CN110846240A - 具有杀螺效果的放射菌菌株及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属医药卫生微生物领域，涉及从钉螺自然消亡洲滩土壤中分离培养得到的具有明显杀螺效果的放射菌菌株，该放射菌菌株的保藏编号：CGMCC No.15570，分类命名：陕西链霉菌FQ13。该菌株在固体培养基形成质地紧密、颗粒状的白色小菌落；该菌株0d～4d较快生长，5d～6d迅速生长，7d～11d处于平台期。该放线菌菌液在0.5％和1％浓度下浸泡钉螺72h后，钉螺的死亡率分别达到50％和65％，明显高于去氯清水对照组在相同时间点的死亡率。本发明将为新型生物灭螺制剂的研发提供一株具有良好应用前景的菌株，将极大地促进我国血吸虫病消除的进程。

Description

具有杀螺效果的放射菌菌株及其应用
技术领域
本发明属于医药卫生微生物领域，具体涉及一株具有杀螺效果的放射菌菌株(陕西链霉菌，Streptomyces shaanxiensis)及其应用。
背景技术
资料记载了血吸虫病是严重危害人类健康的人畜共患性疾病[1]，是由血吸虫寄生于人体内而引起，通常伴随着发热、疼痛和肝脏扩大等症状，病情严重者则导致死亡[2]。流行病学调查显示，该血吸虫病主要流行于亚、非、拉美的78个国家或地区，每年超过2亿血吸虫病患者需要接受治疗[3]。研究公开了对人类造成危害的血吸虫主要有5类：曼氏血吸虫(Schistosoma mansoni)，埃及血吸虫(S.Haematobium)，日本血吸虫(S.japonicum)，间插血吸虫(S.intercalatum)和湄公血吸虫(S.mekongi)，其中在我国流行的是日本血吸虫。研究显示，钉螺(Oncomelania hupensis)是日本血吸虫的唯一中间宿主，在血吸虫病的流行中起着极其重要的作用，因此消灭钉螺是控制血吸虫病流行的关键。我国是血吸虫病的大国，早在50年代，中国就提出要消灭血吸虫病[4]，虽然我国血吸虫病的控制已取得显著成效，但仍没有达到消灭血吸虫病的目标[5]，然而，随着水利工程的兴建，气候变化以及居民防病意识的下降，新的钉螺孳生地不断经出现，螺情和疫情都出现回升的趋势[6]，有关业内专家分析预测我国血吸虫病很有可能卷土重来。此外，有研究表明，在人群血吸虫病感染率较高的时候，采用吡喹酮治疗是一个非常有效的手段，但该药只能将血吸虫病控制在一定的水平，不能控制重复感染[7]。当血吸虫病感染率较低时，钉螺的控制措施非常重要，它不仅预防感染复发，还能提高人群药物治疗的效果[8]。因此，防治钉螺是消除血吸虫病的重要环节。氯硝柳胺作为WHO推荐的唯一灭螺药物，具有很高的灭螺效率，但对淡水鱼类和两栖动物类具有一定的毒性[9]，因此，本领域研究人员关注并探寻新的灭螺方式。微生物灭螺是近年来兴起的一种灭螺方式，因其高效、安全、适合大批量生产和基因改造等优点越来越受到科研工作者的关注，使微生物灭螺研究具有光明的前景[10，11]。
微生物灭螺主要指培养和投放微生物，其菌体本身或其代谢产物对钉螺产生毒害作用[12]，这些微生物主要是从钉螺体内或者其孳生地的土壤、水体和植物中分离。根据微生物种类的不同，将具有杀螺效果的微生物分为细菌类灭螺微生物、真菌类灭螺微生物和放线菌类灭螺微生物。目前，细菌类灭螺微生物主要有[13]：凸型假单胞菌、蜡样芽孢杆菌B59；真菌类主要有：木霉属真菌、毛霉属真菌、曲霉菌JJ18、烟曲霉SL-30、内生真菌LL3026。放线菌类主要有：紫红链霉菌、自养黄色杆菌、浅灰链霉菌230、灰色直丝链霉菌(链霉菌132)、淀粉酶产色链霉菌(链霉菌218)、土味链霉菌339。尽管从50年代起，有研究者[14]就开始寻找杀灭钉螺的微生物，也培养分离了一些具有杀螺作用的微生物菌株，但到目前为止，几乎还没有一种微生物能推广到实际应用。
洞庭湖洲滩是我国最大的钉螺孳生地。东洞庭湖西北角的钱粮湖洲滩，临湖大堤长约16.5km，洲滩总面积有433.2km2，历史上钉螺密集，而在1999年钉螺的数量突然急剧下降，只发现了一只活螺。自2000年以来，一直未查到钉螺[14]。本申请的发明人对钱粮湖洲滩钉螺自然消亡原因进行了一系列的研究，未发现钉螺自然消亡与环境因素的变化(如植被、水位、污染等)有关。土壤是钉螺生存的必备条件，土壤中含有丰富的微生物。一些自然环境中存在的微生物已被证明具有很好的杀螺效果，因此本研究退队在钱粮湖钉螺自然消亡洲滩，分离培养土壤中的放射菌，以期发现强力的杀螺放射菌，结果从钉螺自然消亡洲滩土壤中培养分离并纯化了一株具有杀螺效果的放射菌菌株。在环保问题日益受重视，血防工作进入攻坚阶段的情况下，进一步加强微生物灭螺方法的研究和探索，具有重要的科学和现实意义。
于本发明相关的现有技术有如下参考文献，
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发明内容
本发明的目的是提供一种具有杀钉螺效果的放射菌菌株(陕西链霉菌，FQ13)。本发明的进一步目的是开发一种新型的灭螺生物制剂，为血吸虫病防控提供服务。
本发明从钉螺自然消亡洲滩土壤中分离培养得到的具有明显杀螺效果的放射菌菌株，该真菌菌株已于2018年4月8日保藏，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，100101，保藏编号：CGMCC No.15570，分类命名：陕西皮链霉菌(Streptomyces shaanxiensis)。
本真菌菌株具有以下生物学特性：
1、该菌株在固体培养基形成质地紧密、颗粒状的白色小菌落。
2、该菌株的菌液浓度最适宜测量的波长为230nm。
3、该菌株0d～4d较快生长，5d～6d迅速生长，7d～11d处于平台期。
4、杀螺效果：该放射菌菌株在0.5％和1％浓度下浸泡钉螺72h后，钉螺的死亡率分别达到50％和65％。
本发明的具有杀钉螺效果的放射菌菌株(陕西链霉菌，FQ13)可用于制备新型的灭螺生物制剂。
本发明的目地通过下述技术方案施现，
本发明从钉螺自然消亡洲滩中采集土壤样品，每份土壤样本取5g，加入盛有45ml无菌水的100ml烧瓶中，摇床振荡30min混匀，制备成悬液；取1ml土壤悬液，用梯度稀释法稀释至适当浓度，涂布高氏一号平板上，不断进行划线分离纯化，直至长出单一菌株，移至高氏一号固体斜面培养基，4℃冰箱中保存备用；
用无菌接种环将上述保存在斜面培养基上的放线菌接种到试管中，试管中装有高氏一号液体培养基，28℃振荡器培养，待有菌体长出，吸取1ml菌液，用于提取放线菌DNA；得到的DNA用TE Buffer溶解，放入-20℃冰箱保存；
选择放线菌的16srDNA引物27F和1492R，采用聚合酶链式反应(PCR)方法对上述保存的DNA进行扩增，扩增成功的PCR产物交由测序公司进行纯化和测序；
通过与NCBI数据库中已知序列比对分析，并结合放射菌的形态特征，确定从土壤中所分离纯化的放射菌种类；
配置高氏一号液体培养基，将上述保存的放射菌株接种于装有高氏一号液体培养基的瓶内，放入摇床培养箱中，28℃，121r/min中培养8天。分别取1ml，5ml和10ml的放线菌发酵液于1000ml烧杯中，加入去氯水，配置成0.1％，0.5％和1％的杀螺液体。设立去氯清水为对照组；将3袋阴性钉螺作为一组(20只/袋)，在室温下(25±1)℃于各溶液中浸泡。浸泡24h、48h和72h后每组各取出一袋钉螺，用水逸法和敲击法判别钉螺死活，记录死亡数和死亡率。每组实验重复2次；
结果显示，FQ13菌株在0.5％和1％浓度下浸泡钉螺72h后，钉螺的死亡率分别达到50.0％和65.5％，菌液在0.5％和1％浓度下其灭螺效果都明显高于去氯清水对照组。
本发明从钉螺自然消亡洲滩土壤中分离培养得到的具有明显杀螺效果的放射菌菌株一陕西皮链霉菌。该菌株在固体培养基形成质地紧密、颗粒状的白色小菌落；该菌株0d～4d较快生长，5d～6d迅速生长，7d～11d处于平台期。该放线菌菌液在0.5％和1％浓度下浸泡钉螺72h后，钉螺的死亡率分别达到50％和65％，明显高于去氯清水对照组在相同时间点的死亡率。本发明为新型生物灭螺制剂的研发提供一株具有良好应用前景的菌株，将极大地促进我国血吸虫病消除的进程。
附图表说明
图1 FQ13放线菌菌株的形态显微镜图，为1000×。
具体实施方式
实施例1
65)土样的采集：
本发明的土壤采集现场为钉螺自然消亡的无螺洲滩。该洲滩具有“冬陆夏水”的特点，每年平均水淹天数2.5～5个月，枯水期苔草、虉草茂盛；
在研究现场进行200m×200m机械布点，分别设置5×5个采样点。用无菌采样器取表层2～10cm土壤样品，装入无菌采样管中尽快送回实验室。现场共采样25份；
2)放线菌的分离纯化：
每份土壤样本取5g，加入盛有45ml无菌水的100ml烧瓶中，摇床振荡30min混匀，制备成悬液。取1ml土壤悬液，用梯度稀释法稀释至适当浓度，涂布高氏一号平板上，不断进行划线分离纯化，直至长出单一菌株，移至高氏一号固体斜面培养基，4℃冰箱中保存备用；
3)放线菌的形态学观察：
菌落形态观察：挑取保藏于斜面培养基的放线菌菌株，移种至高氏一号琼脂平板中，28℃倒置培养，定期观察菌落的形态变化，做好记录和图片数据的采集；
光学显微镜形态观察：使用平板插片法，将盖玻片以30～45°插入高氏一号合成琼脂培养基中，插入深度约为1/4，用接种环将菌种接种在盖玻片和琼脂相连部，放入温箱中，28℃恒温培养。待盖玻片内侧长有菌丝体，用灭菌镊子取出，至载玻片上，移至显微镜下观察其菌丝、孢子梗、孢子等结构，并拍照记录；
4)分子生物学鉴定：
放线菌DNA提取：用无菌接种环将斜面培养基的放线菌接种到试管中，试管中装有高氏一号液体培养基，28℃振荡器培养，待有菌体长出，吸取1ml菌液，放入1.5ml离心管中离心1min，弃上清，收集菌体，提取放线菌DNA，得到的DNA用TE Buffer溶解，放入-20℃冰箱保存；
放线菌16srDNA的PCR扩增：选择放线菌的16srDNA引物27F和1492R，采用聚合酶链式反应(PCR)方法扩增，
放线菌16srDNA特异引物：
正向引物27F：5’-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3’
反向引物1492R：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’
反应参数设置如下：
表1 16srDNA的PCR反应体系
Figure BSA0000168132600000071
PCR反应条件：94℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，总共30个循环；最后72℃延伸10min，产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测合格后，送铂尚生物技术有限公司进行测序；
通过与NCBI数据库中已知序列比对分析，并结合放线菌的形态特征，最终确定从钉螺自然消亡洲滩分离出2属20种放线菌，本发明从钉螺自然消亡洲滩土壤中分离得到具有杀螺效果的陕西链霉菌FQ13；
5)灭螺实验
实验用的钉螺：钉螺取自湖南省岳阳市有螺洲滩，将野外采集适量数目的钉螺置于锥形瓶中，加去氯水(日光下曝晒3天以上的自来水)至瓶口，保持室温在20～25℃间，静置4h后，取1环上层液体滴在玻璃板上，放在解剖镜下观察有无血吸虫尾蚴，2h后再重复观察一次，若有尾蚴逸出，则说明放入该锥形瓶的钉螺中有螺是阳性螺，需要对这些钉螺进行一一鉴别，若无尾蚴逸出，则该锥形瓶中的钉螺全部为阴性螺，阴性活力强钉螺用于本杀螺实验，阳性螺做高压杀灭处理；
配置高氏一号液体培养基，取50ml培养液装入250ml锥形瓶中，在高压灭菌锅中121℃灭菌20min，待培养液冷却至室温，接种放线菌于瓶内，放入摇床培养箱中，28℃，121r/min中培养8天；分别取1ml，5ml和10ml的放线菌发酵液于1000ml烧杯中，加入去氯水，配置成0.1％，0.5％和1％的杀螺液体。设立去氯清水为对照组；
挑选螺龄相当(7～8旋)、活力强的阴性钉螺，装入尼龙网袋，将3袋钉螺作为一组(20只/袋)，在室温下(25±1)℃于各溶液中浸泡，并且防止钉螺露出水面；浸泡24h、48h和72h后每组各取出一袋钉螺，用去氯水进行洗涤，然后放入平皿中复苏两天，用水逸法和敲击法判别钉螺死活，记录死亡数和死亡率；每组实验重复2次；表2为FQ13放线菌菌株在不同浓度和不同时间的杀螺效果。
表2不同浓度下不同时间点钉螺的死亡率
Figure BSA0000168132600000081

Claims (5)

1.一种具有杀螺效果的放射菌菌株，其特征在于，所述放射菌菌株为具有杀灭血吸虫中间宿主钉螺的菌株FQ13，保藏编号：CGMCC No.15570，分类命名：陕西链霉菌FQ13，Streptomyces shaanxiensis。
2.按权利要求1所述的具有杀螺效果的放射菌菌株，其特征在于，所述的放线菌菌株具有以下生物学特征：该菌株在固体培养基形成质地紧密、颗粒状的白色小菌落；该菌株的菌液浓度最适宜测量的波长为230nm；该菌株0天～4天较快生长，5天～6天迅速生长，7天～11天处于平台期。
3.按权利要求1所述的具有杀螺效果的放射菌菌株，其特征在于，该放射菌菌株从钉螺自然消亡洲滩土壤中分离培养获得。
4.权利要求1所述的具有杀螺效果的放射菌菌株在制备用于灭螺生物制剂中的用途。
5.按权利要求4所述的用途，其特征在于，所述的放线菌菌株具有明显的杀螺效果，该放线菌菌液在0.5％和1％浓度下浸泡钉螺72h后，钉螺的死亡率分别达到50％和65％，明显高于去氯清水对照组在相同时间点的死亡率。
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