CN110859960A - 靶向AMPK的抑制剂/siRNA与蛋白酶体抑制剂组合在制备抗肿瘤药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了靶向AMPK的抑制剂和/或siRNA与蛋白酶体抑制剂组合在制备抗肿瘤药物中的应用。本发明提供的用途显示:蛋白酶体抑制剂能够显著促进靶向AMPK的抑制剂和/或siRNA诱导的肿瘤细胞死亡。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域,具体涉及一种靶向AMPK的抑制剂/siRNA与蛋白酶体抑制剂组合在制备抗肿瘤药物中的应用。
背景技术
肿瘤一直是人类身体健康和生命安全的重大挑战。目前,肿瘤在全球的发病率及死亡率呈逐年上升的趋势,严重危害人类健康和生命安全。尽管随着生物医药技术的飞速发展,肿瘤治疗手段越来越多,水平也逐渐提高,肿瘤患者的生存率已经有了很大的改善,但是肿瘤治疗总体水平依然不高。肿瘤基因组的不稳定性以及较高的异质性是肿瘤难治的主要原因。幸运的是,肿瘤细胞还具有一些共同特征,如Warburg效应、激酶成瘾(Kinaseaddiction)等。这些特征在肿瘤进展过程中被肿瘤细胞过度依赖,从而成为它们致命的缺陷,是肿瘤治疗的突破口。基于这个理论,在过去的30年里,激酶抑制剂类药物(如伊马替尼)在肿瘤治疗方面飞速发展,成绩斐然。但随着这些药物临床应用的推广,一个显著的问题也逐渐摆在我们面前一一耐药性导致的治疗失败、复发。因此,临床上肿瘤治疗一直需要新的靶向药物或组合方案来减缓耐药发生,提高治疗水平。
腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)是细胞的能量和营养感受器,对细胞能量稳态以及代谢调控中起关键性作用。传统观点认为,正常情况下AMPK是一个肿瘤抑制因子,在癌症发展初期,可以通过代谢调控或者磷酸化介导肿瘤抑制因子TET2、p53、TSC2等抑制肿瘤生长。然而近年来,越来越多的研究发现在一些特殊的基因状态或代谢压力条件下(如缺氧、营养匮乏等),AMPK在肿瘤细胞中表达上调或者活化增强,对维持肿瘤细胞生存具有重要的作用。在原位移植的乳腺肿瘤中,AMPK通过调节肿瘤细胞的氧化还原稳态,维持细胞存活(参考文献S.M.Jeon,N.S.Chandel,N.Hay.AMPK regulates NADPH homeostasis to promotetumour cell survival during energy stress.Nature,485 (2012),pp.661-665);在三种不同的小鼠白血病模型:急性髓系白血病(AML)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、急性T淋巴细胞白血病(T-ALL)中,AMPK 基因缺失导致肿瘤细胞死亡,并显著提高了小鼠白血病的存活率(参见:Eichner LJ,Brun SN.Genetic analysis reveals AMPK is required tosupport tumor growth in Murine Kras-Dependent Lung Cancer Models.CellMetab.2019Feb 5;29(2):285-302.e7.doi:10.1016/j.cmet.2018.10.005.);此外,在髓系白血病模型中,AMPKα1亚基和α2亚基的缺失会导致起始肿瘤细胞无法应对代谢压力而死亡(参见:Saito,Y,Chapple,R.H,Lin,A,Kitano,A,and Nakada,D.AMPK protects leukemia-initiating cells in myeloid leukemias from metabolic stress in the bonemarrow.Cell Stem Cell.(2015)17,585–596.)。这些结果表明,AMPK在肿瘤发生之前或者早期,确实发挥抗肿瘤作用,但一旦肿瘤发生发展,随着细胞生存环境以及压力的改变,它往往被肿瘤细胞挟持以抵抗环境或者代谢压力,促进肿瘤进展。这部分肿瘤最终往往表现出对AMPK激酶活性的过度依赖,即激酶成瘾(参见:Faubert B,Vincent EE,PoffenbergerMC,Jones RG.The AMP-activated protein kinase(AMPK)and cancer:many faces of ametabolic regulator.Cancer Lett.2015Jan 28;356(2Pt A):165-70.)。因此,对于AMPK激酶成瘾的肿瘤,AMPK是一个极有潜力的治疗靶点。
虽然肿瘤的分子靶向治疗中激酶抑制剂展现了良好的发展前景,但其治疗成效与多种因素有关,如分子靶点的特异性,肿瘤细胞的微环境,肿瘤的新生血管生成以及患者的机体免疫功能等,因而对现有的激酶抑制剂还需要进一步优化。另一方面,尽管初期临床疗效令人振奋,但也很容易发生耐药性,影响疗效。肿瘤发展过程中往往形成多激酶的依赖,如果只阻断其中一条,作用时效通常较短,癌细胞很容易通过其他激酶产生代偿机制,导致耐药提早发生。因此,发现尽可能多的成瘾激酶并针对性开发抑制剂,在治疗早期即通过组合方式对肿瘤细胞进行多激酶的阻断,往往能够产生更好的疗效。
发明内容
本发明的目的在于提供一种靶向AMPK的抑制剂和/或siRNA与蛋白酶体抑制剂组合在制备抗肿瘤药物中的应用、用于治疗肿瘤的药物或试剂盒,旨在解决激酶抑制剂易耐药导致肿瘤治疗失败、复发的问题。
为实现上述发明目的,本发明采用的技术方案如下:
本发明第一方面提供了靶向AMPK的抑制剂和/或siRNA与蛋白酶体抑制剂组合在制备抗肿瘤药物中的应用。
本发明第二方面提供了用于治疗肿瘤的药物或试剂盒,包括靶向AMPK的抑制剂、靶向AMPK的siRNA中的至少一种以及蛋白酶体抑制剂。
本申请实施例提供的靶向AMPK的抑制剂和/或siRNA与蛋白酶体抑制剂组合在抗肿瘤中的应用的有益效果在于:靶向AMPK的抑制剂和/或siRNA与蛋白酶体抑制剂组合作用于肿瘤细胞时,能够显著促进AMPK过表达或活性增强的肿瘤细胞死亡;靶向AMPK的抑制剂和/或siRNA与蛋白酶体抑制剂组合作用于移植瘤小鼠时,能够显著抑制小鼠移植瘤的生长,延长小鼠生存期。靶向AMPK的抑制剂和/或siRNA与蛋白酶体抑制剂组合有望成为新的抗肿瘤药物,为临床肿瘤治疗提供了新的潜力方向。
本申请实施例提供的用于治疗肿瘤的药物或试剂盒的有益效果在于:靶向 AMPK的抑制剂和/或siRNA与蛋白酶体抑制剂组合作用于肿瘤细胞时,能够显著促进AMPK过表达或活性增强的肿瘤细胞死亡;靶向AMPK的抑制剂和/ 或siRNA与蛋白酶体抑制剂组合作用于移植瘤小鼠时,能够显著抑制小鼠移植瘤的生长,延长小鼠生存期。靶向AMPK的抑制剂和/或siRNA与蛋白酶体抑制剂组合有望成为新的抗肿瘤药物,为临床肿瘤治疗提供了新的潜力方向。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案,下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动性的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本申请实施例1提供的AMPK抑制剂Dorsomorphin(Compound C) 及其组合物蛋白酶体抑制剂硼替佐米Bortezomib(PS-341)对Hela细胞死亡的流式细胞仪检测分析结果及统计分析图;
图2是本申请实施例1提供的AMPK抑制剂Dorsomorphin(Compound C) 及其组合物蛋白酶体抑制剂硼替佐米Bortezomib(PS-341)对Jurkat细胞死亡的流式细胞仪检测分析结果及统计分析图;
图3是本申请实施例1提供的AMPK抑制剂Dorsomorphin(Compound C) 及其组合物蛋白酶体抑制剂硼替佐米Bortezomib(PS-341)对K562细胞死亡的流式细胞仪检测分析结果及统计分析图;
图4是本申请实施例2提供的AMPKα1特异性siRNA的沉默效果验证图;
图5是本申请实施例2提供的AMPKα2特异性siRNA的沉默效果验证图;
图6是本申请实施例2提供的AMPK siRNA及蛋白酶体抑制剂硼替佐米 Bortezomib(PS-341)对Hela细胞死亡的流式细胞仪检测分析结果及统计分析图;
图7是本申请实施例3提供的Hela移植瘤生长曲线图;
图8是本申请实施例3提供的Hela移植瘤小鼠体重变化曲线图;
图9是本申请实施例3提供的Hela移植瘤小鼠的生存时间曲线图。
具体实施方式
为了使本发明要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白,以下结合实施例,对本发明进行进一步详细说明。应当理解,此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明,并不用于限定本发明。
术语“第一”、“第二”仅用于便于描述目的,而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明技术特征的数量。“多个”的含义是两个或两个以上,除非另有明确具体的限定。
本申请中,所述“特异地结合并抑制AMPK三聚体”是指基于AMPK三聚体的特异性结构,能够识别并对应结合在AMPK三聚体的特异性区域,并对除特异性区域的其他区域没有识别功能,即不与非特异性区域发生交叉反应。
为了说明本申请所述的技术方案,以下结合具体附图及实施例进行详细说明。
本申请实施例提供靶向AMPK的抑制剂和/或siRNA与蛋白酶体抑制剂组合在抗肿瘤中的应用。
本申请实施例提供的靶向AMPK的抑制剂和/或siRNA与蛋白酶体抑制剂组合在抗肿瘤中的应用的有益效果在于:靶向AMPK的抑制剂和/或siRNA与蛋白酶体抑制剂组合作用于肿瘤细胞时,能够显著促进AMPK过表达或活性增强的肿瘤细胞死亡;靶向AMPK的抑制剂和/或siRNA与蛋白酶体抑制剂组合作用于移植瘤小鼠时,能够显著抑制小鼠移植瘤的生长,延长小鼠生存期。即 AMPK阻断(包括靶向AMPK抑制剂和/或靶向AMPK的siRNA)联合蛋白酶体抑制剂,在肿瘤细胞水平和小鼠动物模型测试中具有较好的抗肿瘤作用。靶向AMPK的抑制剂和/或siRNA与蛋白酶体抑制剂组合有望成为新的抗肿瘤药物,为临床肿瘤治疗提供了新的潜力方向。其中,所述“联合”是一种给药方式,其包括两种或多种药物先后、或同时给药的各种情况。此处,所述“同时”是指在同一给药周期给予靶向AMPK抑制剂、靶向AMPK的siRNA中的至少一种和蛋白酶体抑制剂,例如在2天内、或1天内、或更短的时间内,给予三种药物。所述“先后”给药,则包括在不同给药周期内分别给予靶向AMPK抑制剂、靶向AMPK的siRNA中的至少一种和蛋白酶体抑制剂的情况。这些给药方式,均属于本申请所述的“联合”的给药方式。
具体的,AMPK包括三条亚基,包括一个α-催化亚基、一个β-调节亚基和一个结构γ-调节亚基组成。其中,人类和啮齿动物的α-亚基包括两种亚型,分别为α1和α2;β-亚基包括两种亚型,分别为β1和β2;γ-亚基包括三种亚型,分别为γ1、γ2、γ3。
本申请一种实施方式中,采用抑制剂靶向抑制AMPK的表达。其中,所述靶向AMPK的抑制剂是指能够靶向抑制AMPK表达的物质,可以以靶向抑制α1 亚基活性、靶向抑制α2亚基活性、靶向抑制β1亚基活性、靶向抑制β2亚基活性、靶向抑制γ1亚基活性、靶向抑制γ2亚基活性、靶向抑制γ3亚基活性中的至少一种来达到靶向AMPK的目的。
在一些实施例中,所述靶向AMPK的抑制剂为特异地结合并抑制AMPK 三聚体的小分子药物、特异地结合并抑制AMPK的小分子肽、特异地结合并抑制AMPK的反义化合物中的至少一种。
在一些实施例中,所述小分子药物选自Dorsomorphin。所述Dorsomorphin 靶向抑制AMPK时具有高效、选择性好的作用,对与AMPK具有相似结构的激酶,如ZAPK,SYK,PKCθ,PKA、JAK3没有显著的抑制作用。此外, Dorsomorphin靶向抑制AMPK的抑制效果与剂量直接相关,易于把控。
在一些实施例中,所述小分子肽选自靶向AMPK的sRNA或sgRNA。
本发明实施例中,所述反义化合物即反义寡核苷酸。在一些实施例中,所述反义化合物选自硫代磷酸寡核苷酸。所述硫代磷酸寡核苷酸在述靶向抑制 AMPK时,可以选择性抑制AMPK中的一个亚基即可达到抑制AMPK信号的目的,对其他亚基的功能没影响,副作用较小。此外,所述硫代磷酸寡核苷酸还克服了寡核苷酸在血清中易被核酸酶降解的问题。
本申请另一种实施方式中,采用siRNA或shRNA靶向抑制AMPK的表达。
在一些实施例中,所述靶向AMPK的siRNA为靶向作用于AMPKα亚基的siRNA、靶向作用于AMPKβ亚基的siRNA、靶向作用于AMPKγ亚基的 siRNA、靶向作用于AMPK亚基的病毒介导的shRNA中的至少一种。
其中,作用于AMPKα亚基的siRNA、靶向作用于AMPKβ亚基的siRNA、靶向作用于AMPKγ亚基的siRNA能够直接通过抑制AMPK的三条亚基实现对AMPK的靶向抑制。靶向作用于AMPK亚基的病毒介导的shRNA,通过设计短发夹shRNA序列并克隆到表达载体能表达短的siRNA,经过慢病毒包装系统,可直接感染细胞,并且感染后能整合到细胞的基因组上,进行长时间的稳定表达。
此外,本申请实施例还可以采用改变AMPK基因使其失活的方式,抑制 AMPK基因的表达。在一些实施例中,可采用CRISPER-CAS9技术敲除AMPK 基因手段的至少一种,使AMPK基因表达失去活性,从而达到抑制AMPK表达的目的。
仅仅通过靶向抑制AMPK的表达,还不足以发挥抗肿瘤活性。本申请实施例在含有靶向AMPK的抑制剂和/或siRNA的基础上,进一步联合蛋白酶体抑制剂,达到较好的抗肿瘤活性。
在一些实施例中,所述蛋白酶体抑制剂选自蛋白酶体抑制剂Bortezomib、蛋白酶体抑制剂MG132、蛋白酶体抑制剂Carfilzomib、蛋白酶体抑制剂 Ixazomib中的至少一种。科研人员研究发现:AMPK阻断诱导的肿瘤细胞死亡与蛋白质稳态破坏有关,靶向抑制AMPK联合蛋白酶体抑制剂协同作用会促进错误折叠蛋白的产生、累积,损害细胞功能,加剧破坏肿瘤细胞中蛋白质稳态破坏。
在一些实施例中,靶向AMPK的Dorsomorphin与蛋白酶体抑制剂 Bortezomib联合作用在抗肿瘤中的应用。本申请实施例提供的所述靶向AMPK 的Dorsomorphin特异性地结合在AMPK上,抑制AMPK的活性;同时,所述蛋白酶体抑制剂Bortezomib干扰肿瘤细胞蛋白质的稳定,增强靶向抑制AMPK 活性的抗肿瘤效果。具体的,科研人员研究发现:在AMPK过表达或活化增强的肿瘤细胞中,阻断AMPK使肿瘤细胞对26S蛋白酶体抑制剂Bortezomib诱导的细胞死亡更敏感。在小鼠荷瘤模型中也发现,联合注射AMPK抑制剂Dorsomorphin(CompoundC)和蛋白酶体抑制剂Bortezomib(PS-341)相比单独注射AMPK抑制剂Dorsomorphin(Compound C)能更显著抑制宫颈癌移植瘤的生长,生存期延长(可参考图6-9)。此外,硼替佐米Bortezomib(PS-341)是获批上市的临床用药,作为蛋白酶体抑制剂与靶向AMPK的Dorsomorphin联用,安全性较有保障。
在一些实施例中,所述靶向AMPK的Dorsomorphin的药物浓度为10 μmol/L~20μmol/L;所述蛋白酶体抑制剂Bortezomib的药物浓度为0.5μmol/L~ 1μmol/L。此时,所述Dorsomorphin靶向抑制AMPK的活性较明显,同时,所述蛋白酶体抑制剂Bortezomib在安全浓度范围内干扰肿瘤细胞蛋白质稳定的活性较高,能有显著增强靶向抑制AMPK活性的抗肿瘤效果。
在一些实施例中,靶向作用于AMPKα亚基的siRNA与蛋白酶体抑制剂 Bortezomib联合作用在抗肿瘤中的应用。本申请实施例提供的靶向作用于 AMPKα亚基的siRNA特异性地结合在AMPK的α亚基上,显著抑制AMPK 的活性;同时,所述蛋白酶体抑制剂Bortezomib干扰肿瘤细胞蛋白质的稳定,增强靶向抑制AMPK活性的抗肿瘤效果。
在一些实施例中,靶向作用于AMPKα亚基的siRNA与蛋白酶体抑制剂 Bortezomib联合作用在抗肿瘤中的应用;且所述靶向作用于AMPKα亚基的 siRNA包括si-AMPKα1、si-AMPKα2中的至少一种,且所述si-AMPKα1和所述si-AMPKα2的碱基序列如下:
si-AMPKα1:
正义链:5’-GGAUUAUUGUCACAGGCAUdTdT-3’;
反义链:5’-AUGCCUGUGACAAUAAUCCdTdT-3’;
si-AMPKα2:
正义链:5’-CCACUCUCCUGAUGCAUAUdTdT-3’;
反义链:5’-AUAUGCAUCAGGAGAGUGGdTdT-3’。
在一些实施例中,靶向作用于AMPKα亚基的siRNA与蛋白酶体抑制剂Bortezomib联合作用在抗肿瘤中的应用;且所述靶向作用于AMPKα亚基的 siRNA包括si-AMPKα1、si-AMPKα2中的至少一种,且所述si-AMPKα1和所述si-AMPKα2的碱基序列如下:
si-AMPKα1:
正义链:5’-GGAUUAUUGUCACAGGCAUdTdT-3’;
反义链:5’-AUGCCUGUGACAAUAAUCCdTdT-3’;
si-AMPKα2:
正义链:5’-CCACUCUCCUGAUGCAUAUdTdT-3’;
反义链:5’-AUAUGCAUCAGGAGAGUGGdTdT-3’。
其中,所述si-AMPKα1和所述si-AMPKα2的碱基序列的3’端添加有两个呈单链悬挂结构的脱氧核糖核苷酸。通过在所述si-AMPKα1和所述si-AMPK α2的碱基序列的3’端添加两个呈单链悬挂结构,可以增强siRNA在体内和体外的稳定性,防止si-AMPKα1和/或si-AMPKα2与蛋白酶体抑制剂Bortezomib 联合作用时,si-AMPKα1、si-AMPKα2发生降解。
在一些实施例中,所述靶向AMPK的抑制剂和/或siRNA与所述蛋白酶体抑制剂组合在制备抗肿瘤药物或试剂盒中的应用。
在上述实施例的基础上,所述蛋白酶体抑制剂替换为分子伴侣蛋白HSP90 的抑制剂和/或siRNA,或所述蛋白酶体抑制剂替换为分子伴侣蛋白HSP70的抑制剂和/或siRNA。采用分子伴侣蛋白HSP90或分子伴侣蛋白HSP70与靶向 AMPK的抑制剂和/或siRNA联合,靶向作用于AMPKα亚基的siRNA特异性地结合在AMPK的α亚基上,显著抑制AMPK的活性;同时,分子伴侣蛋白 HSP90或分子伴侣蛋白HSP70可以阻断HSP90/HSP70 N端的ATP结合位点、干扰HSP90/HSP70复合体相互作用、干扰HSP90翻译后修饰等调节 HSP90/HSP70的构象影响蛋白复合物的装配,进而阻断HSP90/HSP70帮助蛋白质正确折叠与成熟,造成错误蛋白质产生/累积,干扰蛋白质稳态。而分子伴侣蛋白HSP90或HSP70的siRNA可以利用siRNA干扰分子伴侣蛋白HSP90/HSP70基因表达。
第二方面,本申请在一些实施例中提供了用于治疗肿瘤的药物或试剂盒,包括靶向AMPK的抑制剂、靶向AMPK的siRNA中的至少一种以及蛋白酶体抑制剂。本申请实施例中,所述用于治疗肿瘤的药物或试剂盒,是指以靶向 AMPK的抑制剂、靶向AMPK的siRNA中的至少一种以及蛋白酶体抑制剂作为药物活性成分,并通过蛋白酶体抑制剂增强靶向抑制AMPK活性的抗肿瘤药物或抗肿瘤试剂盒。
在一些实施例中,所述靶向AMPK的抑制剂为特异地结合并抑制AMPK 三聚体的小分子药物、特异地结合并抑制AMPK的小分子肽、特异地结合并抑制AMPK的反义化合物中的至少一种。
在一些实施例中,所述小分子药物选自Dorsomorphin。所述Dorsomorphin 靶向抑制AMPK时具有高效、选择性好的作用,对与AMPK具有相似结构的激酶,如ZAPK,SYK,PKCθ,PKA、JAK3没有显著的抑制作用。此外, Dorsomorphin靶向抑制AMPK的抑制效果与剂量直接相关,易于把控。
在一些实施例中,所述小分子肽选自靶向AMPK的sRNA或sgRNA。
本发明实施例中,所述反义化合物即反义寡核苷酸。在一些实施例中,所述反义化合物选自硫代磷酸寡核苷酸。所述硫代磷酸寡核苷酸在述靶向抑制 AMPK时,可以选择性抑制AMPK中的一个亚基即可达到抑制AMPK信号的目的,对其他亚基的功能没影响,副作用较小。此外,所述硫代磷酸寡核苷酸还克服了寡核苷酸在血清中易被核酸酶降解的问题。
本申请另一种实施方式中,采用siRNA或shRNA靶向抑制AMPK的表达。
在一些实施例中,所述靶向AMPK的siRNA为靶向作用于AMPKα亚基的siRNA、靶向作用于AMPKβ亚基的siRNA、靶向作用于AMPKγ亚基的 siRNA、靶向作用于AMPK亚基的病毒介导的shRNA中的至少一种。
其中,作用于AMPKα亚基的siRNA、靶向作用于AMPKβ亚基的siRNA、靶向作用于AMPKγ亚基的siRNA能够直接通过抑制AMPK的三条亚基实现对AMPK的靶向抑制。靶向作用于AMPK亚基的病毒介导的shRNA,通过设计短发夹shRNA序列并克隆到表达载体能表达短的siRNA,经过慢病毒包装系统,可直接感染细胞,并且感染后能整合到细胞的基因组上,进行长时间的稳定表达。
此外,本申请实施例还可以采用改变AMPK基因使其失活的方式,抑制 AMPK基因的表达。在一些实施例中,可采用CRISPER-CAS9技术敲除AMPK 基因手段的至少一种,使AMPK基因表达失去活性,从而达到抑制AMPK表达的目的。
仅仅通过靶向抑制AMPK的表达,还不足以发挥抗肿瘤活性。本申请实施例在含有靶向AMPK的抑制剂和/或siRNA的基础上,进一步联合蛋白酶体抑制剂,达到较好的抗肿瘤活性。
在一些实施例中,所述蛋白酶体抑制剂选自蛋白酶体抑制剂Bortezomib、蛋白酶体抑制剂MG132、蛋白酶体抑制剂Carfilzomib、蛋白酶体抑制剂 Ixazomib中的至少一种。科研人员研究发现:AMPK阻断诱导的肿瘤细胞死亡与蛋白质稳态破坏有关,靶向抑制AMPK联合蛋白酶体抑制剂协同作用会促进错误折叠蛋白的产生、累积,损害细胞功能,加剧破坏肿瘤细胞中蛋白质稳态破坏。
在一些实施例中,所述药物或试剂盒的药物活性成分为靶向AMPK的Dorsomorphin与蛋白酶体抑制剂Bortezomib。本申请实施例提供的所述靶向 AMPK的Dorsomorphin特异性地结合在AMPK上,抑制AMPK的活性;同时,所述蛋白酶体抑制剂Bortezomib干扰肿瘤细胞蛋白质的稳定,增强靶向抑制 AMPK活性的抗肿瘤效果。具体的,科研人员研究发现:在AMPK过表达或活化增强的肿瘤细胞中,阻断AMPK使肿瘤细胞对26S蛋白酶体抑制剂 Bortezomib诱导的细胞死亡更敏感。在小鼠荷瘤模型中也发现,联合注射AMPK 抑制剂Dorsomorphin(Compound C)和蛋白酶体抑制剂Bortezomib(PS-341)相比单独注射AMPK抑制剂Dorsomorphin(Compound C)能更显著抑制宫颈癌移植瘤的生长,生存期延长(可参考图6-9)。此外,硼替佐米Bortezomib(PS-341) 是获批上市的临床用药,作为蛋白酶体抑制剂与靶向AMPK的Dorsomorphin 联用,安全性较有保障。
在一些实施例中,所述靶向AMPK的Dorsomorphin的药物浓度为10 μmol/L~20μmol/L;所述蛋白酶体抑制剂Bortezomib的药物浓度为0.5μmol/L~1 μmol/L。此时,所述Dorsomorphin靶向抑制AMPK的活性较明显,同时,所述蛋白酶体抑制剂Bortezomib在安全浓度范围内干扰肿瘤细胞蛋白质稳定的活性较高,能有显著增强靶向抑制AMPK活性的抗肿瘤效果。
在一些实施例中,所述药物或试剂盒的药物活性成分为靶向作用于AMPK α亚基的siRNA与蛋白酶体抑制剂Bortezomib。本申请实施例提供的靶向作用于AMPKα亚基的siRNA特异性地结合在AMPK的α亚基上,显著抑制AMPK 的活性;同时,所述蛋白酶体抑制剂Bortezomib干扰肿瘤细胞蛋白质的稳定,增强靶向抑制AMPK活性的抗肿瘤效果。
在一些实施例中,所述靶向作用于AMPKα亚基的siRNA包括si-AMPK α1、si-AMPKα2中的至少一种,且所述si-AMPKα1和所述si-AMPKα2的碱基序列如下:
si-AMPKα1:
正义链:5’-GGAUUAUUGUCACAGGCAUdTdT-3’;
反义链:5’-AUGCCUGUGACAAUAAUCCdTdT-3’;
si-AMPKα2:
正义链:5’-CCACUCUCCUGAUGCAUAUdTdT-3’;
反义链:5’-AUAUGCAUCAGGAGAGUGGdTdT-3’。
在一些实施例中,靶向作用于AMPKα亚基的siRNA与蛋白酶体抑制剂 Bortezomib联合作用在抗肿瘤中的应用;且所述靶向作用于AMPKα亚基的 siRNA包括si-AMPKα1、si-AMPKα2中的至少一种,且所述si-AMPKα1和所述si-AMPKα2的碱基序列如下:
si-AMPKα1:
正义链:5’-GGAUUAUUGUCACAGGCAUdTdT-3’;
反义链:5’-AUGCCUGUGACAAUAAUCCdTdT-3’;
si-AMPKα2:
正义链:5’-CCACUCUCCUGAUGCAUAUdTdT-3’;
反义链:5’-AUAUGCAUCAGGAGAGUGGdTdT-3’。
其中,所述si-AMPKα1和所述si-AMPKα2的碱基序列的3’端添加有两个呈单链悬挂结构的脱氧核糖核苷酸。通过在所述si-AMPKα1和所述si-AMPK α2的碱基序列的3’端添加两个呈单链悬挂结构,可以增强siRNA在体内和体外的稳定性,防止si-AMPKα1和/或si-AMPKα2与蛋白酶体抑制剂Bortezomib 联合作用时,si-AMPKα1、si-AMPKα2发生降解。
在上述实施例的基础上,所述蛋白酶体抑制剂替换为分子伴侣蛋白HSP90 的抑制剂和/或siRNA,或所述蛋白酶体抑制剂替换为分子伴侣蛋白HSP70的抑制剂和/或siRNA。
在一些实施例中,所述用于治疗肿瘤的药物或试剂盒包括靶向AMPK的抑制剂、靶向AMPK的siRNA中的至少一种以及分子伴侣蛋白HSP90的抑制剂和/或siRNA。
在一些实施例中,所述用于治疗肿瘤的药物或试剂盒包括靶向AMPK的抑制剂、靶向AMPK的siRNA中的至少一种以及分子伴侣蛋白HSP70的抑制剂和/或siRNA。
在上述实施例的基础上,所述蛋白酶体抑制剂替换为分子伴侣蛋白HSP90 的抑制剂和/或siRNA,或所述蛋白酶体抑制剂替换为分子伴侣蛋白HSP70的抑制剂和/或siRNA。采用分子伴侣蛋白HSP90或分子伴侣蛋白HSP70与靶向 AMPK的抑制剂和/或siRNA联合,靶向作用于AMPKα亚基的siRNA特异性地结合在AMPK的α亚基上,显著抑制AMPK的活性;同时,分子伴侣蛋白 HSP90或分子伴侣蛋白HSP70可以阻断HSP90/HSP70 N端的ATP结合位点、干扰HSP90/HSP70复合体相互作用、干扰HSP90翻译后修饰等调节 HSP90/HSP70的构象影响蛋白复合物的装配,进而阻断HSP90/HSP70帮助蛋白质正确折叠与成熟,造成错误蛋白质产生/累积,干扰蛋白质稳态。而分子伴侣蛋白HSP90或HSP70的siRNA可以利用siRNA干扰分子伴侣蛋白 HSP90/HSP70基因表达。
本申请实施例提供的用于治疗肿瘤的药物或试剂盒的有益效果在于:靶向 AMPK的抑制剂和/或siRNA与蛋白酶体抑制剂组合作用于肿瘤细胞时,能够显著促进AMPK过表达或活性增强的肿瘤细胞死亡;靶向AMPK的抑制剂和/ 或siRNA与蛋白酶体抑制剂组合作用于移植瘤小鼠时,能够显著抑制小鼠移植瘤的生长,延长小鼠生存期。靶向AMPK的抑制剂和/或siRNA与蛋白酶体抑制剂组合有望成为新的抗肿瘤药物,为临床肿瘤治疗提供了新的潜力方向。
下面结合具体实施例进行说明。
实施例1
流式细胞术检测靶向AMPK抑制剂与蛋白酶体抑制剂组合物对肿瘤细胞凋亡的影响,包括以下步骤:
(1)细胞处理:
选用的细胞系为高表达AMPK的人宫颈癌细胞系Hela或者AMPK磷酸化水平高的人慢性髓系白血病细胞系K562及人急性白血病T细胞系Jurkat,操作方法如下:
1)人宫颈癌细胞系Hela、人慢性髓系白血病细胞系K562及人急性白血病T 细胞系Jurkat分别以2×105细胞/孔、1×106细胞/孔和1×106细胞/孔的密度接种 12孔板中;
2)随机分为空白对照组(CT组)、Dorsomorphin(Compound C)组(C.C组),Bortezomib组(PS-341组)和C.C联合PS-341组(C.C+PS-341组)。空白对照组的细胞不作任何处理;Dorsomorphin(Compound C)组的细胞中添加AMPK抑制剂Dorsomorphin(CompoundC),且AMPK抑制剂Dorsomorphin的浓度为 10-20μmol/L;Bortezomib组的细胞中添加蛋白酶体抑制剂组合物Bortezomib,且蛋白酶体抑制剂组合物Bortezomib的浓度为0.5-1μmol/L;C.C联合PS-341 组的细胞中加入AMPK抑制剂Dorsomorphin(Compound C)和蛋白酶体抑制剂组合物Bortezomib(PS-341),其中,AMPK抑制剂Dorsomorphin的浓度为10-20 μmol/L,蛋白酶体抑制剂组合物Bortezomib的浓度为0.5-1μmol/L,培养24-36 h后,检测细胞死亡情况。
(2)流式细胞术分析细胞死亡情况
1)收集细胞悬液,将细胞悬液3200rpm,4℃离心5min,弃掉上清,收集沉淀中的细胞;
2)用预冷的PBS洗涤细胞1次,然后用400μL PI染色液(0.05mg/mL) 重悬细胞;
3)4℃避光染色15min;
4)流式细胞仪检测凋亡情况:PI阳性的细胞为死亡细胞。统计死亡细胞数量,按照死亡细胞占细胞总数的百分比,计算细胞死亡率。
实施例1提供的AMPK抑制剂Dorsomorphin(Compound C)及其组合物蛋白酶体抑制剂硼替佐米Bortezomib(PS-341)作用于Hela细胞的细胞死亡率图如图1所示。图1显示,CT组(Ctrl CT)的Hela细胞死亡率为2.62%,C.C组 (Ctrl C.C)的Hela细胞死亡率为23.7%,PS-341组(PS341 CT)的Hela细胞死亡率为6.22%,C.C联合PS-341组(PS341 C.C)的Hela细胞死亡率为70.7%。可见,蛋白酶体抑制剂硼替佐米Bortezomib(PS-341)显著促进AMPK抑制剂 Dorsomorphin(Compound C)诱导的Hela细胞死亡。
实施例1提供的AMPK抑制剂Dorsomorphin(Compound C)及其组合物蛋白酶体抑制剂硼替佐米Bortezomib(PS-341)作用于Jurkat细胞的细胞死亡率图如图2所示。图2显示,CT(Ctrl CT)组的Jurkat细胞死亡率为4.09%,C.C 组(Ctrl C.C)的Jurkat细胞死亡率为26.4%,PS-341组(PS341 CT)的Jurkat 细胞死亡率为13.5%,C.C联合PS-341组(PS341C.C)的Jurkat细胞死亡率为 40.6%。可见,蛋白酶体抑制剂硼替佐米Bortezomib(PS-341)显著促进AMPK抑制剂Dorsomorphin(Compound C)诱导的Jurkat细胞死亡。
实施例1提供的AMPK抑制剂Dorsomorphin(Compound C)及其组合物蛋白酶体抑制剂硼替佐米Bortezomib(PS-341)作用于K562细胞的细胞死亡率图如图3所示。图3显示,CT组(Ctrl CT)的K562细胞死亡率为3.85%,C.C 组的K562细胞死亡率为14.8%(Ctrl C.C),PS-341组(PS341 CT)的K562 细胞死亡率为12.3%,C.C联合PS-341组(PS341 C.C)的K562细胞死亡率为 36.9%。可见,蛋白酶体抑制剂硼替佐米Bortezomib(PS-341)显著促进AMPK抑制剂Dorsomorphin(Compound C)诱导的K562细胞死亡。
实施例2
流式细胞术检测靶向AMPK特异性siRNA与蛋白酶体抑制剂组合物对肿瘤细胞凋亡的影响,包括以下步骤:
(1)siRNA设计与转染
根据siRNA靶序列基本原则,针对人AMPKα1和AMPKα2基因转录本 (NM_001355028.2和NM_006252.4)分别设计1条21个核苷酸的siRNA序列,即si-AMPKα1和si-AMPKα2,包括正义链和反义链,其碱基序列如下:
si-AMPKα1:
正义链:5’-GGAUUAUUGUCACAGGCAUdTdT-3’;
反义链:5’-AUGCCUGUGACAAUAAUCCdTdT-3’;
si-AMPKα2:
正义链:5’-CCACUCUCCUGAUGCAUAUdTdT-3’;
反义链:5’-AUAUGCAUCAGGAGAGUGGdTdT-3’;
本实施例所述干扰片段的3’端添加两个呈单链悬挂结构的脱氧核糖核苷酸,以增强siRNA在体内和体外的稳定性,防止降解。
本实施例选择的阴性对照(NC)siRNA碱基序列如下:
正义链:5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUdTdT-3’;
反义链:5’-ACGUGACACGUUCGGAGAAdTdT-3’;
上述siRNA由上海吉玛公司合成。
(2)干扰效果验证
1)细胞转染
a)根据siRNA合成报告,加入适量DEPC水配制20μM贮存液;
b)接种Hela细胞于12孔板,密度以过夜培养后细胞汇合度达到50%-60%为宜;
c)用50μL Opti-MEM培养基稀释4μL Lipofectamine 3000转染试剂,充分混匀,室温静置5min;
d)用50μL Opti-MEM培养基稀释2μL siRNA,充分混匀,室温静置5min;
e)将上述步骤c)跟步骤d)的稀释液混合,充分混匀后室温静置15min。此时混合液中siRNA与Lipofectamine3000的比例为1:2;
f)将步骤e)转染混合液逐滴加入细胞培养孔,然后十字交叉法混匀;
g)细胞继续培养36h,以备后续实验。
2)干扰效果检测
①RNA抽提(使用北京全式金生物有限公司的RNA提取试剂盒 TransZol Up PlusRNAKit(Cat.No.:ER501-01),包括以下步骤:
a)转染siRNA 36h后,去除培养基,PBS洗涤一遍,加入1mL Trizol充分裂解细胞;
b)收集裂解液于1.5mL EP管中,加入200μL氯仿。颠倒混匀30s后室温静置3min,然后10000×g,4℃离心15min;
c)吸取400μL上清于新的离心管中,加入等体积的无水乙醇400μL,混匀后转移至离心柱中,室温12000×g,离心30s,弃出流出液;
d)加500μL CB9,室温12000×g,离心30s;
e)重复步骤d)一次;
f)加500μL WB9,室温12000×g,离心30s;
g)重复步骤f)一次;
h)室温12000×g,离心2min,彻底去除残留的乙醇;
i)室温干燥2min后加入30μL RNA-free Water在离心柱的中央,室温静置 1min;
j)室温12000×g,离心1min,洗脱RNA;
k)用Nanodrop测定RNA浓度和纯度。
(Cat.No.:AE311-02);
a)配制逆转录反应A液,体系如下表1所示:
表1
b)配制逆转录反应B液,体系如下表2所示:
表2
a)在无核酸酶的PCR反应管中PCR反应液,体系如下表1:
表1
b)在Bio-Rad CFX96实时荧光定量PCR仪上进行PCR扩增,条件如下: 94℃变性30s;循环39次,[94℃10s,60℃20s,72℃20s/荧光信号检测]×39循环,扩增结束后,进行50-95℃熔解曲线分析收集;
c)采用2-△△CT对PCR结果进行半定量分析。
本实施提供的AMPKα1和AMPKα2特异性siRNA的沉默效果验证分别如图4、图5所示。由图可见,siRNA可高效沉默Hela细胞中AMPKα1 (图4)和AMPKα2(图5)的表达,沉默效果最高可达75%以上。
(3)细胞处理
1)人宫颈癌细胞系Hela以2×105细胞/孔的密度接种12孔板中;
2)细胞随机分为siRNA对照组(siRNC组)、AMPKα1对照组(siRα1组), AMPKα2对照组(siRα2组),分别转染siRNA-NC、si-AMPKα1、si-AMPKα2 36-48h后,加蛋白酶体抑制剂组合物Bortezomib(PS-341),蛋白酶体抑制剂组合物Bortezomib的浓度为0.5-1μmol/L,再培养18-24h后,检测加蛋白酶体抑制剂组合物Bortezomib(PS-341)前后细胞死亡情况。
(4)流式细胞术分析细胞死亡情况
1)胰蛋白酶-EDTA消化细胞,终止消化,收集细胞悬液,将细胞悬液3200 rpm,4℃离心5min,弃掉上清,收集沉淀中的细胞;
2)用预冷的PBS洗涤细胞1次,然后用400μL PI染色液(0.05mg/mL) 重悬细胞;
3)4℃避光染色15min;
4)流式细胞仪检测凋亡情况:PI阳性的细胞为死亡细胞。统计死亡细胞数量,按照死亡细胞占细胞总数的百分比,计算细胞死亡率。
实施例提供的AMPK siRNA及蛋白酶体抑制剂硼替佐米Bortezomib (PS-341)作用于Hela细胞的细胞死亡率图如图6所示。图6显示,加入蛋白酶体抑制剂组合物Bortezomib前,siRNC组的细胞死亡率为13.7%,加入蛋白酶体抑制剂组合物Bortezomib后,siRNC组的细胞死亡率为30.7%;加入蛋白酶体抑制剂组合物Bortezomib前,siRα1组的细胞死亡率为26.4%,加入蛋白酶体抑制剂组合物Bortezomib后,siRα1组的细胞死亡率为56.9%;加入蛋白酶体抑制剂组合物Bortezomib前,siRα2组的细胞死亡率为29.3%,加入蛋白酶体抑制剂组合物Bortezomib后,siRα2组的细胞死亡率为53.7%。可见,蛋白酶体抑制剂硼替佐米Bortezomib(PS-341)显著促进siRNA干扰AMPK诱导的 Hela细胞死亡。
实施例3
AMPK抑制剂Dorsomorphin(Compound C)及其组合物蛋白酶体抑制剂硼替佐米Bortezomib(PS-341)对Hela裸鼠移植瘤生长的影响,包括以下步骤:
(1)细胞培养
常规方法复苏人宫颈癌细胞系Hela细胞,接种于含10%胎牛血清的高糖 DMEM培养基中,于37℃,5%CO2培养箱中培养。
(2)构建Hela细胞皮下移植瘤裸鼠模型
取对数生长期的Hela细胞,0.25%胰酶消化后制成单细胞悬液,调整细胞浓度为4×106/100μL,接种于Balb/c nude裸鼠右大腿背侧皮下,建立裸鼠移植瘤模型。隔日观察裸鼠移植瘤生长情况以及裸鼠的生存状况。
(3)人宫颈癌Hela细胞裸鼠移植瘤的实验性治疗
接种Hela细胞10天后选取移植瘤大小~200mm3小鼠,随机分为空白对照组(CT组)、Compound C组(C.C组)、Bortezomib组(PS-341组)和C.C 联合PS-341组(C.C+PS-341组),Compound C组给予腹腔注射10mg/kg的 AMPK抑制剂Compound C,Bortezomib组皮下注射0.5mg/kg Bortezomib(PS-341),C.C联合PS-341组分别给予腹腔注射10mg/kg的AMPK 抑制剂Compound C以及皮下注射0.5mg/kg Bortezomib(PS-341),空白对照组按同样的方案注射无菌PBS,每三天一次。观察小鼠体重以及移植瘤生长情况,按公式计算瘤的体积(V=(length x width^2)/2)。待移植瘤体积大于2000mm3或者肿瘤长边超过2cm处死小鼠,并绘制生存曲线。Hela移植瘤生长曲线图如图7所示(横坐标表示治疗天数,纵坐标表示肿瘤体积),Hela移植瘤小鼠体重变化曲线图如图8所示(横坐标表示治疗天数,纵坐标表示小鼠体重), Hela移植瘤小鼠的生存时间曲线图如图9所示(横坐标表示治疗天数,纵坐标表示生存率)。由图可见:Compound C联合PS-341对荷瘤小鼠体重没有明显影响;但Compound C联合PS-341显著抑制Hela移植瘤生长,并可显著延长移植瘤小鼠的生存期。即,AMPK抑制剂Dorsomorphin(Compound C)联合蛋白酶体抑制剂硼替佐米Bortezomib(PS-341)能显著抑制小鼠移植瘤的生长,并且延长小鼠的生存期。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 深圳先进技术研究院
<120> 靶向AMPK的抑制剂/siRNA与蛋白酶体抑制剂组合在抗肿瘤中的应用
<130> 20191121
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ggauuauugu cacaggcaud tdt 23
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
augccuguga caauaauccd tdt 23
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ccacucuccu gaugcauaud tdt 23
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
auaugcauca ggagaguggd tdt 23
Claims (15)
1.靶向AMPK的抑制剂和/或siRNA与蛋白酶体抑制剂组合在制备抗肿瘤药物中的应用。
2.如权利要求1所述的应用,其特征在于,所述靶向AMPK的抑制剂为特异地结合并抑制AMPK三聚体的小分子药物、特异地结合并抑制AMPK的小分子肽、特异地结合并抑制AMPK的反义化合物中的至少一种。
3.根据权利要求2所述的应用,其特征在于,所述小分子药物选自Dorsomorphin;或
所述小分子肽选自靶向AMPK的sRNA或sgRNA;或
所述反义化合物选自硫代磷酸寡核苷酸。
4.如权利要求1所述的应用,其特征在于,所述靶向AMPK的siRNA为靶向作用于AMPKα亚基的siRNA、靶向作用于AMPKβ亚基的siRNA、靶向作用于AMPKγ亚基的siRNA、靶向作用于AMPK亚基的病毒介导的shRNA中的至少一种;
所述蛋白酶体抑制剂选自蛋白酶体抑制剂Bortezomib、蛋白酶体抑制剂MG132、蛋白酶体抑制剂Carfilzomib、蛋白酶体抑制剂Ixazomib中的至少一种。
5.如权利要求1所述的应用,其特征在于,靶向AMPK的Dorsomorphin与蛋白酶体抑制剂Bortezomib联合作用在制备抗肿瘤药物中的应用。
6.如权利要求5所述的应用,其特征在于,靶向AMPK的Dorsomorphin与蛋白酶体抑制剂Bortezomib联合作用时,所述靶向AMPK的Dorsomorphin的药物浓度为10μmol/L~20μmol/L;所述蛋白酶体抑制剂Bortezomib的药物浓度为0.5μmol/L~1μmol/L。
7.如权利要求1所述的应用,其特征在于,靶向作用于AMPKα亚基的siRNA与蛋白酶体抑制剂Bortezomib联合作用在制备抗肿瘤药物中的应用。
8.如权利要求7所述的应用,其特征在于,所述靶向作用于AMPKα亚基的siRNA包括si-AMPKα1、si-AMPKα2中的至少一种,且所述si-AMPKα1和所述si-AMPKα2的碱基序列如下:
si-AMPKα1:
正义链:5’-GGAUUAUUGUCACAGGCAUdTdT-3’;
反义链:5’-AUGCCUGUGACAAUAAUCCdTdT-3’;
si-AMPKα2:
正义链:5’-CCACUCUCCUGAUGCAUAUdTdT-3’;
反义链:5’-AUAUGCAUCAGGAGAGUGGdTdT-3’。
9.如权利要求8所述的应用,其特征在于,所述si-AMPKα1和所述si-AMPKα2的碱基序列的3’端添加有两个呈单链悬挂结构的脱氧核糖核苷酸。
10.如权利要求1至9任一项所述的应用,其特征在于,所述蛋白酶体抑制剂替换为分子伴侣蛋白HSP90的抑制剂和/或siRNA,或所述蛋白酶体抑制剂替换为分子伴侣蛋白HSP70的抑制剂和/或siRNA。
11.一种用于治疗肿瘤的药物或试剂盒,其特征在于,包括靶向AMPK的抑制剂、靶向AMPK的siRNA中的至少一种以及蛋白酶体抑制剂。
12.如权利要求11所述的药物或试剂盒,其特征在于,所述药物或试剂盒的药物活性成分为靶向AMPK的Dorsomorphin与蛋白酶体抑制剂Bortezomib。
13.如权利要求12所述的药物或试剂盒,其特征在于,所述靶向AMPK的Dorsomorphin的药物浓度为10μmol/L~20μmol/L;所述蛋白酶体抑制剂Bortezomib的药物浓度为0.5μmol/L~1μmol/L。
14.如权利要求11所述的药物或试剂盒,其特征在于,所述药物或试剂盒的药物活性成分为靶向作用于AMPKα亚基的siRNA与蛋白酶体抑制剂Bortezomib。
15.如权利要求14所述的药物或试剂盒,其特征在于,所述靶向作用于AMPKα亚基的siRNA包括si-AMPKα1、si-AMPKα2中的至少一种,且所述si-AMPKα1和所述si-AMPKα2的碱基序列如下:
si-AMPKα1:
正义链:5’-GGAUUAUUGUCACAGGCAUdTdT-3’;
反义链:5’-AUGCCUGUGACAAUAAUCCdTdT-3’;
si-AMPKα2:
正义链:5’-CCACUCUCCUGAUGCAUAUdTdT-3’;
反义链:5’-AUAUGCAUCAGGAGAGUGGdTdT-3’。
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PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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GR01 | Patent grant | ||
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