CN105340919B

CN105340919B - 一种喜树碱‑阿维菌素二氧化硅纳米粒子及其制备方法和用途

Info

Publication number: CN105340919B
Application number: CN201510658042.9A
Authority: CN
Inventors: 杨柳
Original assignee: Lanzhou Jiaotong University
Current assignee: Lanzhou Jiaotong University
Priority date: 2015-10-13
Filing date: 2015-10-13
Publication date: 2017-09-29
Anticipated expiration: 2035-10-13
Also published as: CN105340919A

Abstract

本发明公开一种新的喜树碱‑阿维菌素二氧化硅纳米粒子包合药物，以及它的制备方法和其在制备农药中的用途。本发明的喜树碱‑阿维菌素二氧化硅纳米粒子的制备方法是：首先制备出mPEG₅₀₀‑COOH(2)，再制备出粗品，再将350mg阿维菌素、mPEG₅₀₀‑COOH和4‑二甲氨基吡啶(DMAP)用二氯甲烷溶解并搅拌再加入二环己基碳二亚胺(DCC)，最终得到一浅黄色的油状物一喜树碱‑阿维菌素二氧化硅纳米粒子AVM‑mPEG₅₀₀。用本发明的方法制备的喜树碱‑阿维菌素二氧化硅纳米粒子可在农药方面的应用，如用于杀灭朱砂叶螨或小菜蛾等农作物害虫。

Description

一种喜树碱-阿维菌素二氧化硅纳米粒子及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及一种新的喜树碱-阿维菌素二氧化硅纳米粒子包合药物，以及它的制备方法和其在制备农药中的用途。

背景技术

农药的推广对于农业生产有着重要意义，同时也是我国国民经济中不可缺少的一个产业。农药一般可分为化学农药和生物农药，目前我国使用最多的是化学农药。然而化学农药的毒性大，对环境污染也日趋严重，而且由于长期、单一使用或滥用杀虫剂，极易使害虫产生抗药性，甚至发展为交互抗性和多抗性(Hilder V.A.,et al.Crop Protection,1999,18:177-191)。据统计，从1910年到2010年的百年之间，抗药害虫已从1种增加至600多种，其中80％是昆虫和螨类。抗药性的出现不仅严重降低了农药的效力，造成生产成本增加，防治效果下降等不良影响，而且还会因为盲目增加农药剂量而加重对环境的污染及影响生态平衡。将两种或多种作用方式和作用机制不同的农药复配，可以减缓害虫抗药性的发生，是克服害虫抗药性的关键；此外，农药复配还能兼治多种病虫害，增强药效，减少农药使用量，降低成本，减少对环境的污染。例如代森锰锌与瑞毒霉复配、多菌灵与灭菌丹复配、有机磷类与拟除虫菊酯类复配等，都是比较成功的农药复配方案(王肖娟，等.安徽农业科学，2007，35：3902-3904)。

然而，农药常规剂型一般利用率只有20％～30％，在释放到靶标物过程中的损失率在50％～60％(杨蕾，等.农药科学与管理，2009，30：36-39)。农药常规剂型存在有效成分释放速度快、药效持续时间短、用药量大等缺点，不仅在经济上是一种浪费，而且造成了环境污染。因此，对农药剂型进行改进是提高农药利用率，降低农药残留的有效途径之一。近年来，关于满足农药延长和更好控制药物释放的需要的新型制剂越来越受到更多的关注。缓释制剂能限制减少药物流失和表面迁移，导致农药使用量减少，现已成为药物传递系统研究的焦点(Benita S.,et.Dekker:New York,2004)。

发明内容

本发明提供一种可以用做农药且具有缓释作用的的喜树碱-阿维菌素二氧化硅纳米粒子的制备方法。

本发明的一种喜树碱-阿维菌素二氧化硅纳米粒子的制备方法是：

a.在氮气保护下，将5g聚乙二醇单甲醚用50mL干燥二氯甲烷搅拌溶解，然后加入5g丁二酸酐、4mL干燥吡啶，加热至40℃，充分回流反应，回流完毕后，冷却至室温进行干燥处理，再在其中加适量蒸馏水溶解，用体积比为1:1的乙酸乙酯/正己烷洗涤，水相再用氯仿萃取，合并萃取液用无水硫酸镁干燥处理，经过滤和蒸馏浓缩得到mPEG₅₀₀-COOH(2)；

b.将a步骤所得到的mPEG₅₀₀-COOH1mmol用10mL干燥二氯甲烷搅拌溶解，在0℃下，依次加入348mg的喜树碱、122mg的4-二甲氨基吡啶和0.17mL N,N′-二异丙基碳二亚胺，继续在0℃下反应2h，撤去冰浴，缓慢升至室温，继续搅拌反应16h，待反应完毕后，过滤，滤液用0.1N HCl洗涤，再有机相用无水硫酸镁干燥过夜，过滤、蒸馏旋干得粗品，将所得到的粗品用洗脱剂：氯仿/甲醇＝20:1柱层析纯化；

c.将350mg阿维菌素、245mg mPEG₅₀₀-COOH和50mg 4-二甲氨基吡啶(DMAP)(0.4mmol)，用10mL干燥的二氯甲烷溶解并搅拌，在0℃下，分批加入90.6mg二环己基碳二亚胺(DCC)(0.44mmol)，继续搅拌2h，撤去冰浴，缓慢升至室温，并在室温搅拌反应过夜，待反应完毕，加入适量的氯仿稀释，过滤，滤液依次用0.1N盐酸和蒸馏水洗涤数次，无水硫酸镁干燥，过滤，减压旋干，最后柱层析纯化，用氯仿/甲醇10:1，得到一浅黄色的油状物一喜树碱-阿维菌素二氧化硅纳米粒子AVM-mPEG₅₀₀。

用本发明的方法制备的喜树碱-阿维菌素二氧化硅纳米粒子可在农药方面的应用，如用于杀灭朱砂叶螨或小菜蛾等农作物害虫。

在缓慢释放药物传递系统中，由于其无毒属性和释药性能，如介孔结构稳定性、比表面高、孔道容量大、纳米孔道尺寸规则及其孔隙表面含有丰富的Si-OH键来负载和释放药物分子，介孔二氧化硅材料有潜力广泛应用于药物载体((1)Hata H.,et al.Chemistryof Materials,1999,11:1110-1119；(2)Munoz B.,et al.Chemistry of Materials,2003,15:500-503；(3)Fisher K.,et al.Chemistry–A European Journal,2003,9:5873-5878；(4)Tiseanu C.,et al.the Journal of Physical Chemistry C,2009,113:5784-5791)。最近，介孔硅胶作为药物传递系统的新应用已经得到探索((1)Fu Q.,et al.AdvancedMaterials,2003,15:1262-1266；(2)Andersson J.,et al.Chemistry of Materials,2004,16:4160-4167；(3)Arcos D.,et al.Chemistry of Materials,2009,21:1000-1009；(4)Doadrio A.,et al.Journal of Controlled Release,2004,97:125-132；(5)Shih C.,et al.Materials Science and Engineering:C,2010,30:657-663)。因这些系统能够增加生物利用度和降低难吸收药物的剂量，应用于药物传递系统的典型的介孔材料，如SBA-15和MCM-41，已经得到很好的研究。它们的介孔结构特征使得其可以在一个控制的比例下负载和释放药物((1)Doadrio A.,et al.Journal of Controlled Release,2004,97:125-132；(2)Horcajada P.,et al.Microporous Mesoporous Mater,2004,68:105-109)。然而，这些传统的介孔材料的载药容量却相对较低((1)El-Safty S.,et al.Chemistry ofMaterials,2003,15:2892-2902；(2)El-Safty S.,et al.Chemistry of Materials,2004,16:384-400)。

鉴于此，为了提高二氧化硅纳米粒子的载药量，本发明沿用双模板剂法制备二氧化硅纳米粒子的思路，以农药-聚合物的两亲性共聚物(喜树碱-PEG和阿维菌素-PEG)和阳离子表面活性剂CTAB为双重模板剂，制备成二氧化硅纳米粒子(CPT-mPEG₅₀₀/AVM-mPEG₅₀₀/CTAB@MSN)，直接将农药包埋在里面，以达到缓释的效果；而且，二氧化硅对紫外线反射率高达70％～80％，稳定性好，对遇光容易分解的农药可以起到很好的保护作用。此外，将植物源农药喜树碱与生物源农药阿维菌素联合使用，制备成双核纳米农药，经生物活性测试结果表明：该双核纳米农药对朱砂叶螨和小菜蛾的毒杀活性均要强于两种母药喜树碱和阿维菌素。

附图说明

附图1为本发明的负载喜树碱和阿维菌素的二氧化硅纳米粒子的制备及其生物活性测试示意图。

附图2为AVM-mPEG₅₀₀(a)、CPT-mPEG₅₀₀(b)、MCM-41(c)和CPT-mPEG₅₀₀/AVM-mPEG₅₀₀/CTAB@MSN(d)的红外光谱图。

附图3为CPT-mPEG₅₀₀/AVM-mPEG₅₀₀/CTAB@MSN(a),CPT-mPEG₅₀₀(b)和AVM-mPEG₅₀₀(c)的TEM图像。

附图4为CPT-mPEG₅₀₀/AVM-mPEG₅₀₀/CTAB@MSN在水中的释放曲线。

具体实施方式

以下结合实施例及实验对本发明进行详细解说。

实施例1：CPT-mPEG₅₀₀和AVM-mPEG₅₀₀衍生物的合成

1)CPT-mPEG₅₀₀衍生物(3)的合成

式1

在氮气保护下，往100mL圆底烧瓶中加入5g mPEG₅₀₀(聚乙二醇单甲醚)(10mmol)，用50mL干燥二氯甲烷搅拌溶解，然后加入5g丁二酸酐(50mmol)、4mL干燥吡啶(50mmol)，加热至40℃，回流三天。待回流完毕后，冷却至室温，减压蒸馏旋干，加适量蒸馏水溶解，用乙酸乙酯/正己烷(1:1)洗涤数次。水相再用氯仿萃取3次，合并萃取液，无水硫酸镁干燥过夜，过滤，减压蒸馏浓缩得到mPEG₅₀₀-COOH(2)。

于100mL圆底烧瓶中加入mPEG₅₀₀-COOH(1mmol)，用10mL干燥二氯甲烷搅拌溶解。在0℃下，依次加入348mg喜树碱(1mmol)、122mg 4-二甲氨基吡啶(DMAP)(1mmol)、0.17mLN,N′-二异丙基碳二亚胺(DIPC)(1mmol)，继续在0℃下反应2h。撤去冰浴，缓慢升至室温，继续搅拌反应16h。待反应完毕后，过滤，滤液用0.1N HCl洗涤三次，有机相用无水硫酸镁干燥过夜，过滤，减压蒸馏旋干得粗品。柱层析纯化(洗脱剂：氯仿/甲醇＝20:1)。

CPT-mPEG₅₀₀:黄色固体，收率85％；IRν:3445.7,2941.3,2872.8,1753.0,1672.2,1623.8,1562.4,1458.1cm^-1；¹H-NMR(400MHz,CDCl₃):δ8.38(1H,s,H-7),8.20(1H,d,J＝8.4Hz,H-12),7.92(1H,d,J＝8.4Hz,H-9),7.81(1H,t,J＝7.2Hz,H-10),7.64(1H,t,J＝7.2Hz,H-11),7.25(1H,s,H-14),5.51(2H,ABq,J＝17.2Hz,H-17),5.25(2H,s,H-5),4.26-4.16(2H,m),3.87-3.79(2H,m),3.61(30H,br,mPEG),3.35(3H,s,mPEG-OCH₃),2.85-2.81(2H,m,J＝7.4Hz,mPEG),2.66(2H,t,J＝6.8Hz,mPEG),2.26-2.10(2H,m,H-19),0.97(3H,t,J＝7.6Hz,H-18)；¹³C-NMR(400MHz,CDCl₃):δ171.87,171.41,167.49,157.46,157.11,152.50,148.97,146.36,146.00,131.28,130.75,129.73,128.60,128.34,128.27,128.12,120.14,96.34,76.35,72.04,70.65,69.07,67.14,64.11,59.15,50.04,42.15,31.87,28.98,23.63,7.73.

2)AVM-mPEG₅₀₀衍生物(3)的合成

于50mL圆底烧瓶中依次加入350mg阿维菌素(0.4mmol)、245mg mPEG₅₀₀-COOH(0.44mmol)、50mg DMAP(0.4mmol)，用10mL干燥的二氯甲烷溶解，搅拌。在0℃下，分批加入90.6mg DCC(0.44mmol)，继续搅拌2h。撤去冰浴，缓慢升至室温，并在室温搅拌反应过夜，TLC检测。待反应完毕，加入适量的氯仿稀释，过滤。滤液依次用0.1N盐酸和蒸馏水洗涤数次，无水硫酸镁干燥，过滤，减压旋干，最后柱层析纯化(氯仿/甲醇10:1)，最后收得一浅黄色的油状物。

AVM-mPEG₅₀₀:黄色油状物，收率为47％；IRν:3429.1,2926.3,2875.3,2370.8,1756.8,1737.4,1655.8,1452.8cm^-1；¹H-NMR(400MHz,CDCl₃):δ5.86(1H,d,J＝8.4Hz,9-H),5.78-5.72(3H,m,10,11,23-H),5.56(1H,d,22-H),5.41(3H,brs,3,19,1″-H),4.97(1H,brs.15-H),4.77(1H,s,1′-H),4.77-4.58(2H,m,8a-H),4.29(1H,s,5-H),4.18-4.08(3H,m,7,5,4″-OH),3.98-3.94(2H,m,6,13-H),3.86-3.84(2H,m,17,5′-H),3.75-3.71(1H,m,5″-H),3.70-3.68(1H,m,3′-H),3.66(84H,brs,mPEG),3.54-3.56(2H,m,25,3″-H),3.44(3H,s,3″-OCH₃),3.42(3H,s,3′-OCH₃),3.38(3H,s,mPEG-OCH₃),3.35(1H,s,2-H),3.30-3.23(1H,m,4″-H),3.17(1H,s,4′-H),2.52(1H,m,12-H),2.37-2.26(5H,m,16,24,2′-H),2.04(1H,s,20-H),1.88(3H,s,4-Me),1.78(1H,s,18-H),1.66-1.43(9H,m,20,26,27,2″-H,14-Me),1.28-1.26(6H,m,5′,5″-Me),1.18-1.16(3H,s,12-Me),0.96-0.87(10H,m,24,26,27-Me,18a-H)；¹³C-NMR(400MHz,CDCl₃):δ173.68,170.08,139.69,139.15,137.95,136.20,135.14,127.72,124.67,121.10,120.31,118.32,117.97,98.29,95.72,94.92,81.95,80.77,80.53,79.20,78.14,76.07,75.39,74.89,71.88,71.19,70.82,70.74,70.51,68.53,68.30,68.18,67.10,66.23,58.94,56.64,56.45,55.89,49.75,45.60,40.44,39.69,36.51,35.13,34.91,34.43,34.18,32.59,30.64,30.52,29.60,27.45,27.25,26.25,25.46,25.23,24.65,20.14,19.87,18.33,17.40,16.31,15.05,12.89,11.96.。

实施例2：负载喜树碱和阿维菌素的二氧化硅纳米粒子(CPT-mPEG₅₀₀/AVM-mPEG₅₀₀/CTAB@MSN)的制备及表征

1)CPT-mPEG₅₀₀/AVM-mPEG₅₀₀/CTAB@MSN的制备

于100mL圆底烧瓶中加入50mg CPT-mPEG₅₀₀和50mgAVM-mPEG₅₀₀，用30mL去离子水溶解，待溶解后继续搅拌1h，往混合体系中加入200mg CTAB、2mL三乙胺，溶解后继续搅拌2h。然后将600mg TEOS逐滴加入，加完之后，室温条件下搅拌24h。有淡黄色的沉淀生成。离心(9000r/min,10min)，真空干燥，最后收得一黄色固体粉末。

2)载药试验

收集CPT-mPEG₅₀₀/AVM-mPEG₅₀₀/CTAB@MSN离心后的溶液，基于喜树碱和阿维菌素分别在365和252nm紫外的特征吸收峰，分别做CPT-mPEG₅₀₀和AVM-mPEG₅₀₀的浓度与365和252nm吸光度标准线，通过测得的吸光度，计算出其浓度及质量，从而算出载药率。其公式如下：

式3

2-2)CPT-mPEG500/AVM-mPEG500/CTAB@MSN的载药量

表1 1g CRT-mPEG₅₀₀/AVM-mPEG₅₀₀/CTAB@MSN中各组分的含量

用紫外吸收光谱仪测定上清液中CPT-mPEG₅₀₀、AVM-mPEG₅₀₀和CTAB的含量，然后计算得到CPT-mPEG₅₀₀/AVM-mPEG₅₀₀/CTAB@MSN中各组分的含量及其载药率(表1)。由表1中的数据可以看出，CPT-mPEG₅₀₀和AVM-mPEG₅₀₀在该二氧化硅纳米粒子里的含量分别为1g二氧化硅纳米粒子中含有54.8mg CPT-mPEG₅₀₀和121.2mgAVM-mPEG₅₀₀，即1g二氧化硅纳米粒子中含有19.8mg喜树碱和63.6mg阿维菌素。而且该二氧化硅纳米粒子负载阿维菌素的含量要比喜树碱的大，是喜树碱的3倍以上。

2-3)透射电镜(TEM)

通过TEM研究CPT-mPEG₅₀₀/AVM-mPEG₅₀₀/CTAB@MSN的形态(参见图3-a)。从电镜图片上，可以看到其形成的是椭圆型的微球结构，其尺寸在50nm～100nm之间。另外，图3-b,c显示的分别是CPT-mPEG₅₀₀和AVM-mPEG₅₀₀在水中自聚集的形态。其中CPT-mPEG₅₀₀形成的是圆形的、均一的胶束结构，而AVM-mPEG₅₀₀形成的“口型”或者短棒状的胶束结构。根据前面表1中的数据可以看出，该二氧化硅纳米粒子负载AVM-mPEG₅₀₀的能力要比CPT-mPEG₅₀₀的强，其原因是AVM-mPEG₅₀₀在CTAB存在的条件下更容易形成棒状胶束，更易与有机硅源相互作用。所以，AVM-mPEG₅₀₀比CPT-mPEG₅₀₀更适合作为模板剂，制备介孔二氧化硅材料。这也说明了以药物-共聚物的两亲性共聚物和CTAB为双重模板，制备介孔SiO₂材料的可行性。

2-4)CPT-mPEG500/AVM-mPEG500/CTAB@MSN的释放行为

为了考察CPT-mPEG₅₀₀/AVM-mPEG₅₀₀/CTAB@MSN的缓释性，测试并绘制了其缓释曲线(参见图4)。由图4可以看出，该二氧化硅纳米粒子可以缓慢释放出CPT-mPEG₅₀₀和AVM-mPEG₅₀₀，而且其释放速率相对比较平稳。该纳米农药可持续释放25天以上，而且25天时其释药率分别为CPT-mPEG₅₀₀38.94％和AVM-mPEG₅₀₀53.51％。25天后该纳米农药还没有释放完全，还有将近一半左右的药物还没释放出来。此外，CPT-mPEG₅₀₀和AVM-mPEG₅₀₀两者之间的释药率相差不大。

3)药物释放试验

在25mL锥形瓶中，将50mg CPT-mPEG₅₀₀/AVM-mPEG₅₀₀/CTAB@MSN分散在10mL去离子水中，室温条件下培育。每隔一段时间用微量移液枪吸取出0.1mL溶液测吸光度，用去离子水稀释至10mL，同时往体系里补充0.1mL的去离子水。通过测定CPT-mPEG₅₀₀和AVM-mPEG₅₀₀的吸光度，可以计算出不同时间的释药量，然后以释药量为纵坐标，以时间为横坐标作出药物释放曲线。释药率公式如下：

式4

4)透射电镜(TEM)

将300目碳膜铜网用镊子夹出置于定性滤纸上，做好标记，然后将样品溶液滴在铜网上，于室温条件下风干铜网，在透射电子显微镜(Jeol JEM-1200EX)上观察。

5)红外光谱(FT-IR)

取MCM-41、CPT-mPEG₅₀₀、AVM-mPEG₅₀₀、CPT-mPEG₅₀₀/AVM-mPEG₅₀₀/CTAB@MSN四个样品各约1mg，加入适量的KBr，压片。然后在傅里叶变换红外光谱仪(NEXUS 670,Nicolet,USA)上测定。

6)热重分析(TG)

将MCM-41和CPT-mPEG₅₀₀/AVM-mPEG₅₀₀/CTAB@MSN真空干燥上2天，备用，然后在DuPont 1090B热分析仪上测定其热重，温度范围为室温～800℃。

实施例3：生物活性测试

一)供试昆虫：

1)朱砂叶螨(Tetranychus cinnabarinus)：采自甘肃省农业科学院田间的黄豆苗上，在人工气候室条件下[(25±1)℃，H/D 12:12]于实验室培养，备用。

2)小菜蛾(Plutella xyllostella)：供试昆虫为小菜蛾3龄幼虫.在人工气候室条件下[(26±1)℃，RH(70±5)％，H/D14]，用改良的蛭石白菜苗法继代饲养的品系。

二)供试药剂(表5)

表5 供试药剂和对照农药

三)活性测定：

1)朱砂叶螨毒杀活性测定:

采用玻片浸渍法测定(Wang Y.J.,et al.Agrochemicals Research&Application,2006,10:20-23)。将1号化合物10mg(CPT的实际含量)、3号化合物分别溶解到10mL丙酮中，2号化合物10mg分别溶解到10mL DMSO中(加热助溶)，分别配制成质量浓度为1000mg/L的药液，并取其1mL再用丙酮分别稀释成不同浓度的供试药液，备用。将双面胶带贴在载玻片的一端，用镊子揭去胶带上的纸片，用小号毛笔挑选生长一致的雌成螨，将其背部粘在双面胶带上(注意：不要粘住螨足、螨须和口器)，每个载玻片30头。在温度(25+1)℃，相对湿度85％左右的培养室中放置2h后，用体视镜观察，剔除死亡或不活泼的螨，并补足数量。将粘有螨虫的玻片一端浸入已配制好的药液中，轻轻摇动5s后取出，迅速用滤纸条吸干螨体及其周围多余的药液。置于培养室中培养24h后，用体视镜检查螨虫死亡情况。用毛笔轻触螨体，不动者判定为死亡。对照组为清水。平行实验3次，取均值。分析试验结果采用SPSS统计软件(版本13.0)，计算致死中浓度LC₅₀。

表2 喜树碱-阿维菌素二氧化硅纳米粒子对朱砂叶螨24h和48h的死亡率及LC₅₀

注：NT：No Tested，没有测试；MSN：CPT-mPEG₅₀₀/AVM-mPEG₅₀₀/CTAB@MSN；CPT：喜树碱；AVM：阿维菌素.

阿维菌素是当前农业害螨防治中理想的生物农药，对害螨具有广谱、高效和低残留等特点，但随着其广泛应用，害螨对其抗药性也日益严重，现已发现二斑叶螨和朱砂叶螨对其产生了抗药性。而我们活性筛选后发现喜树碱对朱砂叶螨具有较好的杀螨活性，使用二氧化硅纳米粒子包埋喜树碱和阿维菌素，评估其对朱砂叶螨的协同毒杀活性。表2显示的是CPT-mPEG₅₀₀/AVM-mPEG₅₀₀/CTAB@MSN、喜树碱和阿维菌素处理24h和48h后对朱砂叶螨的毒杀作用，其24h的LC₅₀分别为0.0293、135.02和0.045ppm；48h的LC₅₀分别为0.0079、110.33和0.019ppm。由表2中数据可以得出，相比较喜树碱的杀螨活性，该纳米农药的杀螨活性显著提高，是喜树碱的1.4×10⁴倍。而相比较二氧化硅纳米农药和阿维菌素24h、48h的杀螨活性，二氧化硅纳米农药的杀螨活性均要比阿维菌素提高将近一倍。

2)小菜蛾毒杀活性测定：

采用叶碟浸液法(李进步，等.中国农学通报，2009，25：223-227)。将1、3号化合物2mg(CPT的实际含量)分别溶解到2mL丙酮中，2号化合物10mg溶解到10mL DMSO中(加热助溶)，分别配制成质量浓度为1000mg/L的药液，并取其1mL再用丙酮分别稀释成500、200、100、50、20、10、2和1mg/L的供试药液，置于烧杯中备用。将新鲜无污染的甘蓝叶片分别在各供试药液中浸渍约l0s。取出自然晾干后.放入铺有保湿滤纸的培养皿内，然后用毛笔移入3龄小菜蛾幼虫，每皿20头试虫，每个浓度重复3次，并置于养虫室内恒温饲养。以清水处理为对照。检查72h试虫死亡情况并采用几率值法计算毒力回归方程及致死中浓度值。

表3 喜树碱-阿维菌素二氧化硅纳米粒子对小菜蛾72h的死亡率及LC₅₀

小菜蛾是十字花科蔬菜害虫，目前已对包括阿维菌素在内的50多种杀虫剂产生了不同程度的抗药性；喜树碱对小菜蛾具有多种作用方式：触杀较弱，具有一定的拒食和毒杀作用及较强的抑制生长发育作用等，使用二氧化硅纳米粒子同时包埋喜树碱和阿维菌素，探讨其对小菜蛾的协同毒杀作用。表3显示的是CPT-mPEG₅₀₀/AVM-mPEG₅₀₀/CTAB@MSN、喜树碱和阿维菌素处理72h后对小菜蛾的毒杀作用，其LC₅₀分别为44.51、411.11和47.06ppm。在室内条件下处理后24h、48h，仅阿维菌素的活性较好，而其他两组的死亡数都不明显，这说明该纳米农药具有缓释性能。由表3中的数据可以看出，该二氧化硅纳米农药对小菜蛾的毒杀活性显著增强，是喜树碱的10倍左右。此外，该二氧化硅纳米农药对小菜蛾的毒杀活性比阿维菌素的略好，其72h的LC₅₀分别为44.51和47.06ppm。

实施例4:共毒系数的计算：

毒力评价采用孙云沛法(Sun Y.P.,et al.Journal of Economic Entomology,1960,53:887-892)，计算共毒系数(co-toxicity coefficient,CTC)，以CTC值来评价喜树碱和啶虫脒两种药剂的联合毒力作用。CTC值<80为拮抗作用；>120为增效作用，介于80～120之间为相加作用，CTC值≥200则有显著增效作用。其计算方法如下：

1)毒力指数(toxicity index,TI)的计算

式5

2)混合剂(m)的实际毒力指数(actual toxicity index,ATI)的计算

式6

3)混合剂(m)的理论毒力指数(theoretical toxicity index,TTI)的计算

（m)TTI＝A剂的TI×在混合剂m中的百分数(％)+B剂的TI×在混合剂m中的百分数(％)

式7

4)共毒系数(co-toxicity coefficient，CTC)的计算

式8

通过计算其共毒系数，发现其对两种试虫的共毒系数分别为201.39和133.87，说明喜树碱与阿维菌素之间存在着增效作用。

表4 CRT-mPE500/AVM-mPEG500/CTAB@MSN对3种试虫的共毒系数

注：NT：毒力指数；ATI：混合剂(m)的实际毒力指数；TTI：混合剂(m)的理论毒力指数；CTC：共毒系数

表4显示的是CPT-mPEG500/AVM-mPEG500/CTAB@MSN对3种试虫的共毒系数，由表中数据可以得出，该纳米农药对朱砂叶螨的CTC值>200，表明阿维菌素对喜树碱有显著的增效作用；对小菜蛾的CTC值>120，表明阿维菌素对喜树碱有增效作用。

Claims

1.一种喜树碱-阿维菌素二氧化硅纳米粒子CPT-mPEG500/AVM-mPEG500/CTAB@MSN的制备方法，其特征在于：

a. 在氮气保护下，将5 g 聚乙二醇单甲醚用50 mL 干燥二氯甲烷搅拌溶解，然后加入5 g 丁二酸酐、4 mL 干燥吡啶，加热至40℃，充分回流反应，回流完毕后，冷却至室温进行干燥处理，再在其中加适量蒸馏水溶解，用体积比为1:1 的乙酸乙酯/正己烷洗涤，水相再用氯仿萃取，合并萃取液用无水硫酸镁干燥处理，经过滤和蒸馏浓缩得到mPEG500-COOH；

b.将a步骤所得到的mPEG500-COOH1 mmol 用10 mL 干燥二氯甲烷搅拌溶解，在0℃下，依次加入348 mg 的喜树碱、122 mg 的4-二甲氨基吡啶和0.17 mL N,N′-二异丙基碳二亚胺，继续在0 ℃下反应2 h，撤去冰浴，缓慢升至室温，继续搅拌反应16 h，待反应完毕后，过滤，滤液用0.1N HCl 洗涤，再有机相用无水硫酸镁干燥过夜，过滤、蒸馏旋干得粗品，将所得到的粗品用洗脱剂：氯仿/甲醇=20:1 柱层析纯化；

c. 将350 mg 阿维菌素、245 mg的由a步骤制备的mPEG500-COOH 和50 mg 4-二甲氨基吡啶（DMAP），用10 mL 干燥的二氯甲烷溶解并搅拌，在0℃下，分批加入90.6 mg 二环己基碳二亚胺（DCC），继续搅拌2 h，撤去冰浴，缓慢升至室温，并在室温搅拌反应过夜，待反应完毕，加入适量的氯仿稀释，过滤，滤液依次用0.1 N 盐酸和蒸馏水洗涤数次，无水硫酸镁干燥，过滤，减压旋干，最后柱层析纯化，用氯仿/甲醇10:1，得到一浅黄色的油状物—阿维菌素二氧化硅纳米粒子AVM-mPEG500；

d. 将50mg 的CPT-mPEG500 和 50mg 的AVM-mPEG500用30mL 去离子水溶解，待溶解后继续搅拌 1h，再往混合体系中加入 200mg CTAB 、2mL 三乙胺，溶解后继续搅拌 2h，然后将 600mg TEOS 逐滴加入，加完之后，室温条件下搅拌 24h，待有淡黄色的沉淀生成后，经离心真空干燥处理后，得到黄色固体粉末的CPT-mPEG500/AVM-mPEG500/CTAB@MSN。

2.权利要求1所述的喜树碱-阿维菌素二氧化硅纳米粒子CPT-mPEG500/AVM-mPEG500/CTAB@MSN在农药方面的应用。

3.权利要求1所述的喜树碱-阿维菌素二氧化硅纳米粒子CPT-mPEG500/AVM-mPEG500/CTAB@MSN用于杀灭朱砂叶螨。

4.权利要求1所述的喜树碱-阿维菌素二氧化硅纳米粒子CPT-mPEG500/AVM-mPEG500/CTAB@MSN用于杀灭小菜蛾。