CN110800755B - 阿维菌素纳米农药制剂及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种阿维菌素纳米农药制剂及其制备方法。所述阿维菌素纳米农药制剂的制备原料按重量计包含以下组分：2‑4.1份阿维菌素、0.5‑1.5份羧甲基纤维素钠、1‑2份N,N‑二环己基碳二亚胺、0.9‑2.2份4‑二甲氨基吡啶和1‑2.1份甲氧基‑聚乙二醇‑羧基。本发明的阿维菌素纳米农药制剂的粒径小、在叶面上的接触角较小、具有良好的抗光解性能，并具有较好的酯酶响应缓释特性，对美国白蛾幼虫具有显著的杀虫效果，药效及有效利用率高，极大地降低了农业防治成本，具有良好的应用前景。

Description

阿维菌素纳米农药制剂及其制备方法
技术领域
本发明属于农药技术领域。具体地，本发明涉及一种阿维菌素纳米农药制剂及其制备方法。
背景技术
农药在控制有害生物危害、保障农业生产安全和提高作物产量等方面发挥着重要作用，农药的不合理使用对人类健康和生态环境造成了诸多不利影响。近年来市场上出现了许多农药缓释剂型，这些农药剂型具有诸多优点，例如可以降低农药使用量、延长农药的持效期、使高毒农药低毒化，减少对非靶标生物的毒害等。目前，将纳米技术应用于农药领域制备的纳米农药能显著提高农药的水溶性和分散性，改善农药在叶面上的粘附性并且具有精准智能释放的特点等，为农药剂型改良提供了新的思路和方向。
纳米材料具有靶向传输与控制释放的特点，引起了越来越多科技工作者的关注，其中，聚合物形成的纳米胶束是高分子药物控释系统中发展较快的一种新型药物控释系统，这种纳米颗粒以亲水基团为外壳、疏水基团为内核通过自组装形成有序的聚集体，在医药领域已经取得了一定的进展，但在农药领域的报道罕见。有害生物体内存在酯酶，在其对作物进行危害的过程中，可采用农药靶向控释策略，实现精准智能化控制有害生物。
阿维菌素(Avm)是由除虫链霉菌经液体发酵产生的一类大环内酯类抗生素，具有广谱的杀虫和杀螨特性。除虫链霉菌发酵产生的阿维菌素中包括结构类似的8种组分Avm(A1aA1bA2aA2bB1aB1bB2aB2b), 目前常用的杀虫成分为B1a(其中B1a不低于90％，B1a/B1b>20％)。在实际使用时阿维菌素见光易分解且水溶性差，导致了阿维菌素施药量增大、药效及有效利用率降低，且缓释性能差，限制了其在农业上的应用。
因此，如何提供一种抗光解性能好、药效及有效利用率高且缓释性能好的阿维菌素纳米农药制剂成为本领域亟待解决的课题。
发明内容
针对上述问题，本发明的一个目的在于提供一种阿维菌素纳米农药制剂，该纳米农药制剂的粒径小、抗光解性能好、药效及有效利用率高且缓释性能好，极大地降低了农业防治成本。
本发明的另一个目的在于提供上述阿维菌素纳米农药制剂的制备方法。
为达到上述目的，本发明提供一种阿维菌素纳米农药制剂，其制备原料按重量计包含以下组分：
阿维菌素：2-4.1份
羧甲基纤维素钠：0.5-1.5份
N,N-二环己基碳二亚胺：1-2份
4-二甲氨基吡啶：0.9-2.2份
甲氧基-聚乙二醇-羧基：1-2.1份。
在一些实施方案中，所述阿维菌素纳米农药制剂由以下组分制成：
阿维菌素：2.4-3.4份
羧甲基纤维素钠：0.8-1.2份
N,N-二环己基碳二亚胺：1.3-1.7份
4-二甲氨基吡啶：1.3-1.8份
甲氧基-聚乙二醇-羧基：1.4-1.8份。
在一些实施方案中，所述阿维菌素纳米农药制剂由以下组分制成：
阿维菌素：3份
羧甲基纤维素钠：1份
N,N-二环己基碳二亚胺：1.5份
4-二甲氨基吡啶：1.5份
甲氧基-聚乙二醇-羧基：1.6份。
在一些实施方案中，所述阿维菌素纳米农药制剂的粒径小于450 nm，载药量为5-8％，优选8％。
在一些实施方案中，所述阿维菌素纳米农药制剂用于防治根结线虫、小菜蛾、稻纵卷叶螟和美国白蛾幼虫，优选美国白蛾幼虫。
本发明进一步提供如上所述的阿维菌素纳米农药制剂的制备方法，所述制备方法包括：
步骤a：使羧甲基纤维素钠反应生成羧甲基纤维素；
步骤b：使步骤a中得到的羧甲基纤维素与N,N-二环己基碳二亚胺、4-二甲氨基吡啶、甲氧基-聚乙二醇-羧基和阿维菌素反应，得到阿维菌素接枝产物；
步骤c：使步骤b中得到的阿维菌素接枝产物进行分子自组装，得到阿维菌素纳米农药制剂。
在一些实施方案中，所述制备方法包括：
步骤a：将羧甲基纤维素钠与硫酸溶液加入到容器中，反应生成羧甲基纤维素；
步骤b：将步骤a中得到的羧甲基纤维素、N,N-二环己基碳二亚胺、4-二甲氨基吡啶和甲氧基-聚乙二醇-羧基置于容器中，反应得到中间产物，随后将阿维菌素溶解于N,N-二甲基甲酰胺中并加入含有中间产物的容器中，反应后将反应产物进行纯化干燥，得到阿维菌素接枝产物；
步骤c：将步骤b中得到的阿维菌素接枝产物溶解于二甲基亚砜中，然后在水中进行分子自组装，随后将产物进行冷冻干燥，得到阿维菌素纳米农药制剂。
在一些实施方案中，步骤a包括：将羧甲基纤维素钠与硫酸溶液加入到容器中，室温下搅拌反应1.5-2.7h，优选1.7-2.3h，更优选2h，随后将产物离心水洗至中性，得到羧甲基纤维素；
优选地，所述硫酸溶液的浓度为15-30％v/v，优选25％v/v。
在一些实施方案中，步骤b包括：将步骤a中得到的羧甲基纤维素、N,N-二环己基碳二亚胺、4-二甲氨基吡啶和甲氧基-聚乙二醇-羧基置于容器中，加入N,N-二甲基甲酰胺，在30-60℃下反应4-6h，优选在32-45℃下反应4.5-5.5h，更优选在35℃下反应5h，得到中间产物，随后将阿维菌素溶解于N,N-二甲基甲酰胺中并加入含有中间产物的容器中，在30-55℃、优选35-45℃、更优选40℃下反应过夜，第二天将反应产物进行纯化，并在30-55℃、优选35-45℃、更优选40 ℃下干燥，得到阿维菌素接枝产物。
在一些实施方案中，步骤c包括：将步骤b中得到的阿维菌素接枝产物溶解于二甲基亚砜中，然后在水中进行分子自组装，在2-4天、优选2.5-3.5天、更优选3天后将产物进行冷冻干燥，得到阿维菌素纳米农药制剂。
本发明的阿维菌素纳米农药制剂的制备反应原理如图9所示。首先，羧甲基纤维素钠(CMC-Na)反应生成羧甲基纤维素(CMC-COOH)，接着甲氧基-聚乙二醇-羧基(mPEG-CM)的PEG长链和CMC-COOH 接枝形成亲水性强的PEG-CMC长链。随后，在DCC/DMAP脱水反应体系中，DCC带孤对电子的氮原子进攻PEG-CMC羧基上的氢原子， DCC的碳原子带正电，羧基氧原子带负电，两者络合在一起。随后，阿维菌素的两个活性羟基被连接到中间体的羰基上，并发生了结构重排，生成一分子二环己基脲，并从结构中解离下来，成为反应副产物。此时，PEG-CMC与阿维菌素通过酯键接枝在一起。其中DCC是一种酯化缩合剂，可以活化羧基并起到脱水的作用，使反应向正方向进行。 DMAP有利于羧酸去质子，增加其亲核能力。另外，在酯酶存在的条件下，阿维菌素纳米农药制剂中的酯键会发生断裂，亲水部分和亲油部分分离，失去两亲性，纳米胶束表面的电荷排斥作用下降，导致其在水中的稳定性下降，从而使其发生聚集并迅速沉降出来。
Figure RE-GDA0002315219890000051
本发明从阿维菌素B1a的分子结构(如式I所示)出发，对阿维菌素B1a的活性羟基部位进行改性，成功制备了具有酯酶响应的阿维菌素纳米农药制剂。与现有技术相比，本发明提供的阿维菌素纳米农药制剂及其制备方法具有以下优势：
1.与阿维菌素原药相比，本发明提供的阿维菌素纳米农药制剂具有较好的抗光降解性能，在氙弧灯下光照72h降解率小于50％，从而极大地提高了有效利用率和生物利用度，减少施药次数和剂量，有利于保护环境和生态安全；
2.与阿维菌素原药相比，本发明提供的阿维菌素纳米农药制剂的水溶性较好，从而减少了施药量，提高了药效及有效利用率；
3.与现有的阿维菌素纳米农药制剂相比，本发明提供的阿维菌素纳米农药制剂在含有酯酶的缓释介质中释放明显加快，具有酯酶响应的缓释特性；
4.与现有的阿维菌素制剂相比，本发明提供的阿维菌素纳米农药制剂的粒径较小，使得阿维菌素纳米农药制剂的比表面积增加，提高了农药与作物表面的接触面积，增加了农药在作物叶面的粘附性与渗透性，有利于农药嵌入到作物叶面的微纳结构中，增强叶面滞留率，减少流失，从而提高了农药的有效利用率和药效，减少喷药剂量与次数；另外，本发明的阿维菌素纳米农药制剂的粒径较小，与害虫靶标的接触面积增加，可增加对害虫靶标的杀虫活性；
5.本发明提供的阿维菌素纳米农药制剂对美国白蛾幼虫具有较好的杀虫效果，且随时间延长敏感性提高；
6.与市售阿维菌素纳米农药制剂相比，本发明提供的阿维菌素纳米农药制剂在植物叶片上的接触角明显减小，在靶标作物叶面上具有较好的展布性能，从而提高了药效；
7.与现有的阿维菌素纳米农药制剂相比，本发明提供的阿维菌素纳米农药制剂采用无污染的原料制备，绿色环保，对环境危害较小，具有良好的应用前景。
附图说明
图1示出了本发明制备阿维菌素纳米农药制剂过程中阿维菌素、中间产物羧甲基纤维素以及终产物阿维菌素纳米农药制剂的红外谱图；
图2示出了本发明的阿维菌素纳米农药制剂的粒径及颗粒分散性；
图3示出了本发明的阿维菌素纳米农药制剂的透射电子显微镜 (TEM)照片；
图4示出了不同制剂在黄瓜叶面上的接触角图像(a：去离子水；b：本发明实施例1制备的阿维菌素纳米农药制剂；c：市售阿维菌素水乳剂；d：市售阿维菌素水分散粒剂)；
图5示出了不同的阿维菌素制剂在黄瓜叶面上的接触角比较(HM：本发明实施例1制备的阿维菌素纳米农药制剂；EW：市售阿维菌素水乳剂；WDG：市售阿维菌素水分散粒剂)；
图6示出了本发明的阿维菌素纳米农药制剂(b)和阿维菌素原药(a)的光降解曲线；
图7示出了本发明的阿维菌素纳米农药制剂(b)、阿维菌素纳米农药制剂(加酯酶)(c)和阿维菌素原药(a)的释放曲线；
图8示出了采用本发明的阿维菌素纳米农药制剂和清水处理24h 后的叶片图像(a：采用清水处理24h后的桑叶；b：采用本发明的阿维菌素纳米农药制剂处理24h后的桑叶)；
图9示出了本发明的阿维菌素纳米农药制剂的制备反应原理。
具体实施方式
以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的药剂原料、试剂材料等，如无特殊说明，均为市售购买产品。
本发明中使用的“阿维菌素”和“阿维菌素原药”具有相同的含义，可互换使用。
仪器
傅里叶红外光谱仪(FTIR，Nicolet IS10，Thermo Fisher Scientific，美国)
动态光散射激光粒度仪(Nano ZS90，Malvern Instruments，英国)
透射电子显微镜(TEM)(HT7700，Hitachi，日本)
紫外分光光度计(UV-2600，Shimadzu，广州科能仪器设备有限公司，中国)
接触角测量仪(JC2000D2M，上海中晨数字技术设备有限公司，中国)
氙弧灯光照培养箱(XT-5409-XPC80，Xutemp，北京西冲科技发展有限公司，中国)
震荡摇床(SW22，JULABO，优莱博技术(北京)有限公司，中国)
试剂
阿维菌素(B1a含量为95％)(齐鲁制药(内蒙古)有限公司，呼和浩特，中国)(本发明实施例和测试例中提到的“阿维菌素”或“阿维菌素原药”均指该药剂)
羧甲基纤维素钠(分子量＝250000，DS＝0.9)(Sigma Aldrich，上海，中国)
硫酸(95％-98％)(北京化工厂，北京，中国)
N,N-二环己基碳二亚胺(DCC)(上海麦克林生化科技有限公司，上海，中国)
4-二甲氨基吡啶(DMAP)(上海麦克林生化科技有限公司，上海，中国)
N,N-二甲基甲酰胺(DMF)(上海麦克林生化科技有限公司，上海，中国)
甲氧基-聚乙二醇-羧基(mPEG-CM)(SINOPEG公司，厦门，中国)
二甲基亚砜(DMSO)(国药集团化学试剂有限公司，上海，中国)
阿维菌素标准品(北京百灵威科技有限公司，北京，中国)
二氯甲烷(色谱纯)(北京百灵威科技有限公司，北京，中国) 阿维菌素水乳剂(石家庄市兴柏生物工程有限公司，石家庄，中国)
阿维菌素水分散粒剂(北京华戎生物激素厂，北京，中国)
去离子水(Milli-Q，15.0MΩ.cm，TOC≤4ppb)
化合物缩写
N,N-二环己基碳二亚胺 DCC
4-二甲氨基吡啶 DMAP
甲氧基-聚乙二醇-羧基 mPEG-CM
羧甲基纤维素 CMC
N,N-二甲基甲酰胺 DMF
二甲基亚砜 DMSO
实施例1阿维菌素纳米农药制剂的制备
将1g羧甲基纤维素钠与40ml硫酸溶液(25％v/v)加入到100mL 烧杯中，室温下搅拌反应2h，随后将产物离心水洗至中性，得到羧甲基纤维素。
将上述得到的1g羧甲基纤维素、1.5g DCC、1.5g DMAP和1.6g mPEG-CM置于圆底烧瓶中，加入30ml DMF，在35℃下反应5h，得到中间产物；随后将3g阿维菌素溶解于20ml DMF中并缓慢加入含有中间产物的圆底烧瓶中，在40℃下反应过夜，第二天将反应产物进行纯化，并在40℃下干燥，得到阿维菌素接枝产物。
将上述得到的阿维菌素接枝产物溶解于DMSO中，然后在水中进行分子自组装，3天后将产物进行冷冻干燥，得到固体粉末状阿维菌素纳米农药制剂。
实施例2阿维菌素纳米农药制剂的制备
将0.5g羧甲基纤维素钠与40ml硫酸溶液(25％v/v)加入到100mL 烧杯中，室温下搅拌反应1.5h，随后将产物离心水洗至中性，得到羧甲基纤维素。
将上述得到的0.5g羧甲基纤维素、1.3g DCC、1.3g DMAP和1.8g mPEG-CM置于圆底烧瓶中，加入30ml DMF，在32℃下反应5.5h，得到中间产物；随后将2g阿维菌素溶解于15mlDMF中并缓慢加入含有中间产物的圆底烧瓶中，在30℃下反应过夜，第二天将反应产物进行纯化，并在30℃下干燥，得到阿维菌素接枝产物。
将上述得到的阿维菌素接枝产物溶解于DMSO中，然后在水中进行分子自组装，2.5天后将产物进行冷冻干燥，得到固体粉末状阿维菌素纳米农药制剂。
实施例3阿维菌素纳米农药制剂的制备
将0.8g羧甲基纤维素钠与40ml硫酸溶液(15％v/v)加入到100mL 烧杯中，室温下搅拌反应1.7h，随后将产物离心水洗至中性，得到羧甲基纤维素。
将上述得到的0.8g羧甲基纤维素、1g DCC、0.9g DMAP和1.4g mPEG-CM置于圆底烧瓶中，加入30ml DMF，在30℃下反应6h，得到中间产物；随后将2.4g阿维菌素溶解于17mlDMF中并缓慢加入含有中间产物的圆底烧瓶中，在35℃下反应过夜，第二天将反应产物进行纯化，并在45℃下干燥，得到阿维菌素接枝产物。
将上述得到的阿维菌素接枝产物溶解于DMSO中，然后在水中进行分子自组装，2天后将产物进行冷冻干燥，得到固体粉末状阿维菌素纳米农药制剂。
实施例4阿维菌素纳米农药制剂的制备
将1.5g羧甲基纤维素钠与40ml硫酸溶液(25％v/v)加入到100mL 烧杯中，室温下搅拌反应2.7h，随后将产物离心水洗至中性，得到羧甲基纤维素。
将上述得到的1.5g羧甲基纤维素、1.7g DCC、1.8g DMAP和1g mPEG-CM置于圆底烧瓶中，加入30ml DMF，在45℃下反应4.5h，得到中间产物；随后将3.4g阿维菌素溶解于25mlDMF中并缓慢加入含有中间产物的圆底烧瓶中，在45℃下反应过夜，第二天将反应产物进行纯化，并在35℃下干燥，得到阿维菌素接枝产物。
将上述得到的阿维菌素接枝产物溶解于DMSO中，然后在水中进行分子自组装，3.5天后将产物进行冷冻干燥，得到固体粉末状阿维菌素纳米农药制剂。
实施例5阿维菌素纳米农药制剂的制备
将1.2g羧甲基纤维素钠与40ml硫酸溶液(30％v/v)加入到100mL 烧杯中，室温下搅拌反应2.3h，随后将产物离心水洗至中性，得到羧甲基纤维素。
将上述得到的1.2g羧甲基纤维素、2g DCC、2.2g DMAP和2.1g mPEG-CM置于圆底烧瓶中，加入30ml DMF，在60℃下反应4h，得到中间产物；随后将4.1g阿维菌素溶解于30mlDMF中并缓慢加入含有中间产物的圆底烧瓶中，在55℃下反应过夜，第二天将反应产物进行纯化，并在55℃下干燥，得到阿维菌素接枝产物。
将上述得到的阿维菌素接枝产物溶解于DMSO中，然后在水中进行分子自组装，4天后将产物进行冷冻干燥，得到固体粉末状阿维菌素纳米农药制剂。
测试例1阿维菌素纳米农药制剂的组成成分测试
将本发明实施例1制备的阿维菌素纳米农药制剂与溴化钾混合，研磨并压片，置于傅里叶红外光谱仪中测试红外谱图(扫描次数32，分辨率4cm-1)。
图1示出了本发明实施例1制备阿维菌素纳米农药制剂过程中阿维菌素(Av)、中间产物羧甲基纤维素(CMC)以及终产物阿维菌素纳米农药制剂(PEG-CMC-Av)的红外谱图。如图1所示，在羧甲基纤维素的红外谱图中，1678cm-1处为羧基中C＝O的伸缩振动峰。在阿维菌素的红外谱图中，3467cm-1处为羟基的伸缩振动峰。在最终的接枝产物阿维菌素纳米农药制剂(PEG-CMC-Av)的红外谱图中， 1678cm-1处吸收峰消失，3467cm-1处羟基吸收峰变得很微弱，但在 1750cm-1处出现了新的特征峰，而1750cm-1处的特征峰即为最终接枝产物上酯键的C＝O吸收峰，以上数据证明了阿维菌素与mPEG-CM 和CMC(PEG-CMC-Av)接枝成功。
测试例2阿维菌素纳米农药制剂的形貌表征
将本发明实施例1制备的阿维菌素纳米农药制剂用去离子水稀释至0.05％，室温下，利用动态光散射激光粒度仪测定阿维菌素纳米农药制剂的水合粒径和多分散性指数PDI，每个样品测量三次，取其平均值。
将本发明实施例1制备的阿维菌素纳米农药制剂用去离子水稀释至0.005％，在80kv的加速电压下，吸取溶液滴加至镀有碳膜的300 目铜网，室温状态下自然晾干，使用透射电子显微镜来表征阿维菌素纳米农药制剂的结构。
图2示出了本发明实施例1制备的阿维菌素纳米农药制剂的粒径及颗粒分散性。从图2中看出，阿维菌素纳米农药制剂的平均水合粒径为394.1±26.15nm，多分散性指数PDI为0.262，小于0.3，表明本发明制备的阿维菌素纳米农药制剂的颗粒分布均匀。
图3示出了本发明实施例1制备的阿维菌素纳米农药制剂的透射电子显微镜(TEM)照片。从图3中看出，本发明制备的阿维菌素纳米农药制剂呈棒状结构，无明显的粒子间团聚。采用动态光散射激光粒度仪测得的水合粒径与采用透射电子显微镜测得的实际粒径基本一致。
测试例3阿维菌素纳米农药制剂的载药量测定
本发明采用紫外分光光度法测量阿维菌素纳米农药制剂的载药量。取10mg阿维菌素标准品定容在50mL二氯甲烷中，超声使其完全溶解，配制成浓度为200mg/L的母液，将母液梯度稀释得到1.25 mg/L、2.5mg/L、5mg/L、10mg/L、20mg/L的标准样品。以二氯甲烷为空白对照，分别吸取2mL标准样品，在紫外分光光度计上测得其吸光度值，采用OriginPro9.0将阿维菌素浓度与测得的吸光度值进行线性拟合绘制出标准曲线。称取微量本发明实施例制备的阿维菌素纳米农药制剂，不断地超声和震荡直至其完全溶解于二氯甲烷中，取出2mL测量吸光度值，根据标准曲线方程计算溶液中阿维菌素的浓度，进而得出负载的阿维菌素的量。载药量公式计算如下：
载药量(％)＝阿维菌素的有效质量/阿维菌素纳米农药制剂的总质量×100
实验测试得到本发明实施例制备的阿维菌素纳米农药制剂的载药量如下表1所示。
表1本发明实施例制备的阿维菌素纳米农药制剂的载药量
实施例1 实施例2 实施例3 实施例4 实施例5
载药量 8％ 7％ 7.1％ 7.5％ 5％
测试例4阿维菌素纳米农药制剂的接触角测试
分别采用接触角测量仪测定本发明实施例1制备的阿维菌素纳米农药制剂、市售阿维菌素水乳剂、市售阿维菌素水分散粒剂以及去离子水在黄瓜叶面上的接触角。将上述药液分别用去离子水稀释至0.1％，在室温下将7μL溶液滴在新鲜叶片表面上进行测量，待叶面上的液滴状态稳定后，采集药液与叶片的接触角图像，并使用五点拟合法分析药液与叶片的接触角，每种药液重复测试5次取其平均值。
图4示出了不同制剂在黄瓜叶面上的接触角图像(a：去离子水； b：本发明实施例1制备的阿维菌素纳米农药制剂；c：市售阿维菌素水乳剂；d：市售阿维菌素水分散粒剂)。图5示出了不同的阿维菌素制剂在黄瓜叶面上的接触角比较(HM：本发明实施例1制备的阿维菌素纳米农药制剂；EW：市售阿维菌素水乳剂；WDG：市售阿维菌素水分散粒剂；字母*表示实验组间统计学存在显著性差异(单因素方差分析，LSD检验，*P＜0.05))。从图4及图5中看出，去离子水在黄瓜叶面上的接触角为91±3.0°，本发明实施例1制备的阿维菌素纳米农药制剂、市售阿维菌素水乳剂、市售阿维菌素水分散粒剂在黄瓜叶面上的接触角分别为75±2.8°、76±2.6°、80±2.3°。液滴的接触角越小表明其越容易在靶标作物叶面扩散和展布。与市售阿维菌素水分散粒剂相比，本发明的阿维菌素纳米农药制剂在黄瓜叶面上的接触角减小，且存在显著差异；而与市售阿维菌素水乳剂相比，本发明的阿维菌素纳米农药制剂在黄瓜叶面上的接触角略微减小，不存在显著性差异，这是因为市售阿维菌素水乳剂配方中添加润湿剂等造成的。
测试例5阿维菌素纳米农药制剂的抗光解性能测试
用精密天平准确称取阿维菌素原药和本发明实施例1制备的阿维菌素纳米农药制剂各30mg置于塑料培养皿中，随后放入氙弧灯光照培养箱中照射，25℃，250W条件下连续光照，分别于12h、24h、36h、 48h、60h、72h取出样品，使其超声震荡完全溶于二氯甲烷中，用紫外分光光度法根据标准曲线方程进行浓度测定，重复三次，求出平均值，计算光解率。
图6示出了本发明实施例1制备的阿维菌素纳米农药制剂(b) 和阿维菌素原药(a)的光降解曲线。从图6中看出，阿维菌素原药的降解速率明显高于本发明的阿维菌素纳米农药制剂，光照72h后，本发明的阿维菌素纳米农药制剂的降解率小于50％。这是因为本发明的阿维菌素纳米农药制剂为接枝后的产物，其同时含有亲水基团和疏水基团，其中的长链PEG-CMC具有很强的亲水性，而阿维菌素原药难溶于水。在透析袋内外的水溶液不断交换的过程中，阿维菌素会受到水分子的排斥聚集在一起形成内壳，而亲水性很强的PEG-CMC会包裹形成胶束外壳。由于胶束外面带相同的电荷，彼此排斥，使胶束保持着稳定的分散状态。本发明阿维菌素纳米农药制剂的制备使阿维菌素避免了光的直接作用，从而达到了缓解光照降解的效果。
测试例6阿维菌素纳米农药制剂的酯酶响应缓释特性测定
为了测定阿维菌素纳米农药制剂的智能响应缓控释特性，通过透析法测定阿维菌素纳米农药制剂在不同时间的累计释放量，具体方法如下：采用精密天平准确称取阿维菌素原药20mg、本发明实施例1 制备的阿维菌素纳米农药制剂20mg、本发明实施例1制备的阿维菌素纳米农药制剂20mg(加入0.25mg酯酶)三个样品，用5mL 50％甲醇溶解，置于处理过的透析袋(8000-14000D)中，分别悬浮于含有90mL 50％甲醇溶液的棕色试剂瓶中，放置于25℃恒温震荡摇床内，每隔一段时间，取出5mL溶液测定吸光度，再补充5mL新的50％甲醇溶液进去，保证取完样后反应瓶中的溶液还是95mL。
图7示出了本发明的阿维菌素纳米农药制剂(b)、阿维菌素纳米农药制剂(加酯酶)(c)和阿维菌素原药(a)的释放曲线。从图 7中看出，阿维菌素原药在缓释介质中的释放速度很快，27h释放率达到80％以上，而本发明的阿维菌素纳米农药制剂表现出良好的缓释效果，103h时释放率不到70％，这有利于延长农药持效期。而在含有酯酶的缓释介质中本发明的阿维菌素纳米农药制剂的释放明显加快。这是因为在酯酶存在的条件下，阿维菌素纳米农药制剂中的酯键发生断裂，亲水部分和亲油部分分离，失去两亲性，纳米胶束表面的电荷排斥作用下降，导致其在水中的稳定性下降，从而使其发生聚集并迅速沉降出来。由此表明，本发明的阿维菌素纳米农药制剂具有酯酶响应缓释特性。
测试例7阿维菌素纳米农药制剂的室内毒力测定
在预试验的基础上，将本发明实施例1制备的阿维菌素纳米农药制剂用含0.1％曲拉通的纯净水按等比配制成6个系列浓度梯度(25 mg/L、12.5mg/L、6.25mg/L、3.125mg/L、1.5625mg/L、0.7813mg/L)，起始浓度为25mg/L，并设不含药剂的相应的处理溶液作为空白对照。将桑叶叶片正面贴于直径为6.5cm的培养皿内，用毛笔小心挑取3 龄美国白蛾幼虫接到叶片上，每皿10头，在距离培养皿30厘米处用喉头喷雾器进行叶面喷雾，每皿喷3下，然后将培养皿盖好，放入温度25℃、光照为16：8(L：D)的人工气候室内饲养，分别于施药后24h、48h、72h时检查死亡情况。每浓度设4次重复。毒力测定试验用DPS v12.01统计软件计算毒力回归方程、半致死浓度(LC50)及其95％置信区间。
图8示出了采用本发明的阿维菌素纳米农药制剂和清水处理24h 后的叶片图像(a：采用清水处理24h后的桑叶；b：采用本发明的阿维菌素纳米农药制剂处理24h后的桑叶)。从图8中看出，与采用清水处理24h后的桑叶相比，采用本发明的阿维菌素纳米农药制剂处理 24h后的桑叶上的美国白蛾明显减少，且随时间的延长各浓度处理的死亡率显著提高。另外，采用本发明的阿维菌素纳米农药制剂处理后 24小时的校正死亡率在14.5％-37.5％之间，72小时的校正死亡率在 9.1％-97.0％之间，并且不同浓度处理的死亡率在72小时表现出明显的相关性。以上结果表明，本发明的阿维菌素纳米农药制剂对美国白蛾幼虫具有显著的杀虫效果，且杀虫效果与药剂浓度相关。
表2示出了本发明的阿维菌素纳米农药制剂对美国白蛾的室内毒力测定结果。根据表2可知，采用本发明的阿维菌素纳米农药制剂处理后24小时的LC50为57.0746mg/L，48小时的LC50为26.9230mg/L， 72小时的LC50为4.2645mg/L，72小时的毒力分别是24小时的13.38 倍，48小时的6.31倍。以上结果表明，本发明的阿维菌素纳米农药制剂对美国白蛾幼虫具有显著的杀虫效果，且随时间的延长敏感性提高。
表2本发明的阿维菌素纳米农药制剂对美国白蛾的室内毒力测定结果
Figure RE-GDA0002315219890000161
本发明提供的阿维菌素纳米农药制剂粒径小、颗粒分布均匀，载药量较高。另外，本发明的阿维菌素纳米农药制剂在叶面上的接触角较小，具有良好的抗光解性能，并具有酯酶响应缓释特性，当含有酯键的阿维菌素纳米农药制剂进入害虫体内时，在酯酶的作用下，阿维菌素纳米农药制剂中的阿维菌素可以快速释放出来并起到高效杀虫作用。此外，本发明的阿维菌素纳米农药制剂对美国白蛾幼虫具有显著的杀虫效果。本发明的阿维菌素纳米农药制剂在一定程度上解决了阿维菌素制剂目前存在的水溶性差和易光解等问题，减少了有机溶剂的使用，是一种绿色高效的农药控释剂，具有良好的应用前景。
尽管本文中已经示出并描述了本发明的优选实施方案，但对于本领域技术人员显而易见的是这些实施方案仅以示例的方式提供。本领域技术人员在不脱离本发明的情况下现将想到多种变化、改变和替代。应当理解本文中所述的本发明实施方案的各种替代方案可用于实施本发明。目的在于以下述权利要求限定本发明的范围，并由此涵盖这些权利要求范围内的方法和结构及其等同项。

Claims (10)

1.一种阿维菌素纳米农药制剂，其制备原料按重量计包含以下组分：
阿维菌素：2.4-3.4份
羧甲基纤维素钠：0.8-1.2份
N,N-二环己基碳二亚胺：1.3-1.7份
4-二甲氨基吡啶：1.3-1.8份
甲氧基-聚乙二醇-羧基：1.4-1.8份；
所述阿维菌素纳米农药制剂的制备方法包括：
步骤a：将羧甲基纤维素钠与硫酸溶液加入到容器中，室温下搅拌反应1.7-2.3h，随后将产物离心水洗至中性，得到羧甲基纤维素；其中所述硫酸溶液的浓度为25％v/v；
步骤b：将步骤a中得到的羧甲基纤维素、N,N-二环己基碳二亚胺、4-二甲氨基吡啶和甲氧基-聚乙二醇-羧基置于容器中，加入N,N-二甲基甲酰胺，在32-45℃下反应4.5-5.5h，得到中间产物，随后将阿维菌素溶解于N,N-二甲基甲酰胺中并加入含有中间产物的容器中，在35-45℃下反应过夜，第二天将反应产物进行纯化，并在35-45℃下干燥，得到阿维菌素接枝产物；
步骤c：将步骤b中得到的阿维菌素接枝产物溶解于二甲基亚砜中，然后在水中进行分子自组装，在2.5-3.5天后将产物进行冷冻干燥，得到阿维菌素纳米农药制剂。
2.根据权利要求1所述的阿维菌素纳米农药制剂，其特征在于，所述阿维菌素纳米农药制剂的制备原料按重量计包含以下组分：
阿维菌素：3份
羧甲基纤维素钠：1份
N,N-二环己基碳二亚胺：1.5份
4-二甲氨基吡啶：1.5份
甲氧基-聚乙二醇-羧基：1.6份。
3.根据权利要求1或2所述的阿维菌素纳米农药制剂，其特征在于，所述阿维菌素纳米农药制剂的粒径小于450nm，载药量为5-8％。
4.根据权利要求3所述的阿维菌素纳米农药制剂，其特征在于，所述阿维菌素纳米农药制剂的载药量为8％。
5.根据权利要求1或2所述的阿维菌素纳米农药制剂，其特征在于，所述阿维菌素纳米农药制剂用于防治根结线虫、小菜蛾、稻纵卷叶螟和美国白蛾幼虫。
6.根据权利要求5所述的阿维菌素纳米农药制剂，其特征在于，所述阿维菌素纳米农药制剂用于防治美国白蛾幼虫。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的阿维菌素纳米农药制剂的制备方法，所述制备方法包括：
步骤a：将羧甲基纤维素钠与硫酸溶液加入到容器中，室温下搅拌反应1.7-2.3h，随后将产物离心水洗至中性，得到羧甲基纤维素；其中所述硫酸溶液的浓度为25％v/v；
步骤b：将步骤a中得到的羧甲基纤维素、N,N-二环己基碳二亚胺、4-二甲氨基吡啶和甲氧基-聚乙二醇-羧基置于容器中，加入N,N-二甲基甲酰胺，在32-45℃下反应4.5-5.5h，得到中间产物，随后将阿维菌素溶解于N,N-二甲基甲酰胺中并加入含有中间产物的容器中，在35-45℃下反应过夜，第二天将反应产物进行纯化，并在35-45℃下干燥，得到阿维菌素接枝产物；
步骤c：将步骤b中得到的阿维菌素接枝产物溶解于二甲基亚砜中，然后在水中进行分子自组装，在2.5-3.5天后将产物进行冷冻干燥，得到阿维菌素纳米农药制剂。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，步骤a包括：将羧甲基纤维素钠与硫酸溶液加入到容器中，室温下搅拌反应2h，随后将产物离心水洗至中性，得到羧甲基纤维素。
9.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，步骤b包括：将步骤a中得到的羧甲基纤维素、N,N-二环己基碳二亚胺、4-二甲氨基吡啶和甲氧基-聚乙二醇-羧基置于容器中，加入N,N-二甲基甲酰胺，在35℃下反应5h，得到中间产物，随后将阿维菌素溶解于N,N-二甲基甲酰胺中并加入含有中间产物的容器中，在40℃下反应过夜，第二天将反应产物进行纯化，并在40℃下干燥，得到阿维菌素接枝产物。
10.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，步骤c包括：将步骤b中得到的阿维菌素接枝产物溶解于二甲基亚砜中，然后在水中进行分子自组装，在3天后将产物进行冷冻干燥，得到阿维菌素纳米农药制剂。
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