CN110787189A - 一种含龟板药剂的制备方法、应用及其成分鉴定方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种含龟板药剂的制备方法、应用及其成分鉴定方法，属于医药领域。本发明提供含龟板药剂的制备方法，采用水提法，通过改进龟板或醋龟板的提取步骤，用电热套相关装备蒸煮中药，并用旋转蒸发仪浓缩中药，可减少药物有效成分丢失，提高了有效药物浓度和中药利用率，节省了提取原料，降低了成本，且提取的龟板水提液可根据临床需要制备成口服液或冻干粉等剂型，便于临床患者口服，便于临床运用，有较好的临床转化前景。本发明探究了制备的含龟板药剂对骨质疏松性椎体骨折(OVF)大鼠模型的干预效果，发现龟板水提液可促进OVF愈合，明确了龟板治疗OVF的作用，拓展了其用途。

Description

一种含龟板药剂的制备方法、应用及其成分鉴定方法
技术领域
本发明涉及一种含龟板药剂的制备方法、应用及其成分鉴定方法，属于医药领域。
背景技术
骨质疏松性椎体骨折(Osteoporotic vertebral fracture，OVF)是骨质疏松症最常见、最严重的并发症。目前关于OVF的治疗依然是临床上较为棘手的难题，临床上使用的治疗药物均有一定副作用，因此，开发具有良好疗效、副作用低的药物具有较大意义。
中药龟板，又称为龟甲、乌龟壳、乌龟板、下甲、血板、烫板等，为龟科动物Chinemysreevesii(Gray)的腹甲及背甲。其性味咸、甘，微寒；归肝、肾、心经；具有滋阴、潜阳、补肾、健骨的作用。中药龟板治肾阴不足，骨蒸劳热，吐血，衄血，久咳，遗精，崩漏，带下，腰痛，骨痿，阴虚风动，久痢，久疟，痔疮，小儿囟门不合，用法用量5～40g。龟板的炮制品有龟板和醋龟板两种。
中药龟板近年来已有少量文献报道单味龟板或含有龟板的中药复方可减少绝经后骨丢失，但并未发现龟板具有治疗OVF的疗效。目前临床上常采用药煲煎煮药的方式服用中药龟板，由于高温煎煮易产生水蒸气，致使部分药物的有效成分随水蒸气挥发，从而降低药物的有效浓度，进而影响疗效。因此，有必要改进中药煎煮的制备方法，并探究制备的新剂型对OVF的疗效。此外，研究龟板对OVF的防治作用起步较晚，从而导致相关方面的研究缺乏，进而限制了龟板的临床运用，目前中药龟板对OVF的疗效尚未明确，也无相关报道。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种含龟板药剂的制备方法，本发明所述的制备方法是对目前临床上龟板用药的煎煮制备方法的改进，提高了龟板药物的有效浓度，实现龟板药物浓度的客观可控。
本发明的另一目的是提供所述含龟板药剂的制备方法制备的含龟板药剂在制备预防和/或治疗骨质疏松性椎体骨折的药物中的应用。
本发明的再一目的是提供所述含龟板药剂的制备方法制备的含龟板水提液或含龟板冻干粉的成分鉴定方法。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种含龟板药剂的制备方法，所述含龟板药剂为含龟板水提液，所述含龟板水提液的制备方法包括如下步骤：
(1)取龟板粉碎，获得龟甲粉；
(2)取能过20目筛但不能过40目筛的步骤(1)所述的龟甲粉于容器中，加入纯水进行加热提取，微沸，获得提取混合液；
(3)将步骤(2)所述的提取混合液进行加热浓缩，获得重量为步骤(2)所述龟板浓度为0.2～1g/mL的浓缩液，即可制得所述含龟板水提液。
作为本发明含龟板药剂的制备方法的一种优选实施方式，步骤(2)的具体操作为：取能过20目筛但不能过40目筛的步骤(1)所述的龟甲粉于容器内，加入重量为所述龟甲粉重量8～10倍的纯水，用电热套加热，微沸1～1.5h，停止加热，分离药液和药渣，获得第一次药渣和第一次提取液；往所述第一次药渣中加入重量为所述第一次药渣重量8倍的纯水，用电热套加热，微沸1～1.5h，停止加热，获得第二次药渣和第二次提取液；再往所述第二次药渣中加入重量为所述第二次药渣重量8倍的纯水，用电热套加热，微沸1～1.5h h，停止加热，获得第三次药渣和第三次提取液；将第一次提取液、第二次提取液和第三次提取液混合，即可获得步骤(2)所述的提取混合液。
本发明采用电热套相关装备蒸煮中药，并用旋转蒸发仪浓缩中药，可减少药物有效成分丢失。
作为本发明含龟板药剂的制备方法的一种优选实施方式，步骤(3)中，用旋转蒸发仪对步骤(2)所述的提取混合液进行加热浓缩，所述加热浓缩的温度为60～90℃。
作为本发明含龟板药剂的制备方法的一种优选实施方式，利用旋转蒸发仪对步骤(3)所述的浓缩液继续在60～90℃的温度下加热浓缩至无液滴滴出，即可制得含龟板流浸膏剂。
作为本发明含龟板药剂的制备方法的一种优选实施方式，将所述的含龟板流浸膏剂放入-80℃冰箱内，2天时间后取出，再放入冷冻干燥机中干燥72～96h，即可制得含龟板冻干粉。
本发明采用水提法，通过改进龟板或醋龟板的提取步骤，在提高药物有效成分保留量的同时，节省了提取原料，降低了成本，且提取的龟板水提液可根据临床需要制备成口服液或冻干粉等剂型，利于患者选择及接受，便于临床运用，有较好的临床转化前景。
本发明提供上述制备方法制备的含龟板水提液的成分鉴定方法，所述鉴定方法采用气象色谱/质谱联用分析法鉴定所述含龟板水提液的成分；所述鉴定方法具体为：取所述含龟板水提液的上清液于容器中，用氮气吹干，加入溶剂为吡啶、浓度为25mg/mL甲氧基胺盐酸盐，涡旋1min，置于40℃下反应2h，加入MSTFA，再涡旋1min，置于40℃下反应1h，取出冷却至室温，进样，然后采用气象色谱/质谱联用分析法鉴定，即可鉴定所述含龟板水提液的成分。
本发明提供上述制备方法制备的含龟板冻干粉的成分鉴定方法，所述鉴定方法采用气象色谱/质谱联用分析法鉴定所述含龟板冻干粉的成分；所述鉴定方法具体为：取含龟板冻干粉样品置于离心管中，加入甲醇、三氯甲烷和水的体积比为2.5:1:1的提取液，涡旋1min，常温超声20min，再涡旋1min，再常温超声20min，于3000rpm/min离心5min，取上清液用氮气吹干，加入溶剂为吡啶、浓度为25mg/mL甲氧基胺盐酸盐，涡旋1min，置于37℃下反应2h，加入MSTFA，再涡旋1min，置于37℃下反应1h，取出冷却至室温，过滤头进样，然后采用气象色谱/质谱联用分析法鉴定，即可鉴定所述含龟板冻干粉的成分。
本发明采用色谱分析法对所提取的龟板水提液进行成分鉴定分析，明确了龟板或醋龟甲提取后的成分，便于龟板后续的相关研究开展。
本发明提供上述的制备方法制备的含龟板药剂在制备预防和/或治疗骨质疏松性椎体骨折的药物中的应用。
作为本发明所述应用的一种优选实施方式，所述药物用于促进骨髓间充质干细胞(BMSCs)的增值。
作为本发明所述应用的一种优选实施方式，所述药物用于促进骨髓间充质干细胞(BMSCs)的迁移。
作为本发明所述应用的一种优选实施方式，所述药物用于促进骨髓间充质干细胞(BMSCs)的成骨分化。
本发明提供所述含龟板药剂在制备预防和/或治疗骨质疏松性椎体骨折的药物中的应用，明确了含龟板药剂对骨质疏松性椎体骨折的治疗作用及初步机制，探索并开发了龟板的临床运用范围。本发明将运用含龟板药剂干预大鼠BMSCs，观察其对BMSCs增殖、分化的作用；且在SD大鼠骨质疏松性椎体骨缺损模型(OVF)上将龟板水提液通过灌胃给药的方法对模型鼠进行干预，明确龟板对OVF的作用及机制。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)本发明提供含龟板药剂的制备方法，采用水提法，通过改进龟板或醋龟板的提取步骤，用电热套相关装备蒸煮中药，并用旋转蒸发仪浓缩中药，可减少药物有效成分丢失，提高了有效药物浓度和中药利用率，节省了提取原料，降低了成本，且提取的龟板水提液可根据临床需要制备成口服液或冻干粉等剂型，便于临床患者口服，便于临床运用，有较好的临床转化前景；
(2)本发明提供含龟板药剂的制备方法制备的龟板水提液或冻干粉有望用于临床上OVF的治疗，可减轻OVF患者症状，改善生活质量，且有利于扩展龟板治疗OVF的临床运用及市场；
(3)本发明采用色谱分析法对所提取的龟板水提液进行成分鉴定分析，明确了龟板或醋龟甲提取后的成分，便于龟板后续的相关研究开展；
(4)本发明提供所述含龟板药剂在制备预防和/或治疗骨质疏松性椎体骨折的药物中的应用，探究了制备的含龟板药剂对骨质疏松性椎体骨折(OVF)大鼠模型的干预效果，发现龟板水提液可促进OVF愈合，明确了龟板治疗OVF的作用，拓展了其用途。
附图说明
图1为本发明实施例1制备的含龟板水提液色谱图；
图2为本发明实施例3制备的含龟板冻干粉色谱图；
图3为本发明所述的含龟板水提液对BMSCs增殖的影响结果图；
图4为本发明所述的含龟板水提液促BMSCs迁移的结果图；
图5为ALP染色提示本发明所述的含龟板水提液促BMSCs成骨分化的结果图；
图6为茜素红染色提示本发明所述的含龟板水提液促BMSCs成骨矿化的结果图；
图7为本发明所述的含龟板水提液促进OVF愈合的结果图，其中图7(A)为治疗2个月后样本外观图；图7(B)为micro-CT结果图；图7(C)为HE结果图，其中黑色箭头表示骨细胞，灰色箭头表示成骨细胞。
具体实施方式
为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。
中药均购自广州紫和堂大药房有限公司。所有试剂均购于广州塞业公司。采用2～3周龄SD大鼠双下肢胫骨、股骨提取的BMSCs进行细胞实验，采用8周龄SD大鼠进行OVF模型制作及相关动物实验。大鼠购置于广州中医药大学动物实验中心，并按照标准环境饲养于广州中医药大学第一附属医院动物实验中心。
实施例1
本实施例为本发明一种含龟板药剂的制备方法，所述含龟板药剂为含龟板水提液，所述含龟板水提液的制备方法包括如下步骤：
(1)取龟板粉碎，获得龟甲粉；
(2)取能过20目筛但不能过40目筛的步骤(1)所述的龟甲粉100g于3L烧瓶内中，加入重量为所述龟甲粉重量10倍质量体积比(即1L)的纯水，用电热套加热，微沸1h，停止加热，分离药液和药渣，获得第一次药渣和第一次提取液；往所述第一次药渣中加入重量为所述第一次药渣重量8倍(即800ml)的纯水，用电热套加热，微沸1h，停止加热，获得第二次药渣和第二次提取液；再往所述第二次药渣中加入重量为所述第二次药渣重量8倍(即800ml)的纯水，用电热套加热，微沸1h，停止加热，获得第三次药渣和第三次提取液；将第一次提取液、第二次提取液和第三次提取液混合，即可获得步骤(2)所述的提取混合液；
(3)在60℃加热温度下，用旋转蒸发仪将步骤(2)所述的提取混合液进行加热浓缩至100ml(使龟板浓度为0.2g/mL)，用5支50ml离心管分装250ml浓缩后的提取液，做好标记，放于-80℃冰箱内，即可制得所述含龟板水提液。
实施例2
本实施例为本发明一种含龟板药剂的制备方法，所述含龟板药剂为含龟板流浸膏剂，所述含龟板流浸膏剂的制备方法包括如下步骤：
(1)取龟板粉碎，获得龟甲粉；
(2)取能过20目筛但不能过40目筛的步骤(1)所述的龟甲粉100g于3L烧瓶内中，加入重量为所述龟甲粉重量10倍(即1L)的纯水，用电热套加热，微沸1h，停止加热，分离药液和药渣，获得第一次药渣和第一次提取液；往所述第一次药渣中加入重量为所述第一次药渣重量8倍质量体积(即800ml)的纯水，用电热套加热，微沸1h，停止加热，获得第二次药渣和第二次提取液；再往所述第二次药渣中加入重量为所述第二次药渣重量8倍质量体积(即800ml)的纯水，用电热套加热，微沸1h，停止加热，获得第三次药渣和第三次提取液；将第一次提取液、第二次提取液和第三次提取液混合，即可获得步骤(2)所述的提取混合液；
(3)在90℃加热温度下，用旋转蒸发仪将步骤(2)所述的提取混合液进行加热浓缩至500ml(龟板浓度为1g/mL)，取250ml浓缩继续在90℃温度下，用旋转蒸发仪加热浓缩至无液滴滴出，用包装袋装好后置于-20度冰箱中，即可制得含龟板流浸膏剂。
实施例3
本实施例为本发明一种含龟板药剂的制备方法，所述含龟板药剂为含龟板冻干粉，所述含龟板冻干粉的制备方法包括如下步骤：
(1)取龟板粉碎，获得龟甲粉；
(2)取能过20目筛但不能过40目筛的步骤(1)所述的龟甲粉100g于3L烧瓶内中，加入重量为所述龟甲粉重量10倍(即1L)的纯水，用电热套加热，微沸1h，停止加热，分离药液和药渣，获得第一次药渣和第一次提取液；往所述第一次药渣中加入重量为所述第一次药渣重量8倍质量体积(即800ml)的纯水，用电热套加热，微沸1h，停止加热，获得第二次药渣和第二次提取液；再往所述第二次药渣中加入重量为所述第二次药渣重量8倍质量体积(即800ml)的纯水，用电热套加热，微沸1h，停止加热，获得第三次药渣和第三次提取液；将第一次提取液、第二次提取液和第三次提取液混合，即可获得步骤(2)所述的提取混合液；
(3)在80℃加热温度下，用旋转蒸发仪将步骤(2)所述的提取混合液进行加热浓缩至500ml(龟板浓度为0.2g/mL)，取250ml浓缩继续在60～90℃温度下，用旋转蒸发仪加热浓缩至无液滴滴出，用包装袋装好后置于-20度冰箱中，获得含龟板流浸膏剂，将所述的含龟板流浸膏剂放入-80℃冰箱内，2天后取出，再放入冷冻干燥机中干燥72h，即可制得含龟板冻干粉。
实验例1
本实验例为本发明实施例1所述的含龟板水提液的成分鉴定方法，所述鉴定方法采用气象色谱/质谱联用分析法鉴定所述含龟板水提液的成分；所述鉴定方法具体为：取100μL所述含龟板水提液(浓度为0.2g/mL)的上清液于容器中，用氮气吹干，加入溶剂为吡啶、浓度为25mg/mL的80μL甲氧基胺盐酸盐，涡旋1min，置于40℃下反应2h，加入100μLMSTFA，再涡旋1min，置于40℃下反应1h，取出冷却至室温，进样，然后采用气象色谱/质谱联用分析法鉴定，即可鉴定所述含龟板水提液的成分。鉴定结果如表1和图1所示。
实验例2
本实验例为本发明实施例3所述的含龟板冻干粉的成分鉴定方法，所述鉴定方法采用气象色谱/质谱联用分析法鉴定所述含龟板冻干粉的成分；所述鉴定方法具体为：取0.1g含龟板冻干粉样品置于10mL玻璃离心管中，加入甲醇、三氯甲烷和水的体积比为2.5:1:1的提取液3mL，涡旋1min，常温超声20min，再涡旋1min，再常温超声20min，于3000rpm/min离心5min，取400μL上清液用氮气吹干，加入溶剂为吡啶、浓度为25mg/mL的80μL甲氧基胺盐酸盐，涡旋1min，置于37℃下反应2h，加入100μL MSTFA，再涡旋1min，置于37℃下反应1h，取出冷却至室温，过滤头进样，然后采用气象色谱/质谱联用分析法鉴定，即可鉴定所述含龟板冻干粉的成分。鉴定结果如表2和图2所示。
表1实施例1的含龟板水提液成分鉴定的定性结果
Figure BDA0002283215200000081
Figure BDA0002283215200000091
由表1的鉴定结果和图1色谱分析图的可知，含龟板水提物鉴定出成分有45种。
表2实施例3的含龟板冻干粉成分鉴定的定性结果
Figure BDA0002283215200000102
Figure BDA0002283215200000121
Figure BDA0002283215200000131
Figure BDA0002283215200000141
由表2的鉴定结果和图2的色谱分析图可知，龟板冻干粉共鉴定出成分有76种。
实验例3
本实验例为本发明所述的含龟板水提液对大鼠的骨髓间充质干细胞(BMSCs)进行的细胞实验，以大鼠的骨髓间充质干细胞(BMSCs)为研究对象，验证了本发明所述的含龟板水提液对BMSCs增殖、成骨分化的影响。
实验方法：提取大鼠的骨髓间充质干细胞(BMSCs)后，按照常规细胞培养方法换液、传代、种板。用本发明所述的含龟板水提液分别进行CCK8检测、划痕实验，并进行成骨诱导并用龟板干预BMSCs，于成骨诱导5、10天进行ALP染色，10、14天进行茜素红染色染色。观察龟板对BMSCs增殖、迁移及成骨分化的作用，实验结果如图3-6所示。
实验结果：(1)由图3的CCK8检测结果可知，随着细胞培养时间延长，0.02～200ug/mL浓度龟板水提液对BMSCs均有一定增殖作用，且20ug/mL促增殖作用最显著，5天为干预的峰值之间，5天后，龟板水提液促细胞增殖逐渐降低，后保持一稳定水平。
(2)由图4划痕实验结果可知，不同浓度的龟板水提液可促进BMSCs迁移，且20ug/mL含龟板水提液促BMSCs迁移效果最佳。
(3)由图5的成骨诱导ALP染色结果可知，在BMSCs成骨分化过程中，龟板水提液可促BMSCs增殖，颜色越深表示染色越深，促细胞成骨分化效果越佳。
(4)由图6的成骨诱导茜素红染色结果可知，成骨诱导10d，21d时，龟板水提液可促进BMSCs成骨分化效果，颜色越深表示染色越深，表示促细胞成骨矿化作用越佳。
实验例4
本实验例为本发明所述的含龟板水提液对8周龄SD大鼠进行OVF造模的动物实验，以SD大鼠骨质疏松性椎体骨折骨缺损(Osteoporotic vertebrae defect/fracture，OVF)模型为基础，验证本发明所述的含龟板水提液对OVF治疗及修复的效果。
实验方法：将8周龄SD大鼠进行OVF造模(去卵巢2月后在L6椎体处钻一大约3mm×3mm的孔)，并于术后3天开始实验，治疗组予每天用本发明所述的含龟板提取液灌胃(根据动物与人体表面积计算灌胃药物)，对照组及模型组给予等量的生理盐水进行灌胃。并于治疗8周后处死大鼠，取材后进行L6椎体micro-CT检测、HE染色。评估龟板对OVF大鼠的治疗作用，实验结果如图7所示。
实验结果：图7中，图7(A)为治疗2个月后样本外观图；图7(B)为micro-CT结果图；图7(C)为HE结果图，其中黑色箭头表示骨细胞，灰色箭头表示成骨细胞；结果表明治疗8周后取材，micro-CT、HE染色结果发现，龟板可有效治疗骨质疏松性椎体骨缺损/骨折(OVF)。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (9)

1.一种含龟板药剂的制备方法，其特征在于，所述含龟板药剂为含龟板水提液，所述含龟板水提液的制备方法包括如下步骤：
(1)取龟板粉碎，获得龟甲粉；
(2)取能过20目筛但不能过40目筛的步骤(1)所述的龟甲粉于容器中，加入纯水进行加热提取，微沸，获得提取混合液；
(3)将步骤(2)所述的提取混合液进行加热浓缩，获得重量为步骤(2)所述龟板浓度为0.2～1g/mL的浓缩液，即可制得所述含龟板水提液。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)的具体操作为：取能过20目筛但不能过40目筛的步骤(1)所述的龟甲粉于容器内，加入重量为所述龟甲粉重量8～10倍的纯水，用电热套加热，微沸1～1.5h，停止加热，分离药液和药渣，获得第一次药渣和第一次提取液；往所述第一次药渣中加入重量为所述第一次药渣重量8倍的纯水，用电热套加热，微沸1～1.5h，停止加热，获得第二次药渣和第二次提取液；再往所述第二次药渣中加入重量为所述第二次药渣重量8倍的纯水，用电热套加热，微沸1～1.5h h，停止加热，获得第三次药渣和第三次提取液；将第一次提取液、第二次提取液和第三次提取液混合，即可获得步骤(2)所述的提取混合液。
3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，用旋转蒸发仪对步骤(2)所述的提取混合液进行加热浓缩，所述加热浓缩的温度为60～90℃。
4.如权利要求1-3任一所述的制备方法，其特征在于，利用旋转蒸发仪对步骤(3)所述的浓缩液继续在60～90℃的温度下加热浓缩至无液滴滴出，即可制得含龟板流浸膏剂。
5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，将所述的含龟板流浸膏剂放入-80℃冰箱内，2天后取出，再放入冷冻干燥机中干燥72～96h，即可制得含龟板冻干粉。
6.如权利要求1-3任一所述的制备方法制备的含龟板水提液的成分鉴定方法，其特征在于，所述鉴定方法采用气象色谱/质谱联用分析法鉴定所述含龟板水提液的成分；所述鉴定方法具体为：取所述含龟板水提液的上清液于容器中，用氮气吹干，加入溶剂为吡啶、浓度为25mg/mL甲氧基胺盐酸盐，涡旋1min，置于40℃下反应2h，加入MSTFA，再涡旋1min，置于40℃下反应1h，取出冷却至室温，进样，然后采用气象色谱/质谱联用分析法鉴定，即可鉴定所述含龟板水提液的成分。
7.如权利要求4所述的制备方法制备的含龟板冻干粉的成分鉴定方法，其特征在于，所述鉴定方法采用气象色谱/质谱联用分析法鉴定所述含龟板冻干粉的成分；所述鉴定方法具体为：取含龟板冻干粉样品置于离心管中，加入甲醇、三氯甲烷和水的体积比为2.5:1:1的提取液，涡旋1min，常温超声20min，再涡旋1min，再常温超声20min，于3000rpm/min离心5min，取上清液用氮气吹干，加入溶剂为吡啶、浓度为25mg/mL甲氧基胺盐酸盐，涡旋1min，置于37℃下反应2h，加入MSTFA，再涡旋1min，置于37℃下反应1h，取出冷却至室温，过滤头进样，然后采用气象色谱/质谱联用分析法鉴定，即可鉴定所述含龟板冻干粉的成分。
8.如权利要求1-5任一所述的制备方法制备的含龟板药剂在制备预防和/或治疗骨质疏松性椎体骨折的药物中的应用。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述药物用于促进骨髓间充质干细胞的增值；所述药物用于促进骨髓间充质干细胞的迁移；所述药物用于促进骨髓间充质干细胞的成骨分化。
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