同之处在于：当胚肉眼可见时，培养皿置于转速为25rpm的摇床上分别培养1周，2周，3周，培养温度为25℃，统计球型或者心型胚、子叶型胚、类似于胚结构的数目，结果如表2和图3所示(图3中A代表球型或者心型胚，B代表子叶型胚，C代表类似于胚结构)。

表2

结果显示：震荡培养1周后所得到的胚总数和未震荡培养的出胚数较多，而震荡1周处理后的球型或者心型胚的数目显著减少，子叶型胚数目显著性增加。

实施例3

采用与实施例1一致的方法，不同之处在于：将在固液双层培养基上培养2周的小孢子转移到转速为25rpm的摇床上分别培养1周，培养温度分别为：25℃、23℃、21℃、19℃、17℃，之后在相应温度下继续静置培养3周，统计出胚总数以及子叶胚数如表3所示。

表3

结果显示：随着培养的温度的降低，平均60个花蕾的总出胚数在下降，在培养温度从21℃降低到17℃时总出胚数相比在25℃培养温度下出胚数目分别减少了47.2％，71.4％，79.1％。通过对不同培养温度下子叶胚数目统计，显示在23℃培养条件下正常子叶胚的数目占总出胚数的62.1％，显著高于其它培养温度下的子叶胚数目。

实施例4

采用与实施例1一致的方法，不同之处在于：固液双层培养基中的固体培养基中的活性炭的浓度分别为：0、0.1％、0.25％、0.5％、0.75％，结果如表4所示。

表4

实验结果显示：在添加0.1％活性炭的固液双层培养基中高质量子叶胚数目最多，显著性高于其它活性炭浓度的培养基。

实施例5

采用与实施例1一致的方法，不同之处在于：固液双层培养基中的固体培养基中的6-BA的质量体积浓度分别为：0、0.1、0.25、0.5、0.75，结果如表5所示。

表5

结果显示当固体培养基中6-BA激素的浓度为0.25mg/L处理时，平均60个花蕾的出胚总数最多，显著性高于其它处理浓度下出胚数，并且高质量子叶胚数目也最多，达到显著性差异。

实施例6

将实施例1中得到的子叶胚(含有胚根、下胚轴以及两片对称子叶)转移到再生培养基，在室内25℃，16h光照/8h黑暗，其中每一层的光合作物光子通量密度PPFD为100μmolm^-1s^-1。在再生培养基中生长6-8周后转移到土钵中生长。

将实施例1中得到的非子叶胚(球形胚、心型胚或者类似于胚的结构)，用灭菌的小勺子将这类胚转移平铺到再生培养基上，加入5-10mlNLN13液体培养基浅层覆盖胚浅层，培养3-4周，每周补充NLN13液体培养基保证胚组织处于被浅层覆盖状态。培养3-4周以后将生长得到的愈伤组织或者次生胚转移到固体B5培养基中生长3-4周成苗，所得到的苗如果有正常根系，移栽到土钵中生长。

其中，上述再生培养基(固体)为：0.43g的B5基本培养基(Gamborg B-5 BasalMedium,LotAMR0398031B，产地Phyto Technology Laboratories)+0.3g蔗糖+0.55gPhytagel，调节PH值5.85-5.9，定容1000mL，高温灭菌分装到容量为150ml的培养瓶中，每个培养瓶分装50ml。

生长4周后，统计上述主要三种类型的胚直接转化成植株，形成次生胚后转化成植株，形成愈伤组织后转化成植株，以及胚褐化死亡的数目，如表6所示。

表6

结果显示三个品系中的子叶胚直接转化成植株的数目显著高于球型或心型胚以及类似于胚的结构转化成植株的数目，在培养基中子叶胚死亡数目显著低于类似于胚的结构的死亡数。

当然，以上仅是本发明的具体应用范例，对本发明的保护范围不构成任何限制。除上述实施例外，本发明还可以有其它实施方式，凡采用等同替换或等效变换形成的技术方案，均落在本发明所要求保护的范围之内。

Claims (6)

1.一种用于油菜小孢子培养的固液双层培养基，其特征在于，所述培养基上层为NLN13液体培养基，所述培养基下层为B5培养基改良的固体培养基；

所述NLN13液体培养基为：每1000mL包含2.5g KNO₃，2.5g MgSO₄·7H₂O，2.5g KH₂PO₄，10g Ca(NO₃)₂·4H₂O，0.556g FeSO₄·7H₂O，0.746g Na₂·EDTA，0.166g KI，1.24g H₃BO₃，3.474g MnSO₄.H₂O，2.118g ZnSO₄.7H₂O，0.05g Na₂MoO₄.2H₂O，0.005g CuSO₄.5H₂O，0.005gCoCl₂.6H₂O，1g烟酸，0.4g甘氨酸，0.1g盐酸硫氨，0.1g盐酸吡哆素，0.1g叶酸，0.01g生物素，130g蔗糖，0.1g肌醇，0.8g谷胺酰胺，0.1g丝氨酸，0.03g谷胱甘肽；

所述固体培养基为：每1000mL包含0.32g B5基本培养基粉末，0.1～0.75g活性炭，0.1～0.75mg 6-BA，3g蔗糖，0.55g Phytagel。

2.根据权利要求1所述的用于油菜小孢子培养的固液双层培养基，其特征在于，所述固体培养基中活性炭的含量为0.1g/L。

3.根据权利要求1所述的用于油菜小孢子培养的固液双层培养基，其特征在于，所述固体培养基中6-BA的含量为0.25mg/L。

4.一种提高子叶胚得出率的油菜小孢子培养方法，其特征在于，采用权利要求1所述的固液双层培养基，包括以下步骤：

S1、小孢子的收集和分离：摘取主花序和分支的花蕾，经低温预处理、灭菌、清洗后，加入小孢子抽提缓冲液提取小孢子，过滤，离心，收集小孢子细胞，用NLNM液体培养基垂悬；

S2、小孢子热激预处理：调整步骤S1所述NLNM液体培养基中的小孢子细胞数目后，放入培养皿中，封口，置于31±1℃培养箱中暗培养48小时；

S3、小孢子细胞培养：将步骤S2处理后的小孢子细胞离心重悬后，放入培养皿中封口暗培养一段时间，然后将小孢子悬浮液转移至权利要求1所述的固液双层培养基中暗培养，每1～2周补充NLN13液体培养基，待胚大小肉眼可见，将含有固-液双层培养基的培养皿置于摇床上于19～25℃下暗培养3～4周。

5.根据权利要求4所述的提高子叶胚得出率的油菜小孢子培养方法，其特征在于，所述NLNM液体培养基为：每1000mL包含2.5g KNO₃，2.5g MgSO₄·7H₂O，2.5g KH₂PO₄，10g Ca(NO₃)₂·4H₂O，0.556g FeSO₄·7H₂O，0.746g Na₂·EDTA，0.166g KI，1.24g H₃BO₃，3.474gMnSO₄.H₂O，2.118g ZnSO₄.7H₂O，0.05g Na₂MoO₄.2H₂O，0.005g CuSO₄.5H₂O，0.005gCoCl₂.6H₂O，1g烟酸，0.4g甘氨酸，0.1g盐酸硫氨，0.1g盐酸吡哆素，0.1g叶酸，0.01g生物素，65g蔗糖，0.1g肌醇，0.8g谷胺酰胺，0.1g丝氨酸，0.03g谷胱甘肽，4g甘露醇。

6.根据权利要求4所述的提高子叶胚得出率的油菜小孢子培养方法，其特征在于，所述含有固-液双层培养基的培养皿在摇床上的培养温度为于23℃。

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