CN110836802A - 一种显示杯状细胞的改良Hale胶体铁染色方法和试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于杯状细胞的改良Hale胶体铁染色方法，用于显示十二指肠中杯状细胞、杯状细胞分泌的黏液、胶原纤维、血管和红细胞，所述的染色方法直观性强，染色对比鲜明，显微镜下极易判读，保证试验结果的准确性。因此，本发明解决了因染料的不特异性而难以准确判定试验结果的难题。本发明还提供了一种试剂盒，所述试剂盒，使用方法简单，更具实用性和可操作性。
Description
技术领域
本发明属于医疗卫生领域中的病理诊断和病理技术领域，也可用于生物技术领域、科研领域，涉及一种显示杯状细胞的改良Hale胶体铁染色方法和试剂盒。
背景技术
肠道是人体内极为重要的器官，不仅具有消化吸收营养物质和产生多种激素的作用，还具有重要的免疫屏障功能。肠道黏膜表面覆盖着一层保护性黏液凝胶，与多种细胞和不同机制相互作用，共同参与维持肠道稳态。杯状细胞，是肠道黏膜免疫屏障功能中产生免疫应答反应的重要细胞，其分化和分泌功能的改变可导致黏液凝胶成分的改变，在肠道疾病的发生发展过程中扮演着重要的角色。
显示杯状细胞的染色方法中，临床病理中已有苏木素-伊红染色法(简称HE染色)和PAS染色法。然而，效果并不是特别理想。HE染色法对多种固定液固定的组织和多种包埋法制作的切片均可使用，最终显示的杯状细胞与其它空泡性变的组织难以区分，故不具有特异性，这可能是由于中性福尔马林液和脱水过程中其它有机溶剂的作用，使得杯状细胞的多糖蛋白成分被溶解而着色度降低，最终呈现空泡状。PAS染色法，杯状细胞虽也可显示，但组织内的糖原、基底膜、十二指肠腺及其分泌物、真菌等也会被显示；该染色法着染成分较多，特异性不强，影响结果判读。
发明内容
为了克服上述现有技术中存在的缺陷，本发明提供了一种改良Hale胶体铁组合染色方法，用于显示十二指肠中杯状细胞、杯状细胞分泌的黏液、胶原纤维、血管和红细胞。本发明所述的染色方法直观性强，显示的杯状细胞呈界限清晰且直观可辨的淡蓝色或深蓝色，杯状细胞分泌的蓝色或深蓝色黏液、红色胶原纤维、黄色不规则血管和黄色红细胞均对比鲜明(其中，这里所述的对比鲜明是指各种组织成分在显微镜下观察时不仅各自对比性强，和周围其它成分及背景对比也强)，显微镜下极易判读，背景色理想，保证试验结果的准确性。
本发明所述改良Hale胶体铁组合染色方法的技术原理在于，由于杯状细胞的分泌物黏蛋白包含酸性黏多糖物质，着色能力较强，在酸性条件下能吸附胶体铁染液中的Fe3+而形成稳定的聚合物，再与亚铁氰化钾盐酸结合而着色，染色效果好，杯状细胞及其分泌物清晰可见，易于观察。因此，本发明解决了因染料的不特异性而难以准确判定试验结果的难题。本发明的染料具有特异性。
本发明提供的改良Hale胶体铁组合染色方法，对于组织中新型隐球菌的染色也具有极佳的染色效果。组织中新型隐球菌着色的原理，类似于杯状细胞的染色原理，原理如下：因新型隐球菌菌体外周含有一层较厚的酸性黏多糖物质组成的荚膜，这种荚膜着色能力较强。这可能是由于复合糖类醛基等酸性基团作为反应基础，复合糖阴离子与胶体铁反应的产物，有较高的电子密度，当pH值在1.5～2.0，其组织蛋白游离基团与胶体铁有一定的亲和力，再与酸性亚铁氰化钾作用，使组织细胞内的酸性黏多糖物质被牢固结合，从而能对新型隐球菌较好地着色。其中，所述“新型隐球菌”是指整体呈圆形或卵圆形，大小相差很大，一般直径约4～20μm(不包括荚膜)的溶组织酵母菌，其菌体周围有一层宽阔的具有折光性的胶质样荚膜包饶，荚膜厚约3～5μm，由一层黏多糖物质所组成。
本发明还提供了一种试剂盒，所述试剂盒使用简单，更具实用性和可操作性。
本发明提到的染色方法和试剂盒，均是对以往常规染色方法和技术的一种革命性突破。
本发明提供的改良Hale胶体铁组合染色方法，包括以下步骤：
(1)将切片脱蜡至水；
(2)将步骤(1)脱蜡至水后的切片入乙酸液浸洗；
(3)将步骤(2)浸洗后的切片浸入胶体铁染液中染色；
(4)将步骤(3)染色后的切片再浸入乙酸液浸洗；
(5)将步骤(4)浸洗后的切片浸入亚铁氰化钾盐酸液中染色；
(6)将步骤(5)染色后的切片入水洗；
(7)再经0.5％丽春红苦味酸S水溶液滴染经步骤(6)水洗后的切片，染色完成。
所述改良Hale胶体铁组合染色方法，具体包括以下步骤：
(1)将制备好的常规3μm厚的石蜡切片按病理科常规流程进行脱蜡至水；
(2)然后将步骤(1)脱蜡至水后的切片入乙酸液浸洗；
(3)然后将步骤(2)浸洗后的切片浸入盛有胶体铁染液的立式染色缸中染色；
(4)然后将步骤(3)染色后的切片再浸入乙酸液浸洗；
(5)然后将步骤(4)浸洗后的切片浸入盛有亚铁氰化钾盐酸液的立式染色缸中染色；
(6)然后将步骤(5)染色后的切片入自来水洗；
(7)然后再经0.5％丽春红苦味酸S水溶液滴染经步骤(6)水洗后的切片；
(8)染色完成后，切片再经无水乙醇脱水，冷风干燥，二甲苯透明，中性树胶封片。
步骤(2)中，所述浸洗的时间为2-5min；优选的时间为2min。
步骤(2)中，将步骤(1)脱蜡至水后的切片入乙酸浸洗可以保证切片处于酸性条件下，利于后续步骤的各种反应。
步骤(2)中，所述乙酸液的配方为，乙酸：蒸馏水的体积比为(2:100)-(3:100)；优选地，所述乙酸：蒸馏水的体积比为3：100。
本发明所述步骤(2)之后，步骤(3)之前还可以包括后处理步骤：将切片从步骤(2)的乙酸液中取出，在保证切片不干燥的情况下，在空气中手持切片轻甩30s使得切片上的乙酸液缓缓从玻片上挥发。该操作使得切片既处于酸性条件下，又不影响后续的染色；否则，带有较多乙酸液的切片进入下一步反应，会造成下一步染色液被稀释，影响最终结果。
步骤(3)中，所述染色的时间为40min-60min；优选地，为50min。
步骤(3)中，所述胶体铁染液的配方为，胶体铁原液：乙酸：蒸馏水的体积比为4:1:(2.5-3)；优选地，为4:1:3。所述胶体铁染液的pH为1.5-1.6，优选地，pH值为1.5。为更好地显示最终染色效果，本发明所述胶体铁染液优选为临用前新配制。
步骤(3)中，所述胶体铁染液的配制方法为：胶体铁原液20ml，乙酸5ml，蒸馏水15ml，pH调整为1.5。
其中，所述胶体铁原液的配方为，30％氯化铁：蒸馏水的体积比为1:49-1:50；优选地，为1:50。
其中，所述30％氯化铁的配方为，以蒸馏水的含量为基准，每100ml的蒸馏水中含有30g氯化铁。
其中，所述胶体铁原液的配制方法为：先将盛有250ml蒸馏水的烧杯置于电磁炉上加热使液体沸腾，然后向烧杯内滴加30％氯化铁5ml，待溶液变成砖红色后停止加热，最后将烧杯转移至磁力搅拌器上，直至溶液变成混匀且均一的砖红色，待液体冷却后，将其存放于棕色试剂瓶中，在室温下保存。以往的配制方法中会采用手动摇晃的方式，不仅费时费力、还有液体飞溅的可能。本发明中借用磁力搅拌器的作用，即节省了人力、又保证了实验安全、还能较好地混匀液体。
其中，所述乙酸液的配制方法为，乙酸：蒸馏水的体积比为3:100。
本发明中，将新鲜配制的胶体铁染液pH调整为1.5，是染液发挥最佳效果的关键点。
现有技术的常规胶体铁染色方法中为了节省试剂采用滴染，以致于反应不充分、着色不均匀，影响结果判读。本发明中采用的方式是浸染，这样可保证组织切片与胶体铁染液充分接触并有足够的时间进行染色反应，使得最终染色效果佳。
另外，本发明将切片直接浸入盛有胶体铁染液的立式染色缸的目的：在保证组织切片上有些许乙酸液的前提下，又保证组织切片能较快的进入后续反应。
步骤(4)中，所述浸洗的时间为2-5min；优选地，为3min。
步骤(4)中，将切片再浸入乙酸液浸洗的目的是使得切片始终处于酸性环境下，便于后续步骤中的反应。
步骤(4)中，所述乙酸液的配方为，乙酸：蒸馏水的体积比为2:100-3:100；优选地，所述乙酸：蒸馏水的体积比为3:100。
步骤(5)中，所述染色的时间为10min-15min；优选地，为10min。
步骤(5)中，所述亚铁氰化钾盐酸液的配方为：5％-6％亚铁氰化钾水溶液15ml，5％-6％盐酸水溶液15ml。优选地，所述亚铁氰化钾盐酸液的配方为：5％亚铁氰化钾水溶液15ml，5％盐酸水溶液15ml。本发明优选采用新鲜配制的亚铁氰化钾盐酸液。
步骤(6)中，所述水洗的时间为2min-3min；优选地，为2min。所述水可以为自来水、蒸馏水、矿泉水等。
步骤(7)中，对比染色：选用丽春红苦味酸S水溶液染色液，既显示胶原纤维、血管和红细胞，又能够增强染色的对比度。
步骤(7)中，所述滴染的时间为3min-5min；优选地，为3min。
步骤(7)中，所述丽春红苦味酸S水溶液的配方为：0.5％丽春红S水溶液10ml，苦味酸饱和水溶液90ml。
本发明步骤(7)中包含的不同于现有技术的创新改进点：因0.5％丽春红苦味酸S水溶液中会有不完全溶解的成分，使用时吸取上清液，这样滴染时不会有沉淀物附着于组织切片上。滴染液体的量以组织切片完全被覆盖为准。
步骤(7)中，“经0.5％丽春红苦味酸S水溶液滴染切片”的目的是：与显示杯状细胞的改良胶体铁染色法进行组合染色，显示杯状细胞周围组织中的胶原纤维、血管、红细胞等，对比鲜明，更利于结果的观察。
本发明所述的立式染色缸：是指染色用的带盖的圆形10片立式玻璃染色缸，可以节省染色液。
本发明中，可以采用本领域通常的滴染方法进行。如本发明所述的滴染：是指用医用吸管吸取适量的染色液，滴加在组织切片上直至覆盖组织后进行的染色。
本发明中，步骤(7)结束之后，还包括步骤(8)，所述步骤(8)中包含的不同于现有技术的创新改进点：第一，染色完毕后的组织切片不经水洗直接经无水乙醇脱水，这是因为丽春红苦味酸S水溶液为水溶性染料，水洗时间把握不当，会使得组织脱色或者着色不均。
现有技术中采用水洗去除切片表面多余的丽春红苦味酸S水溶液，以便于后续经少许的无水乙醇便可以对组织进行脱水处理。而不经水洗，可能需要更多的无水乙醇对组织进行处理：先用无水乙醇冲洗组织表面附着的多余的丽春红苦味酸S水溶液，然后进一步地用无水乙醇对组织进行脱水处理，本发明可以在保证切片不干燥的情况下，在空气中轻甩30s(如手持切片轻甩30s)，使得切片组织表面多余的丽春红苦味酸S水溶液缓缓从玻片上挥发。该操作既终止了多余的丽春红苦味酸S水溶液对组织的进一步过度着色，又克服了需要更多的无水乙醇来洗脱组织表面过多的丽春红苦味酸S水溶液的问题，还便于紧接着的直接用无水乙醇对组织进行脱水处理。在一个具体实施方式中，本发明可以先通过在空气中手持切片轻甩30s使得组织表面多余的丽春红苦味酸S水溶液缓缓从玻片上挥发，然后直接经无水乙醇对组织进行脱水处理。
第二，组织切片直接经无水乙醇脱水，而不是经梯度酒精(浓度由85％、90％、95％、100％)分别进行脱水，直接经无水乙醇脱水的处理方式效果较好，包括：节约试剂、节省时间、染色结果鲜艳，这是因为多次的临床病理试验证实该方法节约时间、脱水更方便，且具有实用性和可操作性。
而现有技术为了更完全地置换出组织内的水分，使得组织在显微镜下被观察时色泽度更鲜艳，通常认为直接经无水乙醇脱水效果不好，因而采用梯度酒精进行洗涤。
本发明所述的脱水是指：使用无水乙醇对染色完毕的组织进行处理，无水乙醇具有很强的吸水性，不仅能置换出组织中含有的水分，还能使组织硬化，使最终染色的组织色彩更鲜明、更易于在显微镜下观察。
本发明所述的二甲苯透明是指：经无水乙醇脱水后的切片，再浸入到二甲苯溶液中；二甲苯作为有机溶剂，既可以与无水乙醇结合，又可以和封片剂中的中性树胶结合，起到桥梁作用，从而使组织最终着色鲜艳，便于在显微镜下观察。
本发明所述改良Hale胶体铁组合染色方法，在传统的Hale胶体铁染色法的基础上提高了步骤(5)中亚铁氰化钾和盐酸浓度，这样可以更快激活杯状细胞内的酸性黏多糖物质，从而使得杯状细胞及其分泌的粘液着色较深。本发明中提高亚铁氰化钾和盐酸的浓度至适宜的范围，即亚铁氰化钾的浓度范围5％-6％，盐酸的浓度范围5％-6％。浓度过高，杯状细胞着色过深，与胶原纤维、血管、红细胞的对比度不够鲜明，甚至背景色也会出现，影响组织整体着色的色泽度。
本发明用于杯状细胞的改良Hale胶体铁染色方法的关键：
第一，在第(2)-(5)染色步骤中维持切片处于pH 1.5～2.0的酸性条件下，目的是保证杯状细胞内的酸性黏多糖类物质与改良胶体铁有较好的亲和力，再与亚铁氰化钾盐酸作用，使杯状细胞内的酸性黏多糖物质被牢固结合。
同时，乙酸浸洗要严格，乙酸浸洗的具体操作步骤为：将适量的乙酸液倒入染色缸中，将待染色的已经脱蜡至水的切片浸入其中，并保证切片被液体浸没。在一具体实施方式中，乙酸浸洗的具体操作步骤为：将适量的3％的乙酸液倒入干净的带盖的立式染色缸中，将待染色的已经脱蜡至水的切片浸入其中，并保证切片被液体浸没。
第二，提高步骤(5)亚铁氰化钾液和盐酸液的浓度；其中二者的浓度分别为5％亚铁氰化钾液和5％盐酸液。
第三，染色步骤(步骤(2)-(5))中的乙酸液浸洗、胶体铁染液反应和亚铁氰化钾盐酸液反应，最好在立式染色缸内浸染染色，以便保持足够的染色液反应，使切片着色均匀。
第四，立式染色缸，需干净，染色过程中带盖，防止液体挥发和尽量避免其它污染。
第五，在对比染色中，选用丽春红苦味酸S水溶液染色液，既显示了胶原纤维、血管和红细胞，还增强了染色的对比度。
本发明还提供了一种染色试剂盒，包括：(1)A液：胶体铁原液1000ml。(2)乙酸液1000ml。(3)B液：胶体铁染液，配制方法按照A液：乙酸液：蒸馏水＝4:1:3比例配制，A液、乙酸液、蒸馏水配制的先后顺序可以颠倒。(4)C液：5％亚铁氰化钾水溶液1000ml。(5)D液：5％盐酸水溶液1000ml。(6)E液：亚铁氰化钾盐酸液，按照C液：D液为1:1比例临用前新鲜配制。(5)丽春红苦味酸S水溶液染色液1000ml。
本发明中提到的染色试剂盒具有以下优点：第一，目前市场上暂时没有整套试剂盒的出现；第二，本发明试剂盒中的A液(胶体铁原液)批量生产后，省去了原始方法中该胶体铁原液配制过程中既要维持液体的沸腾还要不停地搅拌这一步骤，省时省力；第三，本发明试剂盒中的B液(胶体铁染液)按照A液：乙酸液：蒸馏水＝4:1:3比例配制，相比于传统试剂盒中对于试剂的定量转换成试剂的比例，可以根据临床或科研工作中组织切片的多少，合适地调配染液的量；按照该比例配制，不仅可以省去用pH计或pH试纸反复测量pH的步骤，A液、乙酸液和蒸馏水的顺序还可以颠倒；且该比例配制法既经济适用又节约成本；第四，试剂盒中E液亚铁氰化钾盐酸液，按照C液：D液为1:1比例临用前新鲜配制，既可以根据组织切片的量调整试剂的量、又可以保证染色效果最佳化。
本发明还提供了所述染色试剂盒在杯状细胞的改良Hale胶体铁染色中的应用。
本发明的创新点如下：
(1)本发明首次将改良Hale胶体铁染色法用于显示杯状细胞。本发明将改良Hale胶体铁染色法用于显示杯状细胞，需要克服的技术难点有：第一，维持切片处于pH 1.5～2.0的酸性条件下，所以乙酸浸洗要严格；第二，提高亚铁氰化钾液和盐酸液的浓度，可以更快的激活杯状细胞内所含的酸性黏多糖类物质；第三，染色步骤中的乙酸液浸洗、胶体铁染液反应和亚铁氰化钾盐酸液反应，最好在立式染色缸内浸染染色，以便保持足够的染色液反应，使切片着色均匀；第四，立式染色缸，需干净，尽量避免其它污染。
(2)本发明首次为了提高着色对比度，进一步观察杯状细胞与其周围组织形态结构的特点变化及相互关系，选用丽春红苦味酸液进行组合染色。
(3)染色完成后的切片直接经无水乙醇进行脱水处理。
本发明的有益效果在于：本发明提出了一种显示杯状细胞的染色方法及可制成商品化的试剂盒，本发明中的染色方法可以清晰且对比鲜明地显示组织中杯状细胞。本发明中的试剂盒，既节约试剂的配制时间，又带来经济效益，这是一把双刃剑。
附图说明
图1为本发明实施例1中人十二指肠切除标本中杯状细胞经本试剂盒中的本染色方法显示的杯状细胞，普通显微镜下100倍示图：其中杯状细胞(粗箭头示)呈蓝色或深蓝色，胶原纤维(细箭头示)呈红色，二者与周围组织对比明显，组织结构层次清晰，染色鲜明，镜下极易辨认。
图2为本发明实施例1中人十二指肠切除标本中杯状细胞经本试剂盒中的本染色方法显示的杯状细胞，普通显微镜下400倍示图：其中杯状细胞(箭头示)呈蓝色或深蓝色和柱状细胞呈高柱状，核椭圆形，位于基底部，染色鲜明，镜下极易辨认。
图3为本发明实施例2中人十二指肠切除标本中杯状细胞经本试剂盒中的本染色方法显示的杯状细胞，普通显微镜下100倍示图：其中杯状细胞(粗箭头示)呈蓝色或深蓝色，胶原纤维(浅粗箭头示)，血管(浅细箭头示)，淋巴管(细箭头示)，染色鲜明，镜下极易辨认(10×，改良Hale胶体铁染色)(其中，粗>浅粗>浅细>细)。
图4为本发明实施例2中人十二指肠切除标本中杯状细胞经本试剂盒中的本染色方法显示的杯状细胞，普通显微镜下400倍示图：其中杯状细胞(粗箭头示)呈蓝色或深蓝色，胶原纤维(细箭头示)，染色鲜明，镜下极易辨认(10×，改良Hale胶体铁染色)。
具体实施方式
结合以下具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的保护内容在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。实施本发明的过程、条件、试剂、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。
收集资料方式：选取海军军医大学附属长海医院病理科送检的经外科手术切除的十二指肠标本20例，所有标本均经10％中性福尔马林固定后取材，行常规固定、脱水、透明、浸蜡、包埋、制片等流程制成3μm厚的石蜡切片，75℃烤台充分烤片。切片经脱蜡至水后，行改良Hale胶体铁染色。进一步在显微镜下观察杯状细胞的染色效果。
实施例1为人体胰腺、十二指肠标本切除术后的十二指肠标本中杯状细胞、胶原纤维共染色结果。
1、一种显示杯状细胞的染色方法和试剂盒，染色方法为：改良Hale胶体铁染色；染色试剂盒为：改良Hale胶体铁染色试剂盒。
2、其中所述改良Hale胶体铁染色试剂盒，包括：(1)A液：胶体铁原液1000ml(可以量产)。(2)乙酸液1000ml(可以量产)。(3)B液：胶体铁染液，配制方法按照A：乙酸液：蒸馏水＝4:1:3比例配制，染液A、乙酸液、蒸馏水配制的先后顺序可以颠倒。(4)C液：5％亚铁氰化钾水溶液1000ml(可以量产)。(5)D液：5％盐酸水溶液1000ml(可以量产)。(6)E液：亚铁氰化钾盐酸液，按照C液：D液为1:1比例临用前新鲜配制。(5)丽春红苦味酸染色液1000ml(可以量产)。
3、其中所述试剂盒的具体配置方法如下：
(1)胶体铁原液：30％氯化铁5ml，蒸馏水250ml。将蒸馏水置于烧杯内煮沸，然后滴加氯化铁，不断搅动，直至溶液变成红砖色，停止加热，待冷却后使用。该液可在室温下保存。
(2)胶体铁染液:胶体铁原液20ml，乙酸5ml，蒸馏水15ml。为显示实验效果，实验中采取染液临用前新配制，其pH值调整为1.5。
(3)乙酸液:乙酸3ml，蒸馏水100ml。
(4)亚铁氰化钾盐酸液:5％亚铁氰化钾水溶液15ml，5％盐酸水溶液15ml，临用前新配制。
(5)丽春红苦味酸染色液:0.5％丽春红S水溶液10ml，苦味酸饱和水溶液90ml。
4、其中所述改良Hale胶体铁染色的流程为：
①制备好的切片按病理科常规流程进行脱蜡至水；
②脱蜡至水后的切片入乙酸液浸洗2min；
③切片直接浸入盛有胶体铁染液的立式染色缸中50min；
④切片再浸入乙酸液浸洗3min；
⑤切片浸入盛有亚铁氰化钾盐酸液的立式染色缸中10min；
⑥切片入自来水洗2min；
⑦丽春红苦味酸S水溶液滴染切片3min；
⑧染色完成后，组织再经无水乙醇脱水，冷风干燥，二甲苯透明，中性树胶封片。
5、实验结果：
①实施例1中人十二指肠切除标本中杯状细胞经本试剂盒中的本染色方法显示的杯状细胞，普通显微镜下100倍示图(如图1所示)：其中杯状细胞(粗箭头示)呈蓝色或深蓝色，胶原纤维(细箭头示)呈红色，二者与周围组织对比明显，组织结构层次清晰，染色鲜明，镜下极易辨认。
②图2为实施例1中人十二指肠切除标本中杯状细胞经本试剂盒中的本染色方法显示的杯状细胞，普通显微镜下400倍示图(如图2所示)：其中杯状细胞(箭头示)呈蓝色或深蓝色和柱状细胞呈高柱状，核椭圆形，位于基底部，染色鲜明，镜下极易辨认。
实施例2为人体胰腺、十二指肠标本切除术后的十二指肠标本中杯状细胞、胶原纤维、血管、淋巴管共染色结果。
1、一种显示杯状细胞的染色方法和试剂盒，染色方法为：改良Hale胶体铁染色；染色试剂盒为：改良Hale胶体铁染色试剂盒。
2、其中所述改良Hale胶体铁染色试剂盒，包括：(1)A液：胶体铁原液1000ml(可以量产)。(2)乙酸液1000ml(可以量产)。(3)B液：胶体铁染液，配制方法按照A：乙酸液：蒸馏水＝4:1:3比例配制，染液A、乙酸液、蒸馏水配制的先后顺序可以颠倒。(4)C液：5％亚铁氰化钾水溶液1000ml(可以量产)。(5)D液：5％盐酸水溶液1000ml(可以量产)。(6)E液：亚铁氰化钾盐酸液，按照C液：D液为1:1比例临用前新鲜配制。(5)丽春红苦味酸染色液1000ml(可以量产)。
3、其中所述试剂盒的具体配置方法如下：
(1)胶体铁原液：30％氯化铁5ml，蒸馏水250ml。将蒸馏水置于烧杯内煮沸，然后滴加氯化铁，不断搅动，直至溶液变成红砖色，停止加热，待冷却后使用。该液可在室温下保存。
(2)胶体铁染液:胶体铁原液20ml，乙酸5ml，蒸馏水15ml。为显示实验效果，实验中采取染液临用前新配制，其pH值调整为1.5。
(3)乙酸液:乙酸3ml，蒸馏水100ml。
(4)亚铁氰化钾盐酸液:5％亚铁氰化钾水溶液15ml，5％盐酸水溶液15ml，临用前新配制。
(5)丽春红苦味酸染色液:0.5％丽春红S水溶液10ml，苦味酸饱和水溶液90ml。
4、其中所述改良Hale胶体铁染色的流程为：
①制备好的切片按病理科常规流程进行脱蜡至水；
②脱蜡至水后的切片入乙酸液浸洗2min；
③切片直接浸入盛有胶体铁染液的立式染色缸中50min；
④切片再浸入乙酸液浸洗3min；
⑤切片浸入盛有亚铁氰化钾盐酸液的立式染色缸中10min；
⑥切片入自来水洗2min；
⑦丽春红苦味酸S水溶液滴染切片3min；
⑧染色完成后，组织再经无水乙醇脱水，冷风干燥，二甲苯透明，中性树胶封片。
5、实验结果：
①图3为实施例2中人十二指肠切除标本中杯状细胞经本试剂盒中的本染色方法显示的杯状细胞，普通显微镜下100倍示图(如图3所示)：其中杯状细胞(粗箭头示)呈蓝色或深蓝色，胶原纤维(浅粗箭头示)，血管(浅细箭头示)，淋巴管(细箭头示)，染色鲜明，镜下极易辨认(10×，改良Hale胶体铁染色)。
②图4为实施例2中人十二指肠切除标本中杯状细胞经本试剂盒中的本染色方法显示的杯状细胞，普通显微镜下400倍示图(如图4所示)：其中杯状细胞(粗箭头示)呈蓝色或深蓝色，胶原纤维(细箭头示)，染色鲜明，镜下极易辨认(10×，改良Hale胶体铁染色)。
本发明的保护内容不局限于以上实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。
Claims (10)
1.一种用于杯状细胞的改良Hale胶体铁染色方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
(1)将切片脱蜡至水；
(2)将步骤(1)脱蜡至水后的切片入乙酸液浸洗；
(3)将步骤(2)浸洗后的切片浸入胶体铁染液中染色；
(4)将步骤(3)染色后的切片再浸入乙酸液浸洗；
(5)将步骤(4)浸洗后的切片浸入亚铁氰化钾盐酸液中染色；
(6)将步骤(5)染色后的切片入水洗；
(7)再经0.5％丽春红苦味酸S水溶液滴染经步骤(6)水洗后的切片，染色完成。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，所述浸洗的时间为2min-5min。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，所述染色的时间为40min-60min。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，所述胶体铁染液的配方为，胶体铁原液：乙酸：蒸馏水的体积比为4:1:(2.5-3)；所述胶体铁染液的pH为1.5-1.6。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述胶体铁原液的配制方法为：先将盛有250ml蒸馏水的烧杯置于电磁炉上加热使液体沸腾，然后向烧杯内滴加30％氯化铁5ml，待溶液变成砖红色后停止加热，最后将烧杯转移至磁力搅拌器上，直至溶液变成混匀且均一的砖红色，待液体冷却后，将其存放于棕色试剂瓶中在室温下保存。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)中，所述浸洗的时间为2min-5min。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(5)中，所述亚铁氰化钾盐酸液的配方为：5％-6％亚铁氰化钾水溶液15ml，5％-6％盐酸水溶液15ml，亚铁氰化钾水溶液：盐酸水溶液比例为1:1；所述染色的时间为10min-15min。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(6)中，所述水洗的时间为2min-3min；和/或，所述步骤(7)中，所述滴染的时间为3min-5min。
9.一种染色试剂盒，其特征在于，包括：(1)A液：胶体铁原液1000ml；(2)乙酸液1000ml；(3)B液：胶体铁染液，配制方法按照A液：乙酸液：蒸馏水＝4:1:3比例配制，现用现配；(4)C液：5％亚铁氰化钾水溶液1000ml；(5)D液：5％盐酸水溶液1000ml；(6)E液：亚铁氰化钾盐酸液，按照C液：D液为1:1配制，现用现配；(5)丽春红苦味酸S水溶液1000ml。
10.如权利要求9所述的染色试剂盒在杯状细胞的改良Hale胶体铁染色中的应用。
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|---|---|---|---|---|
| CN112539986A (zh) * | 2020-12-01 | 2021-03-23 | 河南赛诺特生物技术有限公司 | 一种用于黑色素染色的硫酸亚铁试剂及试剂盒 |
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Non-Patent Citations (3)
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| 黄春兰: "杯状细胞及肠道黏液屏障的功能研究", 《国际消化病杂志》 * |
Cited By (1)
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|---|---|---|---|---|
| CN112539986A (zh) * | 2020-12-01 | 2021-03-23 | 河南赛诺特生物技术有限公司 | 一种用于黑色素染色的硫酸亚铁试剂及试剂盒 |
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