CN110873759A - 黄连配方颗粒和配方颗粒中间体中小檗碱及其它物质总量的检测方法 - Google Patents

黄连配方颗粒和配方颗粒中间体中小檗碱及其它物质总量的检测方法 Download PDF

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CN110873759A CN201811003415.9A CN201811003415A CN110873759A CN 110873759 A CN110873759 A CN 110873759A CN 201811003415 A CN201811003415 A CN 201811003415A CN 110873759 A CN110873759 A CN 110873759A
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Abstract

本发明属于中药检测领域，公开了黄连配方颗粒和配方颗粒中间体中小檗碱及其他物质总量的检测方法。该检测方法采用高效液相色谱法，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈‑磷酸二氢钾溶液作为流动相，对供试品溶液进行测定。本发明方法供试品制作简便，色谱条件容易实现，分析灵敏度高，稳定性和重现性好，检测结果准确可靠，为黄连配方颗粒中间体和黄连配方颗粒的质量控制提供有力参考。

Description

黄连配方颗粒和配方颗粒中间体中小檗碱及其它物质总量的 检测方法
技术领域
本发明属于中药检测领域，涉及黄连化学成分含量的检测方法，具体涉及黄连配方颗粒和配方颗粒中间体中小檗碱及其它物质总量的检测方法。
背景技术
黄连为毛莨科植物黄连Coptis chinensis Franch.的干燥根茎，习称“味连”。其炮制应符合《中国药典》2015年版一部【炮制】项下黄连片的有关规定。黄连清热燥湿，泻火解毒；用于湿热痞满，呕吐吞酸，泻痢，黄疸，高热神昏，心火亢盛，心烦不寐，心悸不宁，血热吐魈，目赤，牙痛，消渴，痈肿疔疮；外治湿疹，湿疮，耳道流脓。化学成分研究表明，黄连中含有小檗碱、表小檗碱、黄连碱、巴马汀等多种生物碱。
黄连配方颗粒，是在中医药理论指导下，以规范炮制加工的黄连饮片为原料，采用提取、低温浓缩、瞬间干燥等工艺技术而制成的颗粒剂。现有技术中通常以小檗碱含量及表小檗碱、黄连碱、巴马汀总量作为评价黄连配方颗粒质量的一个重要指标，但现有的测定方法未见统一标准，其质量控制方法现多沿用黄连饮片的药典标准。
发明内容
本发明提供一种小檗碱含量及表小檗碱、黄连碱、巴马汀总量的检测方法，该方法快速、简便、准确，能够有效控制黄连配方颗粒中间体和黄连配方颗粒的质量，保证产品的有效性和稳定性。
一种小檗碱含量及表小檗碱、黄连碱、巴马汀总量的检测方法，包括以下步骤：采用高效液相色谱法，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈-磷酸二氢钾溶液作为流动相，对供试品溶液进行测定。
根据本发明的实施方案，该检测方法具体包括以下步骤：
(1)供试品溶液的制备：取黄连配方颗粒或配方颗粒的中间体，加入溶剂提取，即得供试品溶液；
(2)测定：采用高效液相色谱法，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈-磷酸二氢钾溶液作为流动相，对供试品溶液进行测定，以盐酸小檗碱对照品的峰面积为对照，分别计算小檗碱、表小檗碱、黄连碱和巴马汀的含量。
根据本发明，步骤(1)中，所述溶剂可以选自甲醇和/或甲醇的酸性溶液，优选地，所述甲醇体积浓度在50％以上，所述甲醇的酸性溶液选自甲醇与强酸 (如盐酸、硫酸等)的混合液；例如甲醇与盐酸的混合液，其中甲醇与盐酸的体积比为(60～600):1，例如(100～500):1；示例性地，所述溶剂可以为体积比100:1的甲醇-盐酸、体积比500:1的甲醇-盐酸或体积比100:1的70％甲醇-盐酸。
根据本发明，步骤(1)中，所述提取的方法包括超声提取、加热提取、回流提取，优选超声提取。
根据本发明的实施方案，所述超声提取包括以下操作：称取黄连配方颗粒或配方颗粒的中间体，加入溶剂，称重，超声处理，放冷后再称重，加入溶剂补足减失的重量，摇匀、滤过，按供试品溶液所需浓度量取续滤液，加入溶剂定容，摇匀、滤过；优选地，所述超声处理时间至少20分钟，例如超声20分钟、 30分钟、40分钟。
根据本发明的实施方案，所述加热提取包括以下操作：称取黄连配方颗粒或配方颗粒的中间体，加入溶剂，称重，水浴加热，放冷后再称重，加入溶剂补足减失的重量，摇匀、滤过，按供试品溶液所需浓度量取续滤液，加入溶剂定容，摇匀、滤过；优选地，所述水浴加热选用55～65℃水浴加热25～40分钟，例如60℃加热30分钟。
根据本发明的实施方案，所述回流提取包括以下操作：称取黄连配方颗粒或配方颗粒的中间体，加入溶剂，称重，水浴回流，放冷后再称重，加入溶剂补足减失的重量，摇匀、滤过，按供试品溶液所需浓度量取续滤液，加入溶剂定容，摇匀、滤过；优选地，所述水浴回流选用80～90℃水浴加热35～50分钟，例如85℃水浴回流40分钟。
根据本发明，步骤(1)中，所述供试品溶液配制时黄连配方颗粒或配方颗粒的中间体与溶剂的质量体积比(g/mL)为(0.08～0.13):50，例如(0.09～0.11):50，示例性地，质量体积比(g/mL)为0.1:50。
根据本发明，步骤(1)中，所述黄连配方颗粒中间体由以下步骤得到：向清膏中加入辅料，混匀，喷雾干燥，即得黄连配方颗粒中间体；
优选地，所述清膏由以下步骤得到：黄连饮片经浸泡、煎煮和过滤后，滤液浓缩得到清膏；
其中，所述浸泡时将黄连饮片加入水中，黄连饮片与水的质量比为1:(8～15)；优选地，质量比为1:(8～12)；示例性地，所述质量比为1:10；
所述浸泡的时间为20～40分钟，优选浸泡25～35分钟，示例性地，浸泡30分钟；
所述的水优选纯化水，例如蒸馏水、去离子水或通过反渗透法制得的制药用水；
所述煎煮和过滤至少循环操作两次，例如循环操作两次、三次或更多次；所述煎煮前需先将水加热至沸腾，然后文火煎煮；
示例性地，当煎煮和过滤循环操作两次时，第一次煎煮20～40分钟，优选煎煮25～35分钟，示例性地，煎煮30分钟，然后过滤，得到滤液一和药渣一；第二次煎煮时，向药渣一中加水，其中水的用量为黄连饮片质量的7～10倍，例如8倍，煎煮20～40分钟，优选煎煮25～35分钟，示例性地，煎煮30分钟，然后过滤，得到滤液二和药渣二；
所述过滤时趁热过滤，优选过80～120目筛，例如过80目筛、100目筛、120 目筛；
所述滤液为多次过滤所得滤液的合并物，例如为滤液一和滤液二的合并物；
优选地，所述浓缩的方式采用减压浓缩；
优选地，所述清膏的相对密度为1.05～1.25，例如，相对密度为1.05～1.10，例如1.05、1.08、1.10；所述清膏的相对密度在60～70℃温度下测得，优选在65℃温度下测得；
所述清膏与辅料的质量配比为1:(1～3)，例如1:1、1:2、1:3；
所述喷雾干燥的温度为：进风温度115～130℃，出风温度80～95℃；优选地，进风温度120～130℃，出风温度85～95℃；示例性地，进风温度127℃，出风温度 90℃。
根据本发明，所述黄连配方颗粒中间体的水分含量不超过6.0wt％，例如含量不超过5.0wt％；优选地，含量为3.1～3.6wt％。
根据本发明，所述黄连配方颗粒中间体的醇溶性浸出物的含量不低于 38.0wt％，例如不低于40.0wt％，如含量为41.9～44.1wt％。
根据本发明，步骤(1)中，所述黄连配方颗粒是由黄连配方颗粒中间体与辅料混匀、制粒得到；
所述中间体与辅料的质量配比为(1～4):1，例如(1.5～4):1；示例性地，质量配比为2:1、3:1、4:1。
所述喷雾干燥前还需将混匀的清膏和辅料过筛，优选过80～120目筛，例如过80目筛、100目筛、120目筛；
所述干法制粒可采用本领域常规操作，先通过滚压，连续不断地压紧物料块，整粒、过筛后得到颗料成品；所述干法制粒的操作条件为：轧辊压力2～3MPa，压片频率16～25Hz，送料频率12～18Hz。例如，轧辊压力2.3～2.7MPa，压片频率 18～22Hz，送料频率13～16Hz。示例性地，轧辊压力2.5MPa、压片频率20Hz、送料频率15Hz。
所述过筛为过10～30目筛；优选过20目筛。
根据本发明，所述黄连配方颗粒中活性成分黄连的含量为250～800mg/g，优选300～700mg/g，更优选300～600mg/g。
根据本发明，所述黄连配方颗粒中水分的含量为5.5～8.0wt％，例如含量为 5.9～7.2wt％；示例性地，含量为5.9wt％、6.3wt％、6.9wt％。
根据本发明，所述黄连配方颗粒的醇溶性浸出物的含量不低于31.0wt％，例如不低于31.5wt％，如含量为31.6～33.9wt％。
根据本发明，所述黄连配方颗粒的粒度在10～100目之间，例如10～80目、 30～50目。优选地，所述山药配方颗粒不能过1号筛(10目)和能过5号筛(80目) 的颗粒总量不超过供试量的15％；例如，不超过10％、5％；优选地，在3.2～4.6％之间。
进一步的，上述黄连配方颗粒和中间体制备步骤中提及的辅料包括一种、两种或更多种填充剂，例如，所述填充剂为选自淀粉、糊精、蔗糖、乳糖、甘露醇、木糖醇和双岐糖中的至少一种；优选地，所述填充剂选自淀粉、糊精、蔗糖或乳糖；示例性地，所述填充剂选自糊精。
根据本发明，步骤(2)中，所述流动相中，乙腈与磷酸二氢钾溶液的体积比为(20～60):(40～80)，例如25:75、28:72、50:50、49:51；
所述磷酸二氢钾溶液的浓度为0.02～0.06mol/L，例如0.025mol/L、0.03mol/L、0.04mol/L、0.05mol/L；
优选地，所述磷酸二氢钾溶液中含有0.3～0.6mg/mL的十二烷基硫酸钠 (SDS)，例如含有0.4mg/ml的SDS；
优选地，所述磷酸二氢钾溶液的pH值控制在3.3～4.2之间，例如3.6、3.7、3.8、4.0；进一步的，pH的实现可以通过向磷酸二氢钾溶液中加入磷酸进行调节；
根据本发明示例性的实施方案，所述流动相选自体积比49:51的乙腈 -0.05mol/L磷酸二氢钾溶液(含有0.4mg/ml的SDS，pH＝3.6、3.7或3.8)。
根据本发明，步骤(2)中，所述测定条件：
流动相的流速0.5～1.5ml/min，例如0.8ml/min、1.0ml/min、1.2ml/min；
色谱柱：Venusil MP C18、Agilent Extend C18、Welch
Figure RE-GDA0001854417870000061
LP-C18 中的至少一种；
柱温：20～40℃，例如25～35℃，如25℃、30℃、35℃；
进样量：10～20μL，例如10μL；
检测波长：320～360nm，例如330～350nm，如345nm；
理论板数按盐酸小檗碱峰计算应不低于5000。
根据本发明，该方法还包括步骤(3)对照品溶液的制备：取盐酸小檗碱，加入溶剂溶解，即得对照品溶液；
优选地，所述溶剂与步骤(2)中的溶剂相同，所述对照品溶液的浓度为 30～50μg/mL，例如40μg/mL。
本发明的有益效果是：
本发明提供的检测方法主要针对黄连配方颗粒中间体和黄连配方颗粒中的小檗碱含量以及表小檗碱、黄连碱、巴马汀总量进行检测，该方法供试品制作简便，色谱条件容易实现，分析灵敏度高，稳定性和重现性好，检测结果准确可靠，为黄连配方颗粒中间体和黄连配方颗粒的质量控制提供有力参考。
附图说明
图1是实施例1中流动相①时黄连配方颗粒中间体高效液相色谱图；
图2是实施例1中流动相②时黄连配方颗粒中间体高效液相色谱图；
图3是实施例1中流动相③时黄连配方颗粒中间体高效液相色谱图；
图4是实施例1中流动相④时黄连配方颗粒中间体高效液相色谱图；
图5是实施例1中流动相④时对照品高效液相色谱图；
图6是实施例1中柱温25℃下黄连配方颗粒中间体高效液相色谱图；
图7是实施例1中柱温30℃下黄连配方颗粒中间体高效液相色谱图；
图8是实施例1中柱温35℃下黄连配方颗粒中间体高效液相色谱图；
图9是实施例1中流速0.8ml/min时黄连配方颗粒中间体高效液相色谱图；
图10是实施例1中流速1.0ml/min时黄连配方颗粒中间体高效液相色谱图；
图11是实施例1中流速1.2ml/min时黄连配方颗粒中间体高效液相色谱图；
图12是实施例1中流动相pH 3.6时黄连配方颗粒中间体高效液相色谱图；
图13是实施例1中流动相pH 3.7时黄连配方颗粒中间体高效液相色谱图；
图14是实施例1中流动相pH 3.8时黄连配方颗粒中间体高效液相色谱图；
图15是实施例1中Extend C18色谱柱时黄连配方颗粒中间体高效液相色谱图；
图16是实施例1中Venusil MP C18色谱柱时黄连配方颗粒中间体高效液相色谱图；
图17是实施例1中Welch
Figure RE-GDA0001854417870000071
LP-C18色谱柱时黄连配方颗粒中间体高效液相色谱图；
图18是实施例1中Agilent 1260仪器测试的黄连配方颗粒中间体高效液相色谱图；
图19是实施例1中Agilent 1100仪器测试的黄连配方颗粒中间体高效液相色谱图；
图20是实施例2中流动相①时黄连配方颗粒高效液相色谱图；
图21是实施例2中流动相②时黄连配方颗粒高效液相色谱图；
图22是实施例2中流动相③时黄连配方颗粒高效液相色谱图；
图23是实施例2中流动相④时黄连配方颗粒高效液相色谱图；
图24是实施例2中柱温25℃下黄连配方颗粒高效液相色谱图；
图25是实施例2中柱温30℃下黄连配方颗粒高效液相色谱图；
图26是实施例2中柱温35℃下黄连配方颗粒高效液相色谱图；
图27是实施例2中流速0.8ml/min时黄连配方颗粒高效液相色谱图；
图28是实施例2中流速1.0ml/min时黄连配方颗粒高效液相色谱图；
图29是实施例2中流速1.2ml/min时黄连配方颗粒高效液相色谱图；
图30是实施例2中流动相pH 3.6时黄连配方颗粒高效液相色谱图；
图31是实施例2中流动相pH 3.7时黄连配方颗粒高效液相色谱图；
图32是实施例2中流动相pH 3.8时黄连配方颗粒高效液相色谱图；
图33是实施例2中Extend C18色谱柱时黄连配方颗粒高效液相色谱图；
图34是实施例2中Venusil MP C18色谱柱时黄连配方颗粒高效液相色谱图；
图35是实施例2中Welch
Figure RE-GDA0001854417870000081
LP-C18色谱柱时黄连配方颗粒高效液相色谱图；
图36是实施例2中Agilent 1260仪器测试的黄连配方颗粒高效液相色谱图；
图37是实施例2中Agilent 1100仪器测试的黄连配方颗粒高效液相色谱图。
除图5以外的其余高效液相色谱图中，右起第一、二、三、四个峰依次是盐酸小檗碱、巴马汀、黄连碱和表小檗碱的峰。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围。在阅读了本发明所公开的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本发明所限定的保护范围之内。
除非另有说明，如下实施例中的原料、底物或试剂均为市售商品。如果合适，它们也可通过本领域已知的方法制备获得。
制备例1制备黄连配方颗粒中间体
称取三批中药饮片黄连各2000g，加10倍量水浸泡30分钟，加热至沸腾，煎煮30分钟，趁热滤过(6号筛，100目)，药渣再加8倍量水，煮沸后煎煮30分钟，趁热滤过(6号筛，100目)，合并滤液，减压浓缩至相对密度为1.05～1.10(65℃测定)的清膏，加入糊精300g，混匀，滤过(6号筛，100目)，喷雾干燥(进风温度127℃，出风温度90℃)，得喷雾干燥粉，即为黄连配方颗粒中间体。三个批次的中间体编号记为S01、S02、S03。
制备例2制备黄连配方颗粒
继续向制备例1得到的中间体中加入糊精，混匀，干法制粒，制成颗粒1000g，得到黄连配方颗粒。三个批次的黄连配方颗粒编号记为A01、A02、A03。
黄连配方颗粒成品性状：浅黄色至棕黄色的颗粒；气清香，味甘、微辛。
黄连配方颗粒成品规格：每1g配方颗粒相当于饮片2g。
实施例1黄连配方颗粒中间体中小檗碱含量及表小檗碱、黄连碱、巴马汀总量的检测方法
1.实验材料：
1.1实验仪器
Agilent 1100液相色谱仪(美国AGILENT公司)；
分析天平：METTLER TOLEDO XS105；超声仪：KQ-500VDE型(昆山市超声仪器有限公司)。
1.2药物与试剂
对照品来源及纯度：盐酸小檗碱对照品由中国食品药品检定研究院提供(110713-201613，供含量测定用，含量为86.8％)；
供试品来源：黄连配方颗粒中间体由制备例1方法得到，中间体(三个批次编号S01-S03)均由湖北香连药业提供；
甲醇、磷酸、磷酸二氢钾、盐酸等均为分析纯，乙腈为色谱纯。
2.实验方法
2.1色谱条件考察
色谱柱：Extend C18柱(250mm×4.6mm，5μm，Agilent Technologies)；
流动相：分别对以下五种流动相进行了比较：
①乙腈-0.1％磷酸(体积比30∶70)；
②乙腈-0.05mol/L磷酸二氢钾溶液(体积比25∶75)；
③乙腈-0.025mol/L磷酸二氢钾溶液(体积比28∶72)；
④乙腈-0.05mol/L磷酸二氢钾溶液(体积比49∶51)(每100ml中加十二烷基硫酸钠0.4g，再以磷酸调节pH值为3.7)。
流速：1mL/min；检测波长：345nm；理论板数按盐酸小檗碱峰计算不低于 5000。
2.2药液的配制
2.2.1对照品溶液的制备：取盐酸小檗碱对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1mL含40μg的溶液，即得。
2.2.2供试品溶液制备方法的考察：
(1)提取方法的考察
对以下三种提取方法进行了比较：
①取黄连配方颗粒中间体粉末约0.1g，精密称定，置于具有塞的锥形瓶中，精密加入甲醇-盐酸(100∶1)50mL，密塞，称定重量，超声处理40分钟，放冷，再称定重量，用甲醇-盐酸(100∶1)补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液2mL，置10mL量瓶中，加甲醇-盐酸(100∶1)至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
②取黄连配方颗粒中间体粉末约0.1g，精密称定，置于具有塞的锥形瓶中，精密加入甲醇-盐酸(100∶1)50mL，密塞，称定重量，于60℃水浴加热30分钟，放冷，再超声处理40分钟，放冷，称定重量，用甲醇-盐酸(100∶1)补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液2ml，置10ml量瓶中，加甲醇-盐酸 (100∶1)至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
③取黄连配方颗粒中间体粉末约0.1g，精密称定，置圆底烧瓶中，精密加入甲醇-盐酸(100∶1)50mL，称定重量，于85℃水浴中回流40分钟，放冷，再称定重量，用甲醇-盐酸(100∶1)补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液2mL，置10mL量瓶中，加甲醇-盐酸(100∶1)至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
(2)提取溶剂的考察
取黄连配方颗粒中间体粉末约0.1g，精密称定，置于具有塞的锥形瓶中，分别精密加入甲醇、甲醇-盐酸(500∶1)、70％甲醇-盐酸(100∶1)、甲醇-盐酸(100∶1)各50mL，密塞，称定重量，超声处理40分钟，放冷，再称定重量，分别用相应的溶剂补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液2mL，置10mL 量瓶中，分别加相应的溶剂至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
(3)提取时间的选择
取黄连配方颗粒中间体粉末约0.1g，精密称定，置于具有塞的锥形瓶中，精密加入甲醇50mL，密塞，称定重量，分别超声处理20、30和40分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液2mL，置10mL 量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
2.2.3测定方法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定，以盐酸小檗碱对照品的峰面积为对照，分别计算小檗碱、表小檗碱、黄连碱和巴马汀的含量，用待测成分色谱峰与盐酸小檗碱色谱峰的相对保留时间确定。
3.检测结果
3.1色谱条件考察结果
精密吸取供试品溶液10μL，注入液相色谱仪，分别按照流动相条件①-④进行考察，记录色谱图，见图1-4。结果表明，在流动相④条件下，待测化合物各峰均能达到较好分离，系统适用性良好。因此选择流动相条件④为检测方法的流动相条件。
精密吸取对照品混合溶液10μL，注入液相色谱仪，按照流动相条件④进行考察，记录色谱图，见图5。
3.2供试品溶液制备方法考察结果
3.2.1按照2.1中的色谱条件(流动相④)，精密吸取不同提取方法制得的供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，记录峰面积值，计算小檗碱含量及表小檗碱、黄连碱和巴马汀的总量，结果见表1-1。结果显示：三种提取方法无显著差异，但方法①的操作更为简单、省时。
表1-1提取方法的比较
Figure RE-GDA0001854417870000121
3.2.2按照2.1中的色谱条件(流动相④)，精密吸取不同提取溶剂制得的供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，记录峰面积值，计算小檗碱含量及表小檗碱、黄连碱和巴马汀的总量，结果见表1-2。结果显示：四种提取溶剂无显著差异，故优先选择较为简单的甲醇作为提取溶剂。
表1-2提取溶剂的比较
Figure RE-GDA0001854417870000122
3.2.3按照2.1中的色谱条件(流动相④)，精密吸取不同超声时间制得的供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，记录峰面积值，计算小檗碱含量及表小檗碱、黄连碱和巴马汀的总量，结果见表1-3。结果显示：提取时间为20分钟时已提取完全，故优先选择提取时间为20分钟。
表1-3提取时间的比较
Figure RE-GDA0001854417870000123
Figure RE-GDA0001854417870000131
综合以上试验结果，最终确定供试品溶液制备方法为：取黄连配方颗粒样品，采用研钵将其研为粉末，取粉末约0.1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50mL，密塞，称定重量，超声处理20分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液2mL，置10mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
3.3测定结果
表小檗碱、黄连碱、巴马汀、小檗碱的峰位，其相对保留时间应在规定值的±5％范围之内，即得。相对保留时间见表1-4：
表1-4待测化合物相对保留时间
Figure RE-GDA0001854417870000132
3.4方法学考察
3.4.1线性关系考察
精密称取盐酸小檗碱对照品28.69mg，加甲醇适量溶解并定容至25mL容量瓶中，精密吸取上述溶液适量并逐级稀释成浓度为149.4175、74.7088、39.8447、 19.9223、7.9689、3.1876μg/mL的对照品溶液，每一浓度标样进样10μL，记录色谱图。
以进样量(X)为横坐标，峰面积(Y)为纵坐标，进行线性回归，计算得回归方程为Y＝4426X+5.5853，R＝0.9999。结果见表1-5。结果显示：盐酸小檗碱在0.0319～1.4942μg之间呈良好的线性关系。
表1-5盐酸小檗碱线性关系
Figure RE-GDA0001854417870000133
Figure RE-GDA0001854417870000141
3.4.2检测限和定量限
取低浓度盐酸小檗碱对照品溶液，逐级稀释，进样测定，以信噪比S/N＝3 时注入仪器的盐酸小檗碱的量确定检测限，以S/N＝10时注入仪器的盐酸小檗碱的量确定定量限。结果，盐酸小檗碱的检测限为0.6169ng，定量限为1.0842ng。
3.4.3稳定性试验
取同一批S01供试品的溶液，室温放置，分别于0、3、6、10、15、20、26、 35、45小时进样，结果见表1-6。结果显示：供试品溶液中的盐酸小檗碱含量及表小檗碱、黄连碱、巴马汀总量在45小时内保持稳定。
表1-6稳定性试验
Figure RE-GDA0001854417870000142
3.4.4精密度试验
取同一批S01供试品的溶液，重复进样6次，结果见表1-7。结果显示：仪器精密度良好。
表1-7精密度试验
Figure RE-GDA0001854417870000151
3.4.5重复性试验
按3.2.3中最终确定的供试品溶液制备方法平行制备6份供试品S01溶液，分别测定，结果见表1-8。结果显示：方法重现性良好。
表1-8重复性试验
Figure RE-GDA0001854417870000152
3.4.6准确度试验
取同一已知含量的黄连配方颗粒中间体粉末(批号S01)约0.05g，精密称定，共9份，分别精密加入盐酸小檗碱对照品溶液(浓度为0.4919mg/mL)5.0、 9.5、14mL，共三个水平，每一水平平行3份，然后分别精密加入甲醇适量至补足50.0mL，密塞，称定重量，按3.2.3中最终确定的方法制成供试品溶液，分别测定，计算回收率，结果见表1-9。结果显示：方法回收率在95～102％之间，符合规定。
表1-9准确度试验
Figure RE-GDA0001854417870000153
Figure RE-GDA0001854417870000161
3.4.7耐用性试验
a.不同柱温
试验对25℃、30℃、35℃三个不同柱温进行了考察，结果显示：三个柱温条件下待测化合物均能较好分离，且含量测定结果无明显差异，说明方法的耐用性较好。结果见表1-10，图6～图8。
表1-10不同柱温比较结果
Figure RE-GDA0001854417870000162
b.不同流速
试验对0.8ml/min、1.0ml/min、1.2ml/min三个不同流速进行了考察，结果显示：三个流速条件下待测化合物均能较好分离，且含量测定结果无明显差异，说明方法的耐用性较好。结果见表1-11，图9～图11。
表1-11不同流速比较结果
Figure RE-GDA0001854417870000163
c.不同流动相pH值
调节流动相pH值为3.6、3.7、3.8，然后分别在三个不同条件下进行试验，结果显示：三个pH条件下待测化合物均能较好分离，且含量测定结果无明显差异，说明方法的耐用性较好。结果见表1-12，图12～图14。
表1-12不同流动相pH值比较结果
Figure RE-GDA0001854417870000171
d.不同色谱柱
试验对比了三个不同厂家的色谱柱(Venusil MP C18、Agilent Extend C18、Welch
Figure RE-GDA0001854417870000172
LP-C18)，结果显示：待测化合物在三个不同的色谱柱中均能较好分离，且含量测定结果无明显差异，说明方法的耐用性较好。结果见表 1-13，图15～图17。
表1-13不同色谱柱比较结果
Figure RE-GDA0001854417870000173
e.不同仪器
试验对不同仪器(Agilent1100、1260)进行了比较，结果显示：待测化合物在两种不同型号的仪器上均能较好分离，且含量测定结果无明显差异，说明方法的耐用性较好。结果见表1-14，图18～图19。
表1-14不同仪器比较结果
Figure RE-GDA0001854417870000174
Figure RE-GDA0001854417870000181
4.含量测定
按含量测定方法对不同批次黄连配方颗粒中间体(S01-S03)进行测定，结果见表1-15。
表1-15黄连配方颗粒中间体含量测定结果
Figure RE-GDA0001854417870000182
《中国药典》2015年版一部规定，黄连片含小檗碱(C20H17NO4)不得少于 5.0wt％，表小檗碱(C20H17NO4)、黄连碱(C19H13NO4)和巴马汀(C21H21NO4) 的总量不得少于3.3wt％。本品3批样品的小檗碱含量及表小檗碱、黄连碱和巴马汀总量测定结果分别为9.0～11.0wt％、5.0～6.5wt％之间，符合规定要求。
实施例2黄连配方颗粒中小檗碱含量及表小檗碱、黄连碱、巴马汀总量的检测方法
1.实验材料
供试品来源：黄连配方颗粒由制备例2方法得到，配方颗粒(三个批次编号 A01-A03)均由湖北香连药业提供。
其余与实施例1所用实验仪器及材料相同。
2.实验方法
2.1色谱条件考察
色谱柱：Extend C18柱(250mm×4.6mm，5μm，Agilent Technologies)；
流动相：分别对以下五种流动相进行了比较：
①乙腈-0.1％磷酸(体积比30∶70)；
②乙腈-0.05mol/L磷酸二氢钾溶液(体积比25∶75)；
③乙腈-0.025mol/L磷酸二氢钾溶液(体积比28∶72)；
④乙腈-0.05mol/L磷酸二氢钾溶液(体积比49∶51)(每100ml中加十二烷基硫酸钠0.4g，再以磷酸调节pH值为3.7)。
流速：1mL/min；检测波长：345nm；理论板数按盐酸小檗碱峰计算不低于 5000。
2.2药液的配制
2.2.1对照品溶液的制备：取盐酸小檗碱对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含40μg的溶液，即得。
2.2.2供试品溶液考察
(1)提取方法的考察
对以下三种提取方法进行了比较：
①取黄连配方颗粒样品，采用研钵将其研为粉末，取粉末约0.1g，精密称定，置于具有塞的锥形瓶中，精密加入甲醇-盐酸(100∶1)50mL，密塞，称定重量，超声处理40分钟，放冷，再称定重量，用甲醇-盐酸(100∶1)补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液2mL，置10mL量瓶中，加甲醇-盐酸(100∶1)至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
②取黄连配方颗粒样品，采用研钵将其研为粉末，取粉末约0.1g，精密称定，置于具有塞的锥形瓶中，精密加入甲醇-盐酸(100∶1)50mL，密塞，称定重量，于60℃水浴加热30分钟，放冷，再超声处理40分钟，放冷，称定重量，用甲醇- 盐酸(100∶1)补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液2ml，置10ml 量瓶中，加甲醇-盐酸(100∶1)至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
③取黄连配方颗粒样品，采用研钵将其研为粉末，取粉末约0.1g，精密称定，置圆底烧瓶中，精密加入甲醇-盐酸(100∶1)50mL，称定重量，于85℃水浴中回流40分钟，放冷，再称定重量，用甲醇-盐酸(100∶1)补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液2mL，置10mL量瓶中，加甲醇-盐酸(100∶1)至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
(2)提取溶剂的考察
取黄连配方颗粒样品，采用研钵将其研为粉末，取粉末约0.1g，精密称定，置于具有塞的锥形瓶中，分别精密加入甲醇、甲醇-盐酸(500∶1)、70％甲醇- 盐酸(100∶1)、甲醇-盐酸(100∶1)各50mL，密塞，称定重量，超声处理40 分钟，放冷，再称定重量，分别用相应的溶剂补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液2mL，置10mL量瓶中，分别加相应的溶剂至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
(3)提取时间的选择
取黄连配方颗粒样品，采用研钵将其研为粉末，取粉末约0.1g，精密称定，置于具有塞的锥形瓶中，精密加入甲醇50mL，密塞，称定重量，分别超声处理 20、30和40分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液2mL，置10mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
2.2.3测定方法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定，以盐酸小檗碱对照品的峰面积为对照，分别计算小檗碱、表小檗碱、黄连碱和巴马汀的含量，用待测成分色谱峰与盐酸小檗碱色谱峰的相对保留时间确定。
3.检测结果
3.1色谱条件考察结果
精密吸取供试品溶液10μL，注入液相色谱仪，分别按照流动相条件①-④进行考察，记录色谱图，见图20-23。结果表明，在流动相④条件下，待测化合物各峰均能达到较好分离，系统适用性良好。因此选择流动相条件④为检测方法的流动相条件。
精密吸取对照品混合溶液10μL，注入液相色谱仪，按照流动相条件④进行考察，记录色谱图，见图5。
3.2供试品溶液制备方法考察结果
3.2.1按照2.1中的色谱条件(流动相④)，精密吸取不同提取方法制得的供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，记录峰面积值，计算小檗碱含量及表小檗碱、黄连碱和巴马汀的总量，结果见表2-1。结果显示：三种提取方法无显著差异，但方法①的操作更为简单、省时。
表2-1提取方法的比较
Figure RE-GDA0001854417870000211
3.2.2按照2.1中的色谱条件(流动相④)，精密吸取不同提取溶剂制得的供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，记录峰面积值，计算小檗碱含量及表小檗碱、黄连碱和巴马汀的总量，结果见表2-2。结果显示：四种提取溶剂无显著差异，故选择较为简单的甲醇作为提取溶剂。
表2-2提取溶剂的比较
Figure RE-GDA0001854417870000212
3.2.3按照2.1中的色谱条件(流动相④)，精密吸取不同超声时间制得的供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，记录峰面积值，计算小檗碱含量及表小檗碱、黄连碱和巴马汀的总量，结果见表2-3。结果显示：提取时间为20分钟时已提取完全，故最终选择提取时间为20分钟。
表2-3提取时间的比较
Figure RE-GDA0001854417870000221
综合以上试验结果，最终确定供试品溶液制备方法为：取黄连配方颗粒样品，采用研钵将其研为粉末，取粉末约0.1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50mL，密塞，称定重量，超声处理20分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液2mL，置10mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
3.3测定结果
表小檗碱、黄连碱、巴马汀、小檗碱的峰位，其相对保留时间应在规定值的±5％范围之内，即得。相对保留时间见表2-4：
表2-4待测化合物相对保留时间
Figure RE-GDA0001854417870000222
3.4方法学考察
3.4.1线性关系考察
精密称取盐酸小檗碱对照品28.69mg，加甲醇适量溶解并定容至25mL容量瓶中，精密吸取上述溶液适量并逐级稀释成浓度为149.4175、74.7088、39.8447、 19.9223、7.9689、3.1876μg/mL的对照品溶液，每一浓度标样进样10μL，记录色谱图。
以进样量(X)为横坐标，峰面积(Y)为纵坐标，进行线性回归，计算得回归方程为Y＝4426X+5.5853，R＝0.9999。结果见表2-5。结果显示：盐酸小檗碱在0.0319～1.4942μg之间呈良好的线性关系。
表2-5盐酸小檗碱线性关系
Figure RE-GDA0001854417870000231
3.4.2检测限和定量限
取低浓度盐酸小檗碱对照品溶液，逐级稀释，进样测定，以信噪比S/N＝3 时注入仪器的盐酸小檗碱的量确定检测限，以S/N＝10时注入仪器的盐酸小檗碱的量确定定量限。结果，盐酸小檗碱的检测限为0.6169ng，定量限为1.0842ng。
3.4.3稳定性试验
取同一批A01供试品的溶液，室温放置，分别于0、4、9、14、20、29、 40小时进样，结果见表2-6。结果显示：供试品溶液中的盐酸小檗碱含量及表小檗碱、黄连碱、巴马汀总量在40小时内保持稳定。
表2-6稳定性试验
Figure RE-GDA0001854417870000232
3.4.4精密度试验
取同一供试品A01的溶液，重复进样6次，结果见表2-7。结果显示：仪器精密度良好。
表2-7精密度试验
Figure RE-GDA0001854417870000241
3.4.5重复性试验
按3.2.3中最终确定的供试品溶液制备方法平行制备6份供试品A01溶液，分别测定，结果见表2-8。结果显示：方法重现性良好。
表2-8重复性试验
Figure RE-GDA0001854417870000242
3.4.6准确度试验
取同一已知含量的黄连配方颗粒粉末(批号A01)约0.05g，精密称定，共 9份，置不同具塞锥形瓶中，取其中6份，分别精密加入盐酸小檗碱对照品溶液 (浓度为0.5246mg/ml)3.5、6.5ml，用于制备低水平、中水平回收率供试品溶液，每一水平平行3份；取另外3份，分别加入盐酸小檗碱对照品溶液(浓度为0.9961mg/ml)5.5ml，用于制备高水平回收率供试品溶液，一式3份，然后低、中、高三水平分别精密加入甲醇适量至补足50.0ml，密塞，称定重量，按 3.2.3中最终确定的方法制成供试品溶液，分别测定，计算回收率，结果见表2-9。
表2-9准确度试验
Figure RE-GDA0001854417870000251
结果显示：方法回收率在95～102％之间，符合规定。
3.4.7耐用性试验
a.不同柱温
试验对25℃、30℃、35℃三个不同柱温进行了考察，结果显示：三个柱温条件下待测化合物均能较好分离，且含量测定结果无明显差异，说明方法的耐用性较好。结果见表2-10，图24～图26。
表2-10不同柱温比较结果
Figure RE-GDA0001854417870000252
b.不同流速
试验对0.8ml/min、1.0ml/min、1.2ml/min三个不同流速进行了考察，结果显示：三个流速条件下待测化合物均能较好分离，且含量测定结果无明显差异，说明方法的耐用性较好。结果见表2-11，图27～图29。
表2-11不同流速比较结果
Figure RE-GDA0001854417870000253
Figure RE-GDA0001854417870000261
c.不同流动相pH值
调节流动相pH值为3.6、3.7、3.8，然后分别在三个不同条件下进行试验，结果显示：三个pH条件下待测化合物均能较好分离，且含量测定结果无明显差异，说明方法的耐用性较好。结果见表2-12，图30～图32。
表2-12不同流动相pH值比较结果
Figure RE-GDA0001854417870000262
d.不同色谱柱
试验对比了三个不同厂家的色谱柱(Venusil MP C18、Agilent Extend C18、Welch
Figure RE-GDA0001854417870000263
LP-C18)，结果显示：待测化合物在三个不同的色谱柱中均能较好分离，且含量测定结果无明显差异，说明方法的耐用性较好。结果见表 2-13，图33～图35。
表2-13不同色谱柱比较结果
Figure RE-GDA0001854417870000264
e.不同仪器
试验对不同仪器(Agilent1100、1260)进行了比较，结果显示：待测化合物在两种不同型号的仪器上均能较好分离，且含量测定结果无明显差异，说明方法的耐用性较好。结果见表2-14，图36～图37。
表2-14不同仪器比较结果
Figure RE-GDA0001854417870000265
Figure RE-GDA0001854417870000271
4.含量测定
按含量测定方法对不同批次黄连配方颗粒成品(A01-A03)进行测定，结果见表2-15。
表2-15黄连配方颗粒成品含量测定结果
Figure RE-GDA0001854417870000272
《中国药典》2015年版一部规定，黄连片含小檗碱(C20H17NO4)不得少于 5.0％，表小檗碱(C20H17NO4)、黄连碱(C19H13NO4)和巴马汀(C21H21NO4) 的总量不得少于3.3wt％。本品3批样品的小檗碱含量及表小檗碱、黄连碱和巴马汀总量测定结果分别为6.0～8.0wt％、3.5～5.0wt％之间，符合规定要求。
以上，对本发明的实施方式进行了说明。但是，本发明不限定于上述实施方式。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种小檗碱含量及表小檗碱、黄连碱、巴马汀总量的检测方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：采用高效液相色谱法，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈-磷酸二氢钾溶液作为流动相，对供试品溶液进行测定。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于该检测方法具体包括以下步骤：
(1)供试品溶液的制备：取黄连配方颗粒或配方颗粒的中间体，加入溶剂提取，即得供试品溶液；
(2)测定：采用高效液相色谱法，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈-磷酸二氢钾溶液作为流动相，对供试品溶液进行测定，以盐酸小檗碱对照品的峰面积为对照，分别计算小檗碱、表小檗碱、黄连碱和巴马汀的含量。
3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，步骤(1)中，所述溶剂可以选自甲醇和/或甲醇的酸性溶液；
优选地，所述提取的方法包括超声提取、加热提取、回流提取；
优选地，所述供试品溶液配制时黄连配方颗粒或配方颗粒的中间体与溶剂的质量体积比(g/mL)为(0.08～0.13):50。
4.根据权利要求2或3所述的检测方法，其特征在于，步骤(1)中，所述黄连配方颗粒中间体由以下步骤得到：向清膏中加入辅料，混匀，喷雾干燥，即得黄连配方颗粒中间体；
优选地，所述清膏由以下步骤得到：黄连饮片经浸泡、煎煮和过滤后，滤液浓缩得到清膏。
5.根据权利要求2～4任一项所述的检测方法，其特征在于，所述黄连配方颗粒中间体的水分含量不超过6.0wt％；
优选地，所述黄连配方颗粒中间体的醇溶性浸出物的含量不低于38.0wt％。
6.根据权利要求2～5任一项所述的检测方法，其特征在于，所述黄连配方颗粒是由黄连配方颗粒中间体与辅料混匀、制粒得到。
7.根据权利要求2～6任一项所述的检测方法，其特征在于，所述黄连配方颗粒中活性成分黄连的含量为250～800mg/g；
优选地，所述黄连配方颗粒中水分的含量为5.5～8.0wt％；
优选地，所述黄连配方颗粒的醇溶性浸出物的含量不低于31.0wt％；
优选地，所述黄连配方颗粒的粒度在10～100目之间。
8.根据权利要求2～7任一项所述的检测方法，其特征在于，步骤(2)中，所述流动相中，乙腈与磷酸二氢钾溶液的体积比为(20～60):(40～80)；
优选地，所述磷酸二氢钾溶液的浓度为0.02～0.06mol/L；
优选地，所述磷酸二氢钾溶液中含有0.3～0.6mg/mL的十二烷基硫酸钠(SDS)；
优选地，所述磷酸二氢钾溶液的pH值控制在3.3～4.2之间。
9.根据权利要求2～8任一项所述的检测方法，其特征在于，步骤(2)中，所述测定条件：
流动相的流速0.5～1.5ml/min；
色谱柱：Venusil MP C18、Agilent Extend C18、Welch
Figure FDA0001783482040000021
LP-C18中的至少一种；
柱温：20～40℃；
进样量：10～20μL；
检测波长：320～360nm；
理论板数按盐酸小檗碱峰计算应不低于5000。
10.根据权利要求2～9任一项所述的检测方法，其特征在于，该方法还包括步骤(3)对照品溶液的制备：取盐酸小檗碱，加入溶剂溶解，即得对照品溶液。
CN201811003415.9A 2018-08-30 2018-08-30 黄连配方颗粒和配方颗粒中间体中小檗碱及其它物质总量的检测方法 Pending CN110873759A (zh)

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