CN110786239A

CN110786239A - 一种野生杜衡组织培养繁殖方法

Info

Publication number: CN110786239A
Application number: CN201910946938.5A
Authority: CN
Inventors: 黄婧; 陈庆生; 张子鸣; 张敏; 周鹏; 蒋泽平
Original assignee: Jiangsu Forestry Academy
Current assignee: Jiangsu Forestry Academy
Priority date: 2018-11-23
Filing date: 2019-10-07
Publication date: 2020-02-14
Anticipated expiration: 2039-10-07
Also published as: CN110786239B

Abstract

本发明涉及一种野生杜衡组织培养繁殖方法，包括以下步骤：（1）选材及消毒处理；（2）无菌苗培养；（3）增殖和生根培养。本发明成功建立了一个野生杜衡组织培养高效再生体系，该技术以根状茎为外植体，利用其专用诱导培养和增殖培养配方，幼苗40天增殖倍数达到4~4.5倍，经过组培瓶内生根程序，生根率达到100%，为杜衡工厂化育苗提供了一种可参照的技术和方法。

Description

一种野生杜衡组织培养繁殖方法

技术领域

本发明涉及杜衡的繁育方法，具体地说是涉及野生杜衡组织培养繁殖方法。

背景技术

杜衡（AsarumforbesiiMaxin.），又名“蘅”，别名“马辛”、“马蹄香”等，是马兜铃科细辛属多年生草本植物，分布在江苏、安徽、浙江、江西、河南、湖北、四川等地。杜衡是名贵的中草药，有祛风散寒，消痰行水，活血止痛，解毒等功效；也是国家二级保护动物中华虎凤蝶的幼虫赖以生存的唯一食物。近年来，由于山林过度开发，采药人和“蝶商”们的过度采伐，野生杜衡越来越少，野生虎凤蝶数量也越来越少。保护杜衡野生种质资源迫在眉睫。采用组培技术繁殖杜衡，能够在短时间内获得大量种苗，并且保持母株的优良性状，后代遗传整齐，符合中药材生产管理规范；同时也能为虎凤蝶提供寄主植物和幼虫食物，既有经济应用价值也有环保生态价值。

目前杜衡的组培技术研究报道非常少，研究人员曾经尝试利用根状茎（杜衡离体繁殖的研究. 生物学杂志 2002, 18(4):16-18.）、叶柄（杜衡的组织培养研究. 信阳师范学院学报(自然科学版) 2000, 13(3):310-312.，外源激素对杜衡叶柄愈伤组织诱导与分化的影响. 植物资源与环境学报 2010, 19(1):38-42.）和带腋芽茎段或顶芽（杜衡的组织培养. 植物生理学报 2004, 40(4):454.）作为外植体进行组培试验，但是叶柄愈伤组织诱导后分化不定芽的系数，经愈伤组织诱导产生的不定芽，变异较多，继代培养代数的增加一般会提高植株变异率，其繁殖系数较低，未见其大规模繁育的报道。

发明内容

发明目的：本发明的目的在于提供一种取材容易、增殖速度快、繁殖系数高的野生杜衡组织培养繁殖方法。

技术方案：本发明是通过以下技术方案来实现的：

一种野生组织培养的配方，包括以下步骤：

（1）取生长健壮、无病虫害的野生杜衡的带芽根状茎作为外植体；移至日光温室盆栽养护1~2个月，选取带芽的根状茎，置于流水中冲洗40min，再用中性肥皂水洗刷根状茎的表面，然后用无菌水冲洗干净后，将所选取的外植体剪切成2~4 cm长的带芽茎段，经70%的酒精消毒10 s，再用0.1%的升汞消毒30分钟，最后用无菌水冲洗5次；。

（2）无菌苗培养：在超净工作台上和无菌条件下，将步骤（1）中消毒处理后的外植体剪去接触消毒液的伤口部位，留1~2 cm带芽茎段接种在含有诱导培养基的培养瓶中，其置于白色荧光灯为光源的环境下，控制光量40 μmol·m^-2·s^-1，设定光照时间12 h·d^-1，温度（25±1）℃，培养25天，长成4~6 cm的无菌苗；

（3）将步骤（3）中的组培苗，剪切成1.5~2.0 cm带有1~2个腋芽的茎段，转接于含有增殖培养基的培养瓶中进行增殖培养，培养40天既为一个继代周期，增殖系数为4~4.5倍；在该培养基中同时可获得健壮的生根苗，生根率100%。

以上步骤（2）~（3）消毒接种工作均在超净工作台中操作，试管苗的培养均在组织培养室内进行，其培养条件为：控制光量40 μmol·m^-2·s^-1，设定光照时间12 h·d^-1，温度（25±1）℃。

所述方法的步骤（2）诱导培养基为WPM + 0.05 mg/L NAA+ 30 g·L^-1蔗糖+ 6.3g·L^-1卡拉胶，pH值为5.8。

所述方法的步骤（3）增殖培养基为WPM + 0.1 mg/L NAA + 1.00 mg/L 6-BA + 30g·L^-1蔗糖+ 6.3 g·L^-1卡拉胶，pH值为5.8。

进一步，所述的WPM基本培养基即木本植物组织培养基的具体配方如下：

硝酸铵NH₄NO₃ 400 mg/L

硝酸钙 Ca(NO₃)₂·4H₂O 556 mg/L

氯化钙CaCl₂·2H₂O 96 mg/L

硫酸镁MgSO₄·7H₂O 370 mg/L

磷酸二氢钾 KH₂PO₄ 170 mg/L

硫酸钾K₂SO₄ 990 mg/L

乙二胺四乙酸二钠Na₂·EDTA 37.3 mg/L

硫酸亚铁FeSO₄·7H₂O 27.8 mg/L

硫酸锰MnSO₄·H₂O 22.3 mg/L

硫酸锌ZnSO₄·7H₂O 8.6 mg/L

硼酸H₃BO₃ 6.2 mg/L

钼酸钠Na₂MoO₄·2H₂O 0.25 mg/L

硫酸铜CuSO₄·5H₂O 0.025 mg/L

氯化钴 CoCl₂.6 H₂O 0.025 mg/L

肌醇C₆H₁₂O₆·2H₂O 100 mg/L

甘氨酸 NH_2·CH₂·COOH 2 mg/L

盐酸硫胺素C₁₂H₁₇ClOS·2HCl 1 mg/L

盐酸吡哆醇C₈H₁₀NO₅P 0.5 mg/L

烟酸NC₅H₄COOH 0.5 mg/L

本发明参照其他马兜铃科植物的组培方案，选择杜衡带芽的根状茎作为外植体，建立植株无菌体系，研究杜衡组培快繁的合适条件，对杜衡组培快繁体系的优化具有重要技术意义。

有益效果：本发明以野生杜衡根状茎为外植体，利用其专用诱导培养和增殖培养基和培养条件，成功建立了一个野生杜衡组织培养高效再生体系，为杜衡工厂化育苗提供了一种可参照的技术和方法。本发明具有以下优点：

1、便于良种保存及开展遗传改良研究：与扦插繁殖相比，本发明方法节约占地空间，繁殖时间不受季节限制，继代周期短，无病虫害困扰，更加适合用于野生杜衡品种保存以及快速高效的繁殖。

2、繁殖效率高：采用本发明组织培养方法，杜衡40天增殖倍数达到4~4.5倍，与常规的组织培养方法相比，增殖倍数提高了约1-2倍，本发明利用杜衡球状茎为外植体，相比根、叶、花、种子等其他器官的组织培养，使得茎尖组织具有更强的分化能力，繁殖效率高；同时，通过特定的培育条件结合特定的诱导培养基和增殖培养基的培养，特别是在特定诱导培养基和诱导条件结合下针对根状茎的诱导，诱导效果好，相比愈伤组织诱导的不定芽，后代植株变异少，进一步提高繁殖率，有利于杜衡良种的繁育。

3、苗木质量好：本发明方法配方组分简单，幼苗生长健壮，省去了专门的壮苗和生根阶段，能够在短时间内获得大量种苗，并且保持母株的优良性状，后代遗传整齐，符合中药材生产管理规范。

综上所述：本发明所述的一种野生杜衡组织培养的方法具有诱导效果好，繁殖系数高、节能、苗木质量好等优点，幼苗40天增殖倍数达到4~4.5倍，经过组培瓶内生根程序，生根率达到100%，在杜衡苗木生产及科研中均具有重要的应用价值。

具体实施方式

下面将结合具体实例，详细说明本发明的具体实施方式：

本发明由于是采用定向定量培养，通过研究得出相对最优的培育方案，具体实施方法如下：

基本培养基的配置：

基本培养基为WPM培养基，其中，常量元素的组分和其对应的使用浓度如下：硝酸铵（NH₄NO₃）400 mg/L、硝酸钙（Ca(NO₃)₂·4H₂O）556 mg/L、氯化钙（CaCl₂·2H₂O）96 mg/L、硫酸镁（MgSO₄·7H₂O）370 mg/L、磷酸二氢钾（KH₂PO₄）170 mg/L、硫酸钾（K₂SO₄）990 mg/L；

微量元素的组分和其对应的使用浓度如下：硫酸锰（MnSO₄·H₂O ）22.3 mg/L、硫酸锌（ZnSO₄·7H₂O）8.6 mg/L、硼酸（H₃BO₃）6.2 mg/L、钼酸钠（Na₂MoO₄·2H₂O）0.25 mg/L、硫酸铜（CuSO₄·5H₂O）0.025 mg/L、硫酸铜（CuSO_4·5H₂O）0.025 mg/L、氯化钴（CoCl₂.6 H₂O）0.025mg/L；

铁盐的组分和其对应的使用浓度如下：乙二胺四乙酸二钠（Na₂·EDTA）37.3 mg/L、硫酸亚铁（FeSO₄·7H₂O）27.8 mg/L；

有机成分的组分和其对应的浓度如下：肌醇100 mg/L、甘氨酸（Gly）2 mg/L、盐酸硫胺素（VB₁）1 mg/L、盐酸吡哆醇（VB₆）0.5 mg/L、烟酸（VPP）0.5 mg/L。

利用上述的基本培养基配置诱导培养基、增殖（生根）培养基。

其中，诱导培养基：每升基本培养基+ 0.2 mg/L NAA+ 30 g·L^-1蔗糖+ 6.3 g·L^-1卡拉胶，pH值为5.8。

增殖培养基：每升基本培养基 + 0.1 mg/L NAA + 1.00 mg/L 6-BA + 30 g·L^-1蔗糖+ 6.3 g·L^-1卡拉胶，pH值为5.8。

将上述配置好的培养基注入玻璃瓶中，经高温高压消毒20分钟，待用，其中，温度为120-125 ℃，压力为1.1 KG/CM²。

杜衡组织培养快繁方法，按以下步骤进行：

（1）选材及消毒处理：选取生长健壮、无病虫害的野生杜衡植株，移至日光温室盆栽养护1~2个月，选取带芽的根状茎150株，置于流水中冲洗40min，再用中性肥皂水洗刷根状茎的表面，然后将所选取的外植体剪切成2~4 cm长的带芽茎段，经70%的酒精消毒10 s，再用0.1%的升汞消毒30分钟，最后用无菌水冲洗5次；

（2）无菌苗培养：在超净工作台上和无菌条件下，将步骤（1）中消毒处理后的外植体剪去接触消毒液的伤口部位，留1~2 cm带芽茎段接种在含有诱导培养基的培养瓶中，其置于白色荧光灯灯为光源的环境下，控制光量40 μmol·m^-2·s^-1，设定光照时间12 h·d^-1，温度（25±1）℃，培养18天，长成4~6 cm的无菌苗；经过诱导培养基的培养，外植体的诱导率明显高于传统的愈伤组织诱导的不定芽，其诱导效果提高30%以上。

（3）增殖和生根培养：将步骤（2）中长成的组培苗，剪切成长度为1.5~2.0 cm带有1~2个腋芽的茎段，转接到增殖培养基中进行增殖培养，在该培养基中同时可获得健壮的生根苗，可以省去专门的壮苗培养和生根培养阶段，一个周期40天的繁殖倍数为4.2倍，生根率达到100%，并对存活的植株后期生长进行进一步观察，后代植珠保持母株优良性状，无明显变异情况。

以上以较佳实例公开了本发明，然其并非用以限制本发明，凡采用等同替换或等效变换方式获得的技术方案，均落在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种野生杜衡组织培养方法，其特征在于：所述步骤如下：

（1）选材及消毒处理：选取生长健壮、无病虫害的野生杜衡植株，然后进行消毒处理；；

（2）无菌苗培养：在超净工作台上和无菌条件下，将步骤（1）中消毒处理后的外植体剪去接触消毒液的伤口部位，留1~2 cm带芽茎段接种在含有诱导培养基的培养瓶中，其置于白色荧光灯为光源的环境下，控制光量40 μmol·m^-2·s^-1，设定光照时间12 h·d^-1，温度（25±1）℃，培养25天，长成4~6 cm的无菌苗；所述诱导培养基为：WPM + 0.05 mg/L NAA+30 g·L^-1蔗糖+ 6.3 g·L^-1卡拉胶，pH值为5.8；

（3）增殖和生根培养：将步骤（2）中长成的组培苗，剪切成长度为1.5~2.0 cm带有1~2个腋芽的茎段，转接到增殖培养基中进行增殖培养；增殖培养基为：WPM + 0.1 mg/L NAA +1.00 mg/L 6-BA + 30 g·L^-1蔗糖+ 6.3 g·L^-1卡拉胶，pH值为5.8。

2.根据权利要求1所述的杜衡组织培养繁殖方法杜衡组织培养繁殖方法，其特征在于:所述步骤1）中取材后，移至日光温室盆栽养护1~2个月，选取带芽的根状茎，置于流水中冲洗40min，再用中性肥皂水洗刷根状茎的表面，然后用无菌水冲洗干净后，将所选取的外植体剪切成2~4 cm长的带芽茎段，经70%的酒精消毒10 s，再用0.1%的升汞消毒30分钟，最后用无菌水冲洗5次，所述带芽的根状茎为带有腋芽的短节间且下端集生肉质根，茎段有1~2叶。

3.根据权利要求1所述的杜衡组织培养繁殖方法，其特征在于:WPM基本培养基由常量元素、微量元素、铁盐和有机成分组成。

4.根据权利要求3所述的杜衡组织培养繁殖方法，其特征在于:所述WPM基本培养基中，

所述的常量元素为： NH₄NO₃400 mg/L、Ca(NO₃)₂·4H₂O 556 mg/L、CaCl₂·2H₂O 96 mg/L、MgSO₄·7H₂O 370 mg/L、KH₂PO₄170 mg/L、K₂SO₄990 mg/L。

5.根据权利要求3所述的杜衡组织培养繁殖方法，其特征在于:所述的微量元素为：MnSO₄·H₂O 22.3 mg/L、ZnSO₄·7H₂O 8.6 mg/L、H₃BO₃6.2 mg/L、Na₂MoO₄·2H₂O 0.25 mg/L、CuSO₄·5H₂O 0.025 mg/L、CoCl₂.6 H₂O0.025 mg/L。

6.根据权利要求3所述的杜衡组织培养繁殖方法，其特征在于:所述的铁盐为： Na₂·EDTA 37.3 mg/L、FeSO₄·7H₂O 27.8 mg/L。

7.根据权利要求3所述的杜衡组织培养繁殖方法，其特征在于:所述的有机成分为：肌醇100 mg/L、甘氨酸2 mg/L、盐酸硫胺素1 mg/L、盐酸吡哆醇0.5 mg/L、烟酸0.5 mg/L。