CN111500494A - 一株具有高酶活的蒂莫内马赛菌及其筛选方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及微生物生物技术领域，具体涉及一株具有高酶活的蒂莫内马赛菌及其筛选方法和应用，所述的蒂莫内马赛菌(Massiliatimonae)BMMSJS‑1，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No.18668。本发明所述的蒂莫内马赛菌BMMSJS‑1具有不固氮，不解磷，对病源真菌没有直接的拮抗作用，可以分泌大量的几丁质酶、纤维素酶、木质素酶，能够有效的增强粉红粘帚霉菌的拮抗能力，具有促进粉红粘帚霉菌生长的作用。

Description

一株具有高酶活的蒂莫内马赛菌及其筛选方法和应用

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一株具有高酶活的蒂莫内马赛菌及其筛选方法和应用。

背景技术

马赛菌属(Massiliaspp)属于变形菌门，β变形菌纲，伯克霍尔德氏菌目，草酸杆菌科。其典型特征为革兰氏染色反应阴性、细胞杆状、不产芽孢、好氧、能运动。马赛属细菌分布广泛，存在于冰、水、土壤、岩石表层、空气和植物体内，该属成员表现出多种生理活性，例如：恶臭马赛菌(M.putida 6NM-7T)能够产生二甲基二硫醚，在防治土传病害和土壤熏蒸剂开发等方面具有应用潜力；Massiliasp.WG5能够降解菲等多环芳烃类物质，在污染土壤的修复方面具有应用潜力；M.chloroacetimidivoransTA-C7e T能够降解氯乙酰胺，可用于酰胺类除草剂的降解；M.phosphatilytica 12-OD1具有溶磷作用，能够促进植物生长；M.timonae U2能够产生甲壳素酶，M.eurypsychrophila能够产生甘露聚糖酶、淀粉酶、纤维素酶等多糖水解酶。发明专利一株蒂莫内马赛菌新菌株及其用途(CN201610833050.7)公开了一株新菌株-蒂莫内马赛菌J42，以及该菌株作为石油降解菌在降解石油废水中的应用；该菌株不仅具有良好的产生物表面活性剂能力，而且该菌株具有较强的乳化活性和降低液体表面张力能力；另外，J42 菌甲苯降解实验表明该菌株具有极强的降解芳香烃甲苯的能力；该菌株在降解石油废水实验中还表现出了较强的COD去除效率，但是该菌株是应用于石油污染生物修复领域。发明专利一株防治植物线虫的菌株及其应用(CN201810240235.6)提供了一株马赛菌(Massilia sp.) Y149，于2017年11月27日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO:M 2017745，还提供了含有该菌株Y149的微生物菌剂及其制备方法，并将上述菌株Y149或微生物菌剂应用于制备防治植物线虫的产品中。本发明的菌株Y149或微生物菌剂对植物线虫具有很好的防治效果，且成本低，对环境友好。但是，目前并没有公开能够促进粉红粘帚霉生长的蒂莫内马赛菌。

粉红粘帚霉(Clonostachysrosea)是一种分布广泛的重寄生菌，具有生长快、产孢量大、寄主范围广、寄生能力强、拮抗机制多样等优点。其拮抗机制主要包括重寄生作用、抗生作用、竞争作用、诱导植物抗性等。其在生长周期内可以产生3种繁殖体，包括菌丝体、分生孢子和厚垣孢子，是目前已发现的拮抗微生物中最具潜力的植物病害生防菌之一。发明专利一株桃儿七的内生真菌及其应用(CN201910282640.9)公开了一株桃儿七内生真菌，粉红粘帚霉菌fhnzm，保藏号CGMCC No.17070，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心。该菌株能够提高桃儿七根中鬼臼毒素的含量，抑制桃儿七根的生长，抑制植物种子的萌发和胚根的伸长，能够作为核心菌株来生产用于促进桃儿七鬼臼毒素积累的菌剂，对于绿色防治桃儿七病虫害和提高人工栽培桃儿七的品质，有效提高桃儿七鬼臼毒素的积累具有重大意义。同时，现有技术分离出来的粉红粘帚霉菌均以单一菌株形式出现，且真菌和细菌存在普遍的跨界拮抗作用，因此，目前并没有针对粉红粘帚霉共生体系细菌的研究，本发明意外的得到了一种粉红粘帚霉菌的共生细菌蒂莫内马赛菌BMMSJS-1，不固氮，具有很高的酶活，且对于粉红粘帚霉菌具有促生作用。

发明内容

本发明的目的是提供一株具有高酶活的蒂莫内马赛菌(Massilia timonae)BMMSJS-1，所述的菌株于2019年10月11日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为 CGMCC No.18668，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，存活状态为存活，电话： 010-64807355，传真：010-64807288。

所述的蒂莫内马赛菌BMMSJS-1在发酵生产几丁质酶中的应用。

所述的蒂莫内马赛菌BMMSJS-1在发酵生产木质素酶中的应用。

所述的蒂莫内马赛菌BMMSJS-1在发酵生产纤维素酶中的应用。

所述的蒂莫内马赛菌BMMSJS-1的筛选方法，所述的方法包括如下步骤：

(1)将采挖的贝母流水冲洗10min，吸干表面水分，75％的乙醇浸泡30sec，无菌水冲洗2-3遍，用0.2％的升汞表面消毒10min,，再次无菌水冲洗2-3遍，吸干表面水分；；

(2)用灭菌刀将步骤(1)所得的贝母外植体切为小段，放置于200℃高温干热灭菌处理过的研钵中，加入生理盐水，充分研磨；

(3)稀释研磨后的原液；将其涂布于固体虎红平板，黑暗培养至长出不同的真菌；

(4)分别从不同菌落的边上挑取菌丝，在固体PDA平板上划线纯化，挑取其中一株真菌菌落中的细菌，在固体TSA平板划线纯化后即得。

用固体虎红平板分离真菌，固体PDA平板纯化真菌，挑取PDA平板中的细菌，用固体TSA平板纯化。

优选地，所述的步骤(2)中的小段为0.5cm，所述的生理盐水经过灭菌。

所述的蒂莫内马赛菌BMMSJS-1在促进粉红粘帚霉菌生长中的应用。

所述的蒂莫内马赛菌BMMSJS-1在促进粉红粘帚霉菌对病原菌产生拮抗作用中的应用。

优选地，所述的病原菌为镰刀菌属病原菌。

本发明的有益效果是：本发明从甘肃贝母中分离到了一株具有高酶活的蒂莫内马赛菌 BMMSJS-1，所述的蒂莫内马赛菌BMMSJS-1不固氮，不解磷，对病源真菌没有直接的拮抗作用，但具有很高的几丁质酶活性、木质素酶活性和纤维素酶活性，且研究结果显示，所述的蒂莫内马赛菌BMMSJS-1与真菌粉红粘帚霉菌fhnzm存在互生关系，蒂莫内马赛菌BMMSJS-1的存在促进粉红粘帚霉菌fhnzm的生长，液体培养时粉红粘帚霉菌fhnzm生物量更大，固体平板培养时，粉红粘帚霉菌菌丝更加浓密；能够有效的增强粉红粘帚霉菌拮抗能力，帮助粉红粘帚霉更好侵入植物形成内生菌，占据相应生态位，在竞争中更具优势。

附图说明

图1 PDA固体平板上生长的粉红粘帚霉fhnzm和蒂莫内马赛菌BMMSJS-1

图2 蒂莫内马赛菌BMMSJS-1系统进化树

图3 不同菌种几丁质酶活性(大写字母表示极显著水平下的多重比较)

图4 不同菌种纤维素酶活性(大写字母表示极显著水平下的多重比较)

图5 不同菌种木质素酶活性(大写字母表示极显著水平下的多重比较)

图6 粉红粘帚霉菌fhnzm的固氮作用

图7 粉红粘帚霉菌fhnzm与腐皮镰刀菌平板对峙

图8 粉红粘帚霉菌fhnzm和蒂莫内马赛菌BMMSJS-1与腐皮镰刀菌对峙

图9 蒂莫内马赛菌BMMSJS-1滤液促进粉红粘帚霉菌fhnzm生长作用

图10 不同处理粉红粘帚霉菌fhnzm干重柱状图(大写字母表示极显著水平下的多重比较)

具体实施方式

下面的实施例可以进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制，在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

以下实验所使用的甘肃贝母采自榆中县(海拔2800米)，桃儿七采自榆中县(海拔2500 米)。试验中用到的试剂、培养基均为化学纯。几丁质酶、纤维素酶、木质素酶及蛋白质含量测定试剂盒够自苏州科铭生物技术有限公司。

培养基成分及名词解释：

虎红固体培养基：蛋白胨5g/L、葡萄糖10g/L、磷酸二氢钾1g/L、硫酸镁0.5g/L、琼脂15g/L、孟加拉红0.03g/L、氯霉素0.1g/L；最终pH 7.2±0.2。

阿须贝培养基：磷酸二氢钾0.2g/L、硫酸镁0.2g/L、氯化钠0.2g/L、碳酸钙5.0g/L、甘露醇10.0g/L、硫酸钙0.1g/L、琼脂15.0g/L、pH值7.0。

液体PDA培养基：马铃薯200克、葡萄糖20克、琼脂15～20克、蒸馏水1000毫升、自然pH。

液体LB培养基：胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠10g/L、另外根据经验值用 NaOH调节该培养基的pH，使其达到7.4。

改良马丁液体培养基：蛋白胨5g/L、磷酸氢二钾1g/L、硫酸镁0.5g/L、酵母浸出粉2g/L、葡萄糖20g/L、pH值6.4±0.2。

TSA固体培养基：胰酪蛋白胨15g/L、大豆蛋白胨5.0g/L、NaCl5.0g/L、琼脂粉15g/L、 pH 7.3±0.2。

SDS：又称十二烷基苯磺酸钠，是一种阴离子去垢剂，在高温条件下能裂解细胞，使染色体离析、蛋白变性，同时SDS与蛋白质和多糖结合成复合物，释放出核酸；通过提高盐浓度并降低温度，使SDS-蛋白质复合物的溶解度变得更小，从而使蛋白质及多糖杂质沉淀更加完全，离心后除去沉淀；上清液中的DNA用酚/氯仿抽提，反复抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA。

PGPR菌：根际促生菌，泛指能够直接或间接促进植物生长、增加作物产量、防治病虫害的根际微生物。

实施例1菌株分离

将采挖的健康甘肃贝母用流水冲洗10min，用滤纸吸干表面水分，75％的乙醇浸泡30s，之后用无菌水冲洗2～3遍，再用0.2％的升汞表面消毒10min，再用无菌水冲洗2～3遍，以最后冲洗的无菌水100μl涂布于虎红固体培养基作为对照。

将表面消毒处理的贝母1g放置于200℃高温干热灭菌处理过的研钵中，加入10ml灭过菌的生理盐水，充分研磨。

研磨后的原液质量分数为10^-1，依次吸取1mL加入到灭过菌的9ml生理盐水中，稀释为质量分数10^-2、10^-3、10^-4的溶液。分别吸取上述液体100μl，每个浓度梯度重复3次，涂布于固体虎红平板，28℃，黑暗培养，大约10天左右，长出不同的真菌。

分别从不同菌落的边上小心挑取菌丝，在固体PDA平板上划线纯化3～5次，纯化后发现一株真菌细菌总是相伴而生，如图1所示，进而小心的挑取混合物中的真菌和细菌分别在固体虎红平板和固体TSA平板划线，重复3～5次后划纯，将纯化后的菌株接与相应斜面，即得纯化后的真菌和细菌，4℃低温保藏。

实施例2菌株鉴定

实施例1中纯化得到的真菌经鉴定为粉红粘帚霉菌，命名为粉红粘帚霉菌(Clonostachysrosea)fhnzm，其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.17070。

实施例1中纯化得到的细菌接种到液体LB培养基中，28℃，200rpm，培养2天，4℃，5000rpm离心收集菌体，组织破碎仪充分破碎后，用SDS法提取基因组DNA，电泳检测合格后用于PCR扩增。

扩增引物为：

27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'

1492R：5'-TACCTTGTTACGACTT-3'

PCR反应体系为50μl：

Buffer(Mg²⁺plus)10μl，正反引物各2μl，dNTP Mixture(各2.5mM)4μl，

HS DNA Polymerase(2.5U/μl)0.5μl，DNA 模板1μl，ddH₂O 31.5μl。

PCR扩增条件:98℃变性10sec；56℃退火15sec，72℃延伸1min 30sec，30个循环，72℃延伸5min。

将扩增产物送北京擎科新业生物技术有限公司测序。测序结果在NCBI数据库blast比对， MEGA7软件构建进化树。

分离纯化得到的细菌经PCR所测16s序列长度870bp，16sRNA序列如SEQ ID No.1所示。测序结果在NCBI数据库blast比对，结果显示，纯化后的细菌与蒂莫内马赛菌菌株BMYN192同源性96.67％，鉴定到马赛菌属，命名为BMMSJS-116。于2019年10月11日保藏于中国普通微生物菌种保藏中心，编号为CGMCC No.18668。

以不同功能的马赛菌属菌种为内群，构建蒂莫内马赛菌(Massilia timonae)BMMSJS-1 系统进化树，结果如图2所示。从图1中可以看出，虽然所述的蒂莫内马赛菌与蒂莫内马赛菌菌株BMYN192聚为一枝，但存在一定的遗传距离。具有防治土传病害作用的M.putida 6NM-7和具有解磷改善土壤环境作用的M.phosphatilytica 12-OD1 T亲缘关系较近，具有产生甘露聚糖酶、淀粉酶、纤维素酶等多糖水解酶的菌株M.eurypsychrophila与上述菌株存在一定的亲缘关系，具有降解酰胺类除草剂的菌株M.chloroacetimidivoransTA-C7e与上述菌株聚为一大类。

实施例3蒂莫内马赛菌BMMSJS-1酶活检测

(1)实验分组

实验组：蒂莫内马赛菌BMMSJS-1

对照组1：本实验室技术人员从健康的贝母根际土壤中分离解淀粉芽孢杆菌；本实施例所述的解淀粉芽孢杆菌属于常规菌株，本领域技术人员也可以从菌株保藏机构获得或从试剂公司购买获得；

对照组2：本实验室技术人员从健康的贝母根际土壤中分离荧光假单胞菌；本实施例所述的荧光假单胞菌属于常规菌株，本领域技术人员也可以从菌株保藏机构获得或从试剂公司购买获得；

对照组3：本实验室技术人员从健康的当归内生菌中分离寡养单胞菌；本实施例所述的寡养单胞菌属于常规菌株，本领域技术人员也可以从菌株保藏机构获得或从试剂公司购买获得注：解淀粉芽孢杆菌和荧光假单胞菌为具有促生和生防作用的PGPR菌，寡养单胞菌为非 PGPR菌。

(2)实验方法

按照几丁质酶试剂盒(JDZM-2-G)、纤维素酶试剂盒(CL-2-Y)、木质素酶试剂盒(LIP-1-G) 所述方法检测几丁质酶，纤维素酶，木质素酶活性；分光光度法检测上述菌液的浊度OD₆₀₀，通过计算单位浊度菌液的酶活进行标准化处理，试验设3次重复，酶活数据使用SPASS 22 软件进行统计分析，使用ORIGIN 9软件进行微生物聚类分析。

(3)实验结果

图3-5分别为不同菌株的几丁质酶、纤维素酶、木质素酶酶活的柱状图，由图可见，蒂莫内马赛菌BMMSJS-1的酶活从高到低依次为几丁质酶活性，木质素酶活性，纤维素酶活性；蒂莫内马赛菌BMMSJS-1的酶活除了纤维素酶活性略低于荧光假单胞菌外，其他两种酶活显著高于荧光假单胞菌，而解淀粉芽孢杆菌和寡养单胞菌的3种酶活水平显著低于蒂莫内马赛菌BMMSJS-1。

实施例4蒂莫内马赛菌BMMSJS-1与粉红粘帚霉菌fhnzm的固氮活性研究

(1)实验分组

实验组：分为蒂莫内马赛菌BMMSJS-1组和粉红粘帚霉菌fhnzm组；

(2)实验方法

配制阿须贝培养基，加入0.5％的刚果红5ml/L，灭菌后制成平板备用，从菌落边缘分别挑取少量蒂莫内马赛菌BMMSJS-1和粉红粘帚霉菌fhnzm菌体接种于上述阿须贝培养基中， 28℃，黑暗培养5天，观察菌落生长情况。

注：刚果红为棕红色粉末，溶于水呈黄红色，溶于醇呈橙色，用于作为酸碱指示剂，变色范围为3.5到5.2，碱态为红色，酸态为蓝紫色。

若菌株固氮，则菌株在无氮阿须贝培养基上菌落清晰可见，并且形成红色的圈，且圈的大小和颜色的深浅可以一定程度上反映固氮能力的强弱。

(3)实验结果

如图6所示，粉红粘帚霉菌fhnzm在无氮阿须贝培养基上菌落清晰可见，并且形成红色的圈，从图中可以看出粉红粘帚霉菌fhnzm固氮能力强；而蒂莫内马赛菌BMMSJS-1并没有在阿须贝培养基上生长，说明其没有固氮活性。

实施例5蒂莫内马赛菌BMMSJS-1和粉红粘帚霉菌fhnzm平板拮抗试验

从具有腐烂病的甘肃贝母中分离病原菌并纯化，选取其中一株病原菌腐皮镰刀菌进行平板拮抗试验。

(1)实验分组

对照组：粉红粘帚霉菌fhnzm

实验组：粉红粘帚霉菌fhnzm与蒂莫内马赛菌BMMSJS-1的复合菌剂

(2)实验过程

分别将病原菌接于PDA固体平板中央，对照组菌剂和实验组菌剂接于病原菌四周相聚 2cm处，28℃培养5～7天，观察菌落生长和抑菌圈状况并计算拮抗指数。

拮抗指数＝(抑菌圈半径-拮抗菌半径)/拮抗菌半径

抑菌圈半径＝拮抗菌菌落中心至病原菌菌丝边缘的距离

(3)实验结果

对照组菌剂的平板拮抗结果如图7所示，可以看出，菌落浓密；而实验组菌剂的平板拮抗结果如图8所示，从图中可以看出，实验组菌剂的菌落更加浓密，菌落均呈圆形至椭圆形，与病原菌的接触面呈凸出月牙形，抑菌作用明显。

按照上述公式计算拮抗指数，对照组菌剂对腐皮镰刀菌的拮抗指数是(85±5.3)％，实验组菌剂对腐皮镰刀菌的拮抗指数是(103±7.4)％。由此可见，实验组菌剂对腐皮镰刀菌具有更强的拮抗作用。

实施例6蒂莫内马赛菌BMMSJS-1对粉红粘帚霉菌fhnzm的生长促进作用

(1)将粉红粘帚霉菌fhnzm接种于液体PDA培养基中，30℃、180rpm振荡培养5天，超声波破碎(冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次)，8000rpm 4℃离心10min，取上清，血球计数板孢子计数。

(2)将蒂莫内马赛菌BMMSJS-1接种于液体LB培养基中，30℃、180rpm震荡培养2天，8000rpm 4℃离心10min，取上清液经0.22μm滤膜过滤待用。

(3)分别将粉红粘帚霉菌fhnzm孢子液和蒂莫内马赛菌BMMSJS-1滤液按下表所述体积添加到马丁液体培养基中(见表1)，每处理重复3次，30℃、180rpm震荡培养5天，观察菌球生长情况，8000rpm 4℃离心10min，收集菌球，烘干称重，SPASS 22软件统计分析。

粉红粘帚霉菌fhnzm孢子数达到了10⁸/ml以上，孢子分散均匀，可以认为相同体积的孢子液含有相同数量的孢子。

表1粉红粘帚霉孢子液和马赛菌滤液的添加比例表

实验结果如图9所示，随着蒂莫内马赛菌BMMSJS-1滤液体积的增加，粉红粘帚霉菌fhnzm菌球数量明显增加。

称量粉红粘帚霉菌fhnzm的菌球干重，统计结果如图10所示，随着蒂莫内马赛菌BMMSJS-1接入量的增加，菌球干重也随之增加，处理2干重增长最多，且不同处理间差异极显著(P＜0.01)。综上所述，蒂莫内马赛菌BMMSJS-1对粉红粘帚霉菌fhnzm的生长具有明显的促进作用。

序列表

<110> 甘肃省科学院生物研究所

<120> 一株具有高酶活的蒂莫内马赛菌及其筛选方法和应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 870

<212> DNA

<213> 蒂莫内马赛菌(Massiliatimonae)

<400> 1

gggtgggggt gtttcctgca gtcgagcggt aacagagtag cttgctccgt tgactagtgg 60

cgaacgggtg agtaatgtat cggaacgtgc ccataagtgg gggataacgt ctcgaaagtt 120

acgctaatac cgcatacgat ccacggatga aagtagggga ccttcgggcc ttatgctttt 180

ggagcggccg atatctgatt agctagttgg tgaggtaaag gctcaccaag gcgacgatct 240

gtagctggtc tgagaggatg acccgccaca ctggaactga gacacggtcc agactcctac 300

gggaggcagc agtggggaat tttggacaat gggcgcaacc ctgatccagc aatgccgcgt 360

gagtgaagaa ggccttcggg ttgtaaagct cttttgtcag ggaagaaacg gctgtggtta 420

atatccttgg ctaatgacgg tacctgaaga ataagcaccg gctaactacg tgccagcagc 480

cgcggtaata cgtaaggtgc aagcgttaat cggaattact gggcgtaaag cgtgcgcagg 540

cggttttgta agtctgacgt gaaatccccg gactctacct gggaattgcg ttgcagactg 600

caaggctaga atctggcaga gaggatgtag aattccacgt gtagcagtga aatgcgtaga 660

gatgtggagg acatccgatg gcgaaaggca caccccctgt gtcaagattc gacgctcatg 720

cacgaaagcg tgtggagcac aacacggatt agatatccct gtgagtcacg tgcctaaacg 780

aatgtctact agatgcgtgc tgtcatgact tgtacgcagc taactgactg cagtagatcg 840

actgctgagt acgtatcgga gcaatgacta 870

Claims (9)

1.一株具有高酶活的蒂莫内马赛菌(Massilia timonae.)BMMSJS-1，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No.18668。

2.如权利要求1所述的蒂莫内马赛菌BMMSJS-1在发酵生产几丁质酶中的应用。

3.如权利要求1所述的蒂莫内马赛菌BMMSJS-1在发酵生产木质素酶中的应用。

4.如权利要求1所述的蒂莫内马赛菌BMMSJS-1在发酵生产纤维素酶中的应用。

5.如权利要求1所述的蒂莫内马赛菌BMMSJS-1的筛选方法，其特征在于，所述的方法包括如下步骤：

(1)将采挖的贝母用冲洗，吸干表面水分，75％的乙醇浸泡后，冲洗，用0.2％的升汞表面消毒后，再次冲洗，吸干表面水分；

(2)用灭菌刀将步骤(1)所得的贝母外植体切为小段，放置于200℃高温干热灭菌处理过的研钵中，加入生理盐水，充分研磨；

(3)稀释研磨后的原液；将其涂布于固体虎红平板，黑暗培养至长出不同的真菌；

(4)分别从不同菌落的边上挑取菌丝，在固体PDA平板上划线纯化，挑取其中一株真菌菌落中的细菌，在固体TSA平板划线纯化后即得。

6.如权利要求5所述的筛选方法，其特征在于，所述的步骤(2)中的小段为0.5cm，所述的生理盐水经过灭菌。

7.如权利要求1所述的蒂莫内马赛菌BMMSJS-1在促进粉红粘帚霉菌生长中的应用。

8.如权利要求1所述的蒂莫内马赛菌BMMSJS-1在促进粉红粘帚霉菌对病原菌产生抑制作用中的应用。

9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的病原菌为镰刀菌属病原菌。

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