CN110810839A - 治疗和预防痛风及其它尿酸结晶相关病症的蔬菜活性组分、成品及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种治疗和预防痛风及其它尿酸结晶相关病症的蔬菜活性组分、成品及其制备方法，包括以下重量百分比含量的营养成分：42％到42.5％的碳水化合物、7.25％到7.35％的蛋白质、0.49％到0.51％的脂肪、19.3％到19.5％的钠、0.57％到0.63％的维生素C、0.01％到0.1％的铁；本发明采用蔬菜作为原料，从蔬菜中分离出活性组分，并采用大鼠气囊注射尿酸单钠结晶痛风模型检测该蔬菜活性组分，检测结果表明该蔬菜活性组分对痛风及其它尿酸结晶相关病症具有明确疗效和预防作用；该成品具有很好的疗效和预防作用，也不会对患者产生毒副作用，并且该成品易制备成糕点、糖果、饮品和其它各种形式的食品产品。
Description
技术领域
本发明涉及医药技术领域，尤其涉及一种治疗和预防痛风及其它尿酸结晶相关病症的蔬菜活性组分、成品及其制备方法。
背景技术
痛风及其它尿酸结晶相关病症是全球范围的多发病。针对其病因的治疗，迄今只有降低血液尿酸水平这一类的药物疗法。当前这类病症的预防和治疗状况均不理想，与降尿酸的药物疗法这种治疗方式不无关系。最新的研究已经显示，采用降尿酸的药物疗法，长期使用这类降尿酸的化学药会引起肝损害、胃肠道反应及神经毒性等副作用，可导致死亡率上升。因此亟待研发另外治疗及预防效果好且毒副作用小的产品。
美国风湿病学会ACR的2012年痛风治疗指南明确指出蔬菜对痛风患者有益处，要求患者多食用蔬菜，同时也表示蔬菜的疗效弱，目前仍未研究出其它更好提高疗效的方法。
发明内容
本发明解决的技术问题是，克服现有技术的缺陷，找到并提供治疗和预防痛风及其它尿酸结晶相关病症的蔬菜活性组分、成品及其制备方法，目的是在蔬菜中找到并获得对痛风及其它尿酸结晶相关病症有治疗和预防作用的活性组分。本发明研究显示蔬菜中存在相关的有效成分，并且从蔬菜中分离出活性组分，采用大鼠气囊注射尿酸单钠结晶痛风模型检测该活性组分，检测结果表明该活性组分对痛风及其它尿酸结晶相关病症具有明确疗效和预防作用，而直接食用蔬菜本身并没有体现这些效果。
对于上述技术问题，本发明建立下述技术方案予以解决：
治疗和预防痛风及其它尿酸结晶相关病症的蔬菜活性组分的制备方法，包括如下步骤：
步骤一：选取新鲜蔬菜，对新鲜蔬菜施加机械损伤作用，使新鲜蔬菜引发应激反应；
步骤二：先将磷酸盐缓冲液A加入经过机械损伤作用的新鲜蔬菜中，再采用匀浆器将磷酸盐缓冲液A与新鲜蔬菜形成的混合物制成匀浆，再将匀浆煮沸后冰浴至0-4℃，然后通过离心力对匀浆进行离心作用并得到第一次上清液，取出第一次上清液之后得到沉淀物；其中，磷酸盐缓冲液A由NaH2PO4-Na2HPO4、NaCl、KCl、EDTA、β-巯基乙醇混合而成；
步骤三：先将沉淀物加入非离子型表面活性剂中使沉淀物悬浮，再加入磷酸盐缓冲液A形成混合液，再将混合液冰浴至0-4℃并进行搅拌，然后通过离心力对混合液进行离心作用并得到第二次上清液，取出第二次上清液；
步骤四：将第一次上清液和第二次上清液混合合并形成上清液；
步骤五：分别将DEAE阴离子交换层析树脂、CM阳离子交换树脂、疏水层析介质在磷酸盐缓冲液A中进行酸碱度平衡处理之后，分别得到酸碱度平衡处理之后的DEAE阴离子交换层析树脂、CM阳离子交换树脂、疏水层析介质；其中，酸碱度平衡处理过程如下：分别将DEAE阴离子交换层析树脂、CM阳离子交换树脂、疏水层析介质在磷酸盐缓冲液A中浸泡10-30分钟，使DEAE阴离子交换层析树脂、CM阳离子交换树脂、疏水层析介质均呈中性，目的在于将DEAE阴离子交换层析树脂、CM阳离子交换树脂、疏水层析介质通过磷酸盐缓冲液A中和至中性，为后续的DEAE阴离子交换层析树脂、CM阳离子交换树脂、疏水层析介质的层析工艺创造酸碱度为中性的条件。
步骤六：将酸碱度平衡处理之后的DEAE阴离子交换层析树脂加入到混合合并的上清液中并进行搅拌，再用滤纸过滤之后得到滤液B，然后回收DEAE阴离子交换层析树脂；将酸碱度平衡处理之后的CM阳离子交换树脂加入到滤液B中并进行搅拌，再用滤纸过滤之后得到滤液C，然后回收CM阳离子交换树脂；将酸碱度平衡处理之后的疏水层析介质加入到滤液C中并进行搅拌，再用滤纸过滤，然后回收疏水层析介质；
步骤七：将步骤六中回收的DEAE阴离子交换层析树脂、CM阳离子交换树脂、疏水层析介质装入层析柱中；
步骤八：采用磷酸盐缓冲液D对层析柱进行NaCl浓度梯度洗脱，收集若干份洗脱液，得到不同的蔬菜组分，然后采用离心式凝胶层析的方法分别对每份蔬菜组分进行纯化处理；
步骤九：依次按步骤一、步骤二的方法制备得到匀浆，然后向步骤八制得的每份蔬菜组分加入匀浆，并混合静置后形成对应的若干份混合液，然后采用大鼠气囊注射尿酸单钠结晶痛风模型检测每份混合液的活性，得到蔬菜活性组分。
作为优选，步骤七中的将步骤六中回收的DEAE阴离子交换层析树脂、CM阳离子交换树脂、疏水层析介质装入层析柱中的具体方法如下：将步骤六中回收的DEAE阴离子交换层析树脂、CM阳离子交换树脂、疏水层析介质依次装入同一个层析柱中，DEAE阴离子交换层析树脂装在层析柱的底部，CM阳离子交换树脂叠加在DEAE阴离子交换层析树脂上面，疏水层析介质叠加在CM阳离子交换树脂上面，层析柱形成DEAE阴离子交换层析树脂位于最下层、CM阳离子交换树脂位于中间层、疏水层析介质位于位于最上层的结构。
作为优选，步骤七中的将步骤六中回收的DEAE阴离子交换层析树脂、CM阳离子交换树脂、疏水层析介质装入层析柱中的具体方法如下：将步骤六中回收的DEAE阴离子交换层析树脂、CM阳离子交换树脂、疏水层析介质分别装在各一个层析柱中；步骤八中的采用磷酸盐缓冲液D对层析柱进行洗脱处理的具体方法如下：磷酸盐缓冲液D先进入疏水层析介质所在的层析柱，再进入CM阳离子交换树脂所在的层析柱，然后进入DEAE阴离子交换层析树脂所在的层析柱。
作为优选，非离子型表面活性剂为聚山梨醇酯(polysorbate)-20或聚山梨醇酯-40或聚山梨醇酯-60或聚山梨醇酯-80。
作为优选，疏水层析介质为苯基琼脂糖凝胶或丁基琼脂糖凝胶或辛基琼脂糖凝胶。
作为优选，磷酸盐缓冲液D由磷酸盐缓冲液A添加梯度浓度为10-1000mM的NaCl形成，步骤八中的洗脱处理在10-20小时内完成。
作为优选，步骤八中每3分钟收集一份洗脱液，每份洗脱液的体积不超过5ml。
作为优选，依次按步骤一、步骤二的方法制备得到匀浆，然后向步骤八制得的每份蔬菜组分加入匀浆，蔬菜组分与匀浆的体积比为10:1，并混合静置15分钟后形成对应的若干份混合液，分别从每份混合液取出0.3ml分别向大鼠灌胃，采用大鼠气囊注射尿酸单钠结晶痛风模型分别对每次大鼠灌胃进行检测并对检测结果进行分析，从而检测得到活性最高的蔬菜活性组分。
本发明中，采用大鼠气囊注射尿酸单钠结晶痛风模型检测蔬菜活性组分，检测出第49份蔬菜活性组分的活性最高，并对检测出的活性最高的第49份蔬菜活性组分进行验证及分析的具体过程如下：先对大鼠注射尿酸结晶使大鼠引发病症，再用第49份蔬菜活性组分对大鼠灌胃1个星期，每天1次，在大鼠模型上使用1星期的过程中，相对于对照组的大鼠，实验组的大鼠活动程度逐步增高，气囊区外表形态改善，1个星期后取得的气囊中渗出液更少；其中，对照组定义为对大鼠灌胃相当于同样原材料分量的菠菜用水制成的匀浆；依据大鼠气囊注射尿酸单钠结晶痛风模型检测活性最高的第49份蔬菜活性组分的疗效与预防作用，先用第49份蔬菜活性组分对大鼠灌胃1次，1天后注射尿酸结晶，并继续用第49份蔬菜活性组分对大鼠灌胃，每天1次，持续1个星期；以上检测及验证结果表明，第49份蔬菜活性组分为活性最高的蔬菜活性组分，具有最佳治疗效果和预防作用。
采用治疗和预防痛风及其它尿酸结晶相关病症的蔬菜活性组分的制备方法所获得的蔬菜活性组分，蔬菜为菠菜、茭白、黄花菜、芦笋、卷丹百合、洋葱、韭葱、大蒜、南欧葱、大葱、分葱、韭菜、薤、芋、魔芋、普通山药、田薯、生姜、根菾菜、红落葵、白落葵、苋菜、莲藕、芡实、萝卜、芜菁、芜菁甘蓝、芥蓝、结球甘蓝、抱子甘蓝、羽衣甘蓝、花椰菜、青花菜、球茎甘蓝、小白菜、结球白菜、叶用芥菜、茎用芥菜、芽用芥菜、根用芥菜、辣根、豆瓣菜、荠菜、豆薯、菜豆、豌豆、蚕豆、豇豆、菜用大豆、扁豆、刀豆、矮刀豆、苜蓿、芹菜、根芹、水芹、芫荽、胡萝卜、小茴香、蕹菜、薄荷、荆芥、罗勒、草石蚕、马铃薯、茄子、番茄、辣椒、香艳茄、酸浆、黄瓜、甜瓜、南瓜、笋瓜、西葫芦、西瓜、冬瓜、瓠瓜、丝瓜、有棱丝瓜、苦瓜、佛手瓜、蛇瓜、莴苣、茼蒿、菊芋、苦苣、紫背天葵、牛蒡、朝鲜蓟、黄秋葵、冬寒菜或香椿，其中，南欧葱为大头葱，田薯为大薯，根菾菜为叶菾菜，南瓜为中国南瓜，笋瓜为印度南瓜，西葫芦为美洲南瓜，瓠瓜为葫芦，莴苣为莴笋或长叶莴苣或皱叶莴苣或结球莴苣。
治疗和预防痛风及其它尿酸结晶相关病症的成品，由前述蔬菜活性组分与常规食品材料和添加剂一道采用常规技术制成，包括以下重量百分比含量的营养成分：42％到42.5％的碳水化合物、7.25％到7.35％的蛋白质、0.49％到0.51％的脂肪、19.3％到19.5％的钠、0.57％到0.63％的维生素C、0.01％到0.1％的铁；其中，该成品由检测得到的活性最高的蔬菜活性组分和辅料制成，活性最高的蔬菜活性组分由治疗和预防痛风及其它尿酸结晶相关病症的蔬菜活性组分的制备方法制得，辅料包括面粉、米粉、玉米淀粉、麦芽糊精、白砂糖、食盐、蔬菜粉、维生素C、硫酸亚铁、甘草酸；并且采用常规食品制作技术将该成品制备成糕点、糖果、饮品和其它各种形式的食品产品。
本发明由于采用了以上技术方案，具有显著的技术效果：采用蔬菜作为原料，从蔬菜中分离出活性组分，并采用大鼠气囊注射尿酸单钠结晶痛风模型检测该蔬菜活性组分，检测结果表明该蔬菜活性组分对痛风及其它尿酸结晶相关病症具有明确疗效和预防作用；该成品具有很好的疗效和预防作用，也不会对患者产生毒副作用，并且该成品易制备成糕点、糖果、饮品和其它各种形式的食品产品。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细描述。
治疗和预防痛风及其它尿酸结晶相关病症的蔬菜活性组分的制备方法，包括如下步骤：
步骤一：选取新鲜蔬菜，对新鲜蔬菜施加机械损伤作用，使新鲜蔬菜引发应激反应；
步骤二：先将磷酸盐缓冲液A加入经过机械损伤作用的新鲜蔬菜中，再采用匀浆器将磷酸盐缓冲液A与新鲜蔬菜形成的混合物制成匀浆，再将匀浆煮沸后冰浴至0-4℃，然后通过500×g-7000×g离心力对匀浆进行离心作用并得到第一次上清液，取出第一次上清液之后得到沉淀物；其中，磷酸盐缓冲液A由NaH2PO4-Na2HPO4、NaCl、KCl、EDTA、β-巯基乙醇混合而成；其中，500×g-7000×g离心力属于低速离心作用产生的离心力，能取得最佳的离心作用。
步骤三：先将沉淀物加入非离子型表面活性剂中使沉淀物悬浮，再加入磷酸盐缓冲液A形成混合液，再将混合液冰浴至0-4℃并进行搅拌，然后通过500×g-7000×g离心力对混合液进行离心作用并得到第二次上清液，取出第二次上清液；
步骤四：将第一次上清液和第二次上清液混合合并形成上清液；
步骤五：分别将DEAE阴离子交换层析树脂、CM阳离子交换树脂、疏水层析介质在磷酸盐缓冲液A中进行酸碱度平衡处理之后，分别得到酸碱度平衡处理之后的DEAE阴离子交换层析树脂、CM阳离子交换树脂、疏水层析介质；其中，酸碱度平衡处理过程如下：分别将DEAE阴离子交换层析树脂、CM阳离子交换树脂、疏水层析介质在磷酸盐缓冲液A中浸泡10-30分钟，使DEAE阴离子交换层析树脂、CM阳离子交换树脂、疏水层析介质均呈中性，目的在于将DEAE阴离子交换层析树脂、CM阳离子交换树脂、疏水层析介质通过磷酸盐缓冲液A中和至中性，为后续的DEAE阴离子交换层析树脂、CM阳离子交换树脂、疏水层析介质的层析工艺创造酸碱度为中性的条件。
步骤六：将酸碱度平衡处理之后的DEAE阴离子交换层析树脂加入到混合合并的上清液中并进行搅拌，再用滤纸过滤之后得到滤液B，然后回收DEAE阴离子交换层析树脂；将酸碱度平衡处理之后的CM阳离子交换树脂加入到滤液B中并进行搅拌，再用滤纸过滤之后得到滤液C，然后回收CM阳离子交换树脂；将酸碱度平衡处理之后的疏水层析介质加入到滤液C中并进行搅拌，再用滤纸过滤，然后回收疏水层析介质；
步骤七：将步骤六中回收的DEAE阴离子交换层析树脂、CM阳离子交换树脂、疏水层析介质装入层析柱中；
步骤八：采用磷酸盐缓冲液D对层析柱进行NaCl浓度梯度洗脱，收集若干份洗脱液，得到不同的蔬菜组分，然后采用离心式凝胶层析的方法分别对每份蔬菜组分进行纯化处理；
步骤九：依次按步骤一、步骤二的方法制备得到匀浆，然后向步骤八制得的每份蔬菜组分加入匀浆，并混合静置后形成对应的若干份混合液，然后采用大鼠气囊注射尿酸单钠结晶痛风模型检测每份混合液的活性，得到蔬菜活性组分。
本实施例中，步骤七中的将步骤六中回收的DEAE阴离子交换层析树脂、CM阳离子交换树脂、疏水层析介质装入层析柱中的具体方法如下：将步骤六中回收的DEAE阴离子交换层析树脂、CM阳离子交换树脂、疏水层析介质依次装入同一个层析柱中，DEAE阴离子交换层析树脂装在层析柱的底部，CM阳离子交换树脂叠加在DEAE阴离子交换层析树脂上面，疏水层析介质叠加在CM阳离子交换树脂上面，层析柱形成DEAE阴离子交换层析树脂位于最下层、CM阳离子交换树脂位于中间层、疏水层析介质位于位于最上层的结构。
本实施例中，步骤七中的将步骤六中回收的DEAE阴离子交换层析树脂、CM阳离子交换树脂、疏水层析介质装入层析柱中的具体方法如下：将步骤六中回收的DEAE阴离子交换层析树脂、CM阳离子交换树脂、疏水层析介质分别装在各一个层析柱中；步骤八中的采用磷酸盐缓冲液D对层析柱进行洗脱处理的具体方法如下：磷酸盐缓冲液D先进入疏水层析介质所在的层析柱，再进入CM阳离子交换树脂所在的层析柱，然后进入DEAE阴离子交换层析树脂所在的层析柱。
本实施例中，非离子型表面活性剂为聚山梨醇酯(polysorbate)-20或聚山梨醇酯-40或聚山梨醇酯-60或聚山梨醇酯-80。
本实施例中，疏水层析介质为苯基琼脂糖凝胶或丁基琼脂糖凝胶或辛基琼脂糖凝胶。
本实施例中，磷酸盐缓冲液D由磷酸盐缓冲液A添加梯度浓度为10-1000mM的NaCl形成，步骤八中的洗脱处理在10-20小时内完成。
本实施例中，步骤八中每3分钟收集一份洗脱液，每份洗脱液的体积不超过5ml。
本实施例中，依次按步骤一、步骤二的方法制备得到匀浆，然后向步骤八制得的每份蔬菜组分加入匀浆，蔬菜组分与匀浆的体积比为10:1，并混合静置15分钟后形成对应的若干份混合液，分别从每份混合液取出0.3ml分别向大鼠灌胃，采用大鼠气囊注射尿酸单钠结晶痛风模型分别对每次大鼠灌胃进行检测并对检测结果进行分析，从而检测得到活性最高的蔬菜活性组分。
本实施例中，采用大鼠气囊注射尿酸单钠结晶痛风模型检测蔬菜活性组分，检测出第49份蔬菜活性组分的活性最高，并对检测出的活性最高的第49份蔬菜活性组分进行验证及分析的具体过程如下：先对大鼠注射尿酸结晶使大鼠引发病症，再用第49份蔬菜活性组分对大鼠灌胃1个星期，每天1次，在大鼠模型上使用1星期的过程中，相对于对照组的大鼠，实验组的大鼠活动程度逐步增高，气囊区外表形态改善，1个星期后取得的气囊中渗出液更少；其中，对照组定义为对大鼠灌胃相当于同样原材料分量的菠菜用水制成的匀浆；依据大鼠气囊注射尿酸单钠结晶痛风模型检测活性最高的第49份蔬菜活性组分的疗效与预防作用，先用第49份蔬菜活性组分对大鼠灌胃1次，1天后注射尿酸结晶，并继续用第49份蔬菜活性组分对大鼠灌胃，每天1次，持续1个星期；以上检测及验证结果表明，第49份蔬菜活性组分为活性最高的蔬菜活性组分，具有最佳治疗效果和预防作用。
本实施例中，采用治疗和预防痛风及其它尿酸结晶相关病症的蔬菜活性组分的制备方法所获得的蔬菜活性组分，蔬菜为菠菜、茭白、黄花菜、芦笋、卷丹百合、洋葱、韭葱、大蒜、南欧葱、大葱、分葱、韭菜、薤、芋、魔芋、普通山药、田薯、生姜、根菾菜、红落葵、白落葵、苋菜、莲藕、芡实、萝卜、芜菁、芜菁甘蓝、芥蓝、结球甘蓝、抱子甘蓝、羽衣甘蓝、花椰菜、青花菜、球茎甘蓝、小白菜、结球白菜、叶用芥菜、茎用芥菜、芽用芥菜、根用芥菜、辣根、豆瓣菜、荠菜、豆薯、菜豆、豌豆、蚕豆、豇豆、菜用大豆、扁豆、刀豆、矮刀豆、苜蓿、芹菜、根芹、水芹、芫荽、胡萝卜、小茴香、蕹菜、薄荷、荆芥、罗勒、草石蚕、马铃薯、茄子、番茄、辣椒、香艳茄、酸浆、黄瓜、甜瓜、南瓜、笋瓜、西葫芦、西瓜、冬瓜、瓠瓜、丝瓜、有棱丝瓜、苦瓜、佛手瓜、蛇瓜、莴苣、茼蒿、菊芋、苦苣、紫背天葵、牛蒡、朝鲜蓟、黄秋葵、冬寒菜或香椿，其中，南欧葱为大头葱，田薯为大薯，根菾菜为叶菾菜，南瓜为中国南瓜，笋瓜为印度南瓜，西葫芦为美洲南瓜，瓠瓜为葫芦，莴苣为莴笋或长叶莴苣或皱叶莴苣或结球莴苣。
本实施例中，治疗和预防痛风及其它尿酸结晶相关病症的成品，由前述蔬菜活性组分与常规食品材料和添加剂一道采用常规技术制成，包括以下重量百分比含量的营养成分：42％到42.5％的碳水化合物、7.25％到7.35％的蛋白质、0.49％到0.51％的脂肪、19.3％到19.5％的钠、0.57％到0.63％的维生素C、0.01％到0.1％的铁；其中，该成品由检测得到的活性最高的蔬菜活性组分和辅料制成，活性最高的蔬菜活性组分由治疗和预防痛风及其它尿酸结晶相关病症的蔬菜活性组分的制备方法制得，辅料包括面粉、米粉、玉米淀粉、麦芽糊精、白砂糖、食盐、蔬菜粉、维生素C、硫酸亚铁、甘草酸；并且采用常规食品制作技术将该成品制备成糕点、糖果、饮品和其它各种形式的食品产品，以方便患者食用。
本实施例以新鲜菠菜为例对本发明作进一步说明。
本实施例中，以新鲜菠菜为例，治疗和预防痛风及其它尿酸结晶相关病症的蔬菜活性组分的制备方法，具体步骤如下：
步骤一：选取新鲜菠菜的菜叶1000g，在室温条件下用研钵捣30分钟，将新鲜菠菜的菜叶捣至小于1平方厘米碎块，冰浴放置30分钟；
步骤二：先将1000ml磷酸盐缓冲液A加入经过步骤一处理的被捣至小于1平方厘米碎块的新鲜菠菜的菜叶，再采用匀浆器将1000ml磷酸盐缓冲液A与被捣至小于1平方厘米碎块的新鲜菠菜的菜叶形成的混合物制成匀浆，再将匀浆煮沸5分钟后冰浴至4℃，然后通过5000g离心力对匀浆进行15分钟离心作用并得到第一次上清液，取出第一次上清液之后得到沉淀物；其中，磷酸盐缓冲液A成分为10mM NaH2PO4-Na2HPO4、10mM NaCl、1mM KCl、2mMEDTA、2mMβ-巯基乙醇，pH值为7.4。
步骤三：先将沉淀物加入500ml、1％聚山梨醇酯-20中使沉淀物悬浮，再加入500ml磷酸盐缓冲液A形成混合液，再将混合液冰浴30分钟至4℃并进行搅拌，然后通过500×g-7000×g离心力对混合液进行15分钟离心作用并得到第二次上清液，取出第二次上清液；
步骤四：将第一次上清液和第二次上清液混合合并形成上清液；
步骤五：分别将300ml DEAE阴离子交换层析树脂、300ml CM阳离子交换树脂、300ml疏水层析丁基琼脂糖凝胶6HP在磷酸盐缓冲液A中进行酸碱度平衡处理之后，分别得到酸碱度平衡处理之后的DEAE阴离子交换层析树脂、CM阳离子交换树脂、疏水层析丁基琼脂糖凝胶6HP；
步骤六：将酸碱度平衡处理之后的300ml DEAE阴离子交换层析树脂加入到混合合并的上清液中并进行搅拌30分钟，再用滤纸过滤之后得到滤液B，然后回收DEAE阴离子交换层析树脂；将酸碱度平衡处理之后的300ml CM阳离子交换树脂加入到滤液B中并进行搅拌，再用滤纸过滤之后得到滤液C，然后回收CM阳离子交换树脂；将酸碱度平衡处理之后的疏水层析丁基琼脂糖凝胶6HP加入到滤液C中并进行搅拌30分钟，再用滤纸过滤，然后回收疏水层析丁基琼脂糖凝胶6HP；
步骤七：先将步骤六中回收的DEAE阴离子交换层析树脂装入一个5cm×50cm层析柱底部，再将回收的CM阳离子交换树脂装入该层析柱并叠加在DEAE阴离子交换层析树脂上，然后将回收的疏水层析丁基琼脂糖凝胶6HP装入该层析柱并叠加在CM阳离子交换树脂上，使DEAE阴离子交换层析树脂、CM阳离子交换树脂、疏水层析丁基琼脂糖凝胶6HP从底部向上叠加在层析柱中。
步骤八：采用1200ml磷酸盐缓冲液D对层析柱进行洗脱处理，收集若干份洗脱液，得到不同的蔬菜组分，然后采用葡聚糖凝胶G-10分别对每份洗脱液进行离心式层析纯化处理；其中，1200ml磷酸盐缓冲液D中的NaCl浓度梯度为10-500mM，聚山梨醇酯-20浓度梯度为0-2％，流速为1.5ml/分钟，收集洗脱液3分钟/份(即约4.5ml/份)；
步骤九：依次按步骤一、步骤二的方法制备得到匀浆，然后向步骤八制得的每份蔬菜组分加入匀浆，蔬菜组分与匀浆的体积比为10:1，并混合静置15分钟后形成对应的若干份混合液，然后采用大鼠气囊注射尿酸单钠结晶痛风模型检测每份混合液的活性，得到蔬菜活性组分。
总之，以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所作的均等变化与修饰，皆应属本发明专利的涵盖范围。
Claims (10)
1.治疗和预防痛风及其它尿酸结晶相关病症的蔬菜活性组分的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
步骤一：选取新鲜蔬菜，对新鲜蔬菜施加机械损伤作用，使新鲜蔬菜引发应激反应；
步骤二：先将磷酸盐缓冲液A加入经过机械损伤作用的新鲜蔬菜中，再采用匀浆器将磷酸盐缓冲液A与新鲜蔬菜形成的混合物制成匀浆，再将匀浆煮沸后冰浴至0-4℃，然后通过离心力对匀浆进行离心作用并得到第一次上清液，取出第一次上清液之后得到沉淀物；
步骤三：先将沉淀物加入非离子型表面活性剂中使沉淀物悬浮，再加入磷酸盐缓冲液A形成混合液，再将混合液冰浴至0-4℃并进行搅拌，然后通过离心力对混合液进行离心作用并得到第二次上清液，取出第二次上清液；
步骤四：将第一次上清液和第二次上清液混合合并形成上清液；
步骤五：分别将DEAE阴离子交换层析树脂、CM阳离子交换树脂、疏水层析介质在磷酸盐缓冲液A中进行酸碱度平衡处理之后，分别得到酸碱度平衡处理之后的DEAE阴离子交换层析树脂、CM阳离子交换树脂、疏水层析介质；
步骤六：将酸碱度平衡处理之后的DEAE阴离子交换层析树脂加入到混合合并的上清液中并进行搅拌，再用滤纸过滤之后得到滤液B，然后回收DEAE阴离子交换层析树脂；将酸碱度平衡处理之后的CM阳离子交换树脂加入到滤液B中并进行搅拌，再用滤纸过滤之后得到滤液C，然后回收CM阳离子交换树脂；将酸碱度平衡处理之后的疏水层析介质加入到滤液C中并进行搅拌，再用滤纸过滤，然后回收疏水层析介质；
步骤七：将步骤六中回收的DEAE阴离子交换层析树脂、CM阳离子交换树脂、疏水层析介质装入层析柱中；
步骤八：采用磷酸盐缓冲液D对层析柱进行NaCl浓度梯度洗脱，收集若干份洗脱液，得到不同的蔬菜组分，然后采用离心式凝胶层析的方法分别对每份蔬菜组分进行纯化处理；
步骤九：依次按步骤一、步骤二的方法制备得到匀浆，然后向步骤八制得的每份蔬菜组分加入匀浆，并混合静置后形成对应的若干份混合液，然后采用大鼠气囊注射尿酸单钠结晶痛风模型检测每份混合液的活性，得到蔬菜活性组分。
2.根据权利要求1所述的治疗和预防痛风及其它尿酸结晶相关病症的蔬菜活性组分的制备方法，其特征在于：步骤七中的将步骤六中回收的DEAE阴离子交换层析树脂、CM阳离子交换树脂、疏水层析介质装入层析柱中的具体方法如下：将步骤六中回收的DEAE阴离子交换层析树脂、CM阳离子交换树脂、疏水层析介质依次装入同一个层析柱中，DEAE阴离子交换层析树脂装在层析柱的底部，CM阳离子交换树脂叠加在DEAE阴离子交换层析树脂上面，疏水层析介质叠加在CM阳离子交换树脂上面，层析柱形成DEAE阴离子交换层析树脂位于最下层、CM阳离子交换树脂位于中间层、疏水层析介质位于位于最上层的结构。
3.根据权利要求1所述的治疗和预防痛风及其它尿酸结晶相关病症的蔬菜活性组分的制备方法，其特征在于：步骤七中的将步骤六中回收的DEAE阴离子交换层析树脂、CM阳离子交换树脂、疏水层析介质装入层析柱中的具体方法如下：将步骤六中回收的DEAE阴离子交换层析树脂、CM阳离子交换树脂、疏水层析介质分别装在各一个层析柱中；步骤八中的采用磷酸盐缓冲液D对层析柱进行洗脱处理的具体方法如下：磷酸盐缓冲液D先进入疏水层析介质所在的层析柱，再进入CM阳离子交换树脂所在的层析柱，然后进入DEAE阴离子交换层析树脂所在的层析柱。
4.根据权利要求1或2或3所述的治疗和预防痛风及其它尿酸结晶相关病症的蔬菜活性组分的制备方法，其特征在于：非离子型表面活性剂为聚山梨醇酯(polysorbate)-20或聚山梨醇酯-40或聚山梨醇酯-60或聚山梨醇酯-80。
5.根据权利要求4所述的治疗和预防痛风及其它尿酸结晶相关病症的蔬菜活性组分的制备方法，其特征在于：疏水层析介质为苯基琼脂糖凝胶或丁基琼脂糖凝胶或辛基琼脂糖凝胶。
6.根据权利要求1或2或3或5所述的治疗和预防痛风及其它尿酸结晶相关病症的蔬菜活性组分的制备方法，其特征在于：磷酸盐缓冲液D由磷酸盐缓冲液A添加梯度浓度为10-1000mM的NaCl形成，步骤八中的洗脱处理在10-20小时内完成。
7.根据权利要求6所述的治疗和预防痛风及其它尿酸结晶相关病症的蔬菜活性组分的制备方法，其特征在于：步骤八中每3分钟收集一份洗脱液，每份洗脱液的体积不超过5ml。
8.根据权利要求1或2或3或5或7所述的治疗和预防痛风及其它尿酸结晶相关病症的蔬菜活性组分的制备方法，其特征在于：依次按步骤一、步骤二的方法制备得到匀浆，然后向步骤八制得的每份蔬菜组分加入匀浆，蔬菜组分与匀浆的体积比为10:1，并混合静置15分钟后形成对应的若干份混合液，分别从每份混合液取出0.3ml分别向大鼠灌胃，采用大鼠气囊注射尿酸单钠结晶痛风模型分别对每次大鼠灌胃进行检测并对检测结果进行分析，从而检测得到活性最高的蔬菜活性组分。
9.采用权利要求8所述的治疗和预防痛风及其它尿酸结晶相关病症的蔬菜活性组分的制备方法所获得的蔬菜活性组分，其特征在于：蔬菜为菠菜、茭白、黄花菜、芦笋、卷丹百合、洋葱、韭葱、大蒜、南欧葱、大葱、分葱、韭菜、薤、芋、魔芋、普通山药、田薯、生姜、根菾菜、红落葵、白落葵、苋菜、莲藕、芡实、萝卜、芜菁、芜菁甘蓝、芥蓝、结球甘蓝、抱子甘蓝、羽衣甘蓝、花椰菜、青花菜、球茎甘蓝、小白菜、结球白菜、叶用芥菜、茎用芥菜、芽用芥菜、根用芥菜、辣根、豆瓣菜、荠菜、豆薯、菜豆、豌豆、蚕豆、豇豆、菜用大豆、扁豆、刀豆、矮刀豆、苜蓿、芹菜、根芹、水芹、芫荽、胡萝卜、小茴香、蕹菜、薄荷、荆芥、罗勒、草石蚕、马铃薯、茄子、番茄、辣椒、香艳茄、酸浆、黄瓜、甜瓜、南瓜、笋瓜、西葫芦、西瓜、冬瓜、瓠瓜、丝瓜、有棱丝瓜、苦瓜、佛手瓜、蛇瓜、莴苣、茼蒿、菊芋、苦苣、紫背天葵、牛蒡、朝鲜蓟、黄秋葵、冬寒菜或香椿。
10.治疗和预防痛风及其它尿酸结晶相关病症的成品，其特征在于：包括以下重量百分比含量的营养成分：42％到42.5％的碳水化合物、7.25％到7.35％的蛋白质、0.49％到0.51％的脂肪、19.3％到19.5％的钠、0.57％到0.63％的维生素C、0.01％到0.1％的铁。
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
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