CN110772507A

CN110772507A - 盐酸胍作为治疗癌症/肿瘤的药物的用途

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Publication number: CN110772507A
Application number: CN201911153206.7A
Authority: CN
Inventors: 孔彦平; 刘锦红
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2019-11-22
Filing date: 2019-11-22
Publication date: 2020-02-11
Anticipated expiration: 2039-11-22
Also published as: CN110772507B; US11617729B2; US20210154159A1

Abstract

本发明公开了盐酸胍作为治疗癌症/肿瘤的药物的用途，属于医药领域。根据本发明，发明人发现盐酸胍能破坏癌细胞表面的极性分子与所摄取的大分子形成的氢键，进而证实了盐酸胍可以抑制癌细胞的摄取。本发明提供了盐酸胍在患有癌症/肿瘤的对象的治疗中的新用途和预防癌症手术后的复发。所述盐酸胍施用的剂量为10‑35mg/kg·日，该剂量的盐酸胍具有明显抑制癌细胞摄取DNA的作用，进而能够有效抑制癌细胞增殖；同时盐酸胍注射药物9天后对肝癌肿瘤抑制率可以达到42%；盐酸胍注射药物7天后对肺癌肿瘤抑制率可以达到56.8%。因此，盐酸胍适用于患有癌症/肿瘤的患者，或者能够预防癌症患者手术后的病情复发。

Description

盐酸胍作为治疗癌症/肿瘤的药物的用途

技术领域

本发明属于医药领域，涉及盐酸胍在治疗和预防癌症方面的用途，具体地说是盐酸胍作为治疗癌症/肿瘤的药物的用途。

背景技术

盐酸胍的别名为氨基甲脒盐酸盐，其分子式是CH₅N₃·HCl，其分子量为95.54，其结构为：

目前，盐酸胍主要用于治疗Eaton-Lambert综合征（又称类重症肌无力综合征）引起的肌无力，其可以使神经兴奋时增加乙酰胆碱的释放，还可以使肌肉的去极化和复极时间延长。

癌症细胞有很多基因突变，主要表现为异常的代谢和快速生长，癌症细胞摄取营养物质的过程与正常细胞明显不同。癌症细胞具有胞饮（内吞）功能，能够快速且高水平的摄取葡萄糖满足自身快速生长的需要；并且癌症细胞在葡萄糖不足的情况下，还能够直接利用血液中的脂肪酸和蛋白来满足其快速生长的需要。癌症细胞衍生出的胞饮（内吞）功能与其基因突变有关。例如，肝癌细胞和乳腺癌细胞能够摄取大分子核酸也与其胞饮功能有关，而正常脏器细胞如肝细胞则没有这一功能。癌细胞快速摄取营养使得其能够快速生长，增殖。而癌细胞在摄取细胞外的大分子时，这些大分子（如核酸）首先要与癌细胞表面的极性分子形成非共价键如氢键，然后启动胞饮完成摄取，进而实现癌细胞增殖。

因此，快速生长的癌细胞需要对营养物质进行快速摄取。如果能抑制癌细胞的摄取便能抑制癌细胞生长。

发明内容

本发明发现盐酸胍能够破坏或者干扰癌细胞表面的极性分子与所摄取的大分子形成的氢键，进而抑制癌细胞快速摄取，实验证明盐酸胍抑制癌细胞的生长。这一发现对于盐酸胍作为癌细胞生长抑制剂的用途具有深远的影响，并且使得本发明能够确定新型治疗性应用，特别是在癌症治疗的领域。

因此，根据本发明，提供了盐酸胍作为治疗癌症/肿瘤的药物的用途。

其中，待治疗的患者患有癌症/肿瘤。

待预防的患者可以是经过癌症手术后、预防癌症复发的患者。

盐酸胍可以单独施用，还可以任何方便的药物形式（如片剂、液体制剂等）和途径（如口服、静脉、介入）给药施用，优选口服使用；也可以与其它化疗药物配合施用。在本适应症中，对于成年人，盐酸胍的施用方式为初始剂量125mg，每日三次；每三天增加一次剂量，每次每天增加125-500mg，最终剂量为：10-35mg/kg·日，或者依据病情、患者体质的不同应用更高的用量，或者至患者出现药物副作用；出现副作用时，则减回到前一剂量。

基于本发明，将盐酸胍施用于需要治疗的患者可以治疗和预防癌症/肿瘤。试验表明，盐酸胍（10-35mg/kg·日）剂量在抑制癌细胞摄取DNA具有明显作用，进而能够有效抑制癌细胞增殖；同时盐酸胍注射药物9天后对肝癌肿瘤抑制率可以达到42%；盐酸胍注射药物7天后对肺癌肿瘤抑制率可以达到56.8%。实验结果表明盐酸胍使患有癌症/肿瘤的动物的癌细胞显著抑制，具有明显的技术效果，可以明确地用于临床。临床上根据病人的情况不同，盐酸胍的剂量也可以在上述剂量基础之上进行调整。

本发明适用于癌症/肿瘤患者和待预防的患者，待预防的患者可以是经过癌症手术治愈后、预防癌症复发的患者。

附图说明

图1是实施例1中注射0ng/mL三碘甲状腺原氨酸抑制肝癌细胞对DNA摄取的荧光实验图；

图2是实施例1中注射1ng/mL三碘甲状腺原氨酸抑制肝癌细胞对DNA摄取的荧光实验图；

图3是实施例1中注射50ng/mL三碘甲状腺原氨酸抑制肝癌细胞对DNA摄取的荧光实验图；

图4是实施例1中注射100ng/mL三碘甲状腺原氨酸抑制肝癌细胞对DNA摄取的荧光实验图；

图5是实施例1中注射0mmol/L盐酸胍抑制肝癌细胞对DNA摄取的荧光实验图；

图6是实施例1中注射1mmol/L盐酸胍抑制肝癌细胞对DNA摄取的荧光实验图；

图7是实施例1中注射25mmol/L盐酸胍抑制肝癌细胞对DNA摄取的荧光实验图；

图8是实施例1中注射50mmol/L盐酸胍抑制肝癌细胞对DNA摄取的荧光实验图；

图9是实施例2中盐酸胍抑制肝癌细胞增殖图。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明做进一步详细说明，应当理解所描述的实施例仅用于解释本发明，并不限定本发明。

荧光标记试剂盒（FISH）购自美国公司 MIRUS，操作按试剂盒说明书；

PCR聚合酶、CellTiter 96® AQueous One Solution 试剂盒购自Promega公司；

G-50Sephadex（纯化柱）购自通用电气（中国）医疗集团生命科学部；

肝细胞LO2和肝癌细胞Huh7来自细胞库ATCC；

1640培养基、FBS（胎牛血清）和DMEM培养基购自上海加科生物科技有限公司；

盐酸胍、PBS、福尔马林、酚-氯仿、三碘甲状腺原氨酸（T3）和96孔板购自Sigma-Aldrich；

荧光显微镜的型号为TCS SP，购自Leica公司；

H22小鼠肝癌细胞、LLC肺癌细胞株均由河北医科大学提供；

SPF级昆明小鼠、SPF级CK57BL小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司。

实施例1 盐酸胍抑制肝癌细胞摄取DNA的试验

经PCR（聚合酶链反应）获得1.8KB的AFP（胎甲球蛋白）DNA，用酚-氯仿提取并调成浓度1μg/mL。取5μg DNA加入Rhodamine (荧光标记物)，于37℃放置1小时后，经G-50Sephadex（纯化柱）上纯化。

取1640培养基，加入FBS（胎牛血清），其中FBS（胎牛血清）的质量为1640培养基的10%，备用。

取8组肝癌细胞Huh7接种至含有10% FBS（胎牛血清）的1640培养基中，置于含5%CO₂的培养箱中37℃培养12h。

其中四组分别加入0mmol/L、1mmol/L、25mmol/L、50mmol/L的盐酸胍，继续于上述培养箱中培养24h后，加入荧光标记的DNA，再培养8h，然后将培养得到的细胞用PBS冲洗3次并用4%的福尔马林固定。将上述固定的细胞用荧光显微镜照相，同样按上述步骤以三碘甲状腺原氨酸（T3）替换盐酸胍作为对照组，T3的浓度分别为：0 ng/mL，1ng/mL，50ng/mL，100ng/mL。

参见图1-4中给出的注射三碘甲状腺原氨酸抑制肝癌细胞对DNA的荧光摄取实验图，参见图5-8中给出的注射盐酸胍抑制肝癌细胞对DNA的荧光摄取实验图，由图可知，图5-8中显示的标记DNA，随着盐酸胍的浓度的增加在细胞内含量明显减少，这表明盐酸胍能够明显抑制DNA的摄取，而且有量效关系；而图1-4中对照组则不影响摄取。

实施例2 盐酸胍抑制肝癌细胞增殖试验

将肝细胞LO2和肝癌细胞Huh7分别接种至含有10% FBS（胎牛血清）的1640培养基中，置于含5%CO₂的培养箱中37℃培养12h；取上述培养得到的肝细胞LO2和肝癌细胞Huh7分别接种至96孔板上，每孔含有6×10³个细胞，于含5%CO₂的培养箱中37℃培养12h；加入不同含量的盐酸胍至96孔板上，使得96孔板上各孔中盐酸胍的最终浓度分别为：0μmol/L、10μmol/L、100μmol/L、1mmol/L、2 mmol/L、4 mmol/L、6mmol/L、8mmol/L、10 mmol/L、20 mmol/L，培养72h进行细胞增殖定量。使用CellTiter 96® AQueous One Solution 试剂盒对细胞进行测定。将20μL分析试剂加入，在吸光度490nm 读值。参见图9中给出的盐酸胍抑制肝癌细胞增殖图，由图9可知，盐酸胍在达到6 mmol/L时开始明显抑制癌细胞Huh7的生长，但并不影响肝细胞LO2的生长；而当盐酸胍浓度增加到20mmol/L时，肝细胞LO2和肝癌细胞Huh7均被明显抑制。

实施例3 盐酸胍抑制小鼠肝癌肿瘤生长试验

肿瘤细胞悬液制备：取H22小鼠肝癌细胞接种至含10% FBS（胎牛血清）的1640培养基中，置于含5%CO₂的培养箱中37℃培养12h；待细胞增长至对数期时，将上述培养基调配成细胞悬液，控制H22小鼠肝癌细胞浓度为1×10⁶个/mL，得肿瘤细胞悬液备用。

动物肿瘤模型建立：取30只SPF级昆明小鼠，雄性（20±2）g。将上述小鼠饲养于无特定病原体的实验室内，随机分成3组，分别为盐水组、盐酸胍低剂量组和盐酸胍高剂量组，每组10只。分别对各组小鼠右腋下皮肤给予酒精消毒，用1mL注射器抽取0.2 mL上述肿瘤细胞悬液，接种于小鼠消毒部位，经皮下缓慢注射，全部小鼠给予充足的水和饲料，保持垫料干爽，观察小鼠的肿瘤生长情况，一般在造模后7天能在小鼠腋下触摸到明显的肿瘤结节即为造模成功。

对照试验：针对上述动物肿瘤模型，盐酸胍低剂量组按240mg/kg剂量腹腔注射药液，一天2次，一次0.3mL，连续给药9天；盐酸胍高剂量组按480mg/kg剂量腹腔注射药液，一天2次，一次0.3mL，连续给药9天；盐水组给予生理盐水，一天2次，一次0.3mL，连续给药9天；监测肿瘤体积，其中肿瘤体积（cm³）=1/2长×宽² 。

分别计算抑瘤率，抑瘤率=（盐水组小鼠肿瘤的平均体积-盐酸胍组小鼠肿瘤的平均体积）/盐水组小鼠肿瘤的平均体积×100%，具体抑瘤情况见表1：

表1 盐酸胍抑制小鼠肝癌肿瘤生长情况一览表

由表1可知，盐酸胍低剂量组注射药物9天后的肿瘤抑制率为24%，盐酸胍高剂量组注射药物9天后的肿瘤抑制率为42%，因此，盐酸胍能够明显抑制小鼠肝癌肿瘤生长。

实施例4 盐酸胍抑制小鼠肺癌肿瘤生长试验

肿瘤细胞悬液制备：取LLC肺癌细胞株接种至含10%FBS（胎牛血清）的DMEM培养基中，置于含5%CO₂的细胞培养箱中37℃培养12h；待细胞增长至对数期时，将上述培养基调配成细胞悬液，浓度为1×10⁶个/mL，得肺癌细胞悬液备用。

动物肿瘤模型建立：取20只SPF级CK57BL小鼠，雄性（20±2）g。将上述小鼠饲养于无特定病原体的实验室内，对小鼠右腋下皮肤给予酒精消毒，用1mL注射器抽取0.2mL上述肿瘤细胞悬液，接种于小鼠消毒部位，经皮下缓慢注射，全部小鼠给予充足的水和饲料，保持垫料干爽，观察小鼠的肿瘤生长情况，一般在造模后10天左右能在小鼠腋下触摸到明显的肿瘤结节即为造模成功。

对照试验：针对上述小鼠随机分为2组，分别为盐水组和盐酸胍组，每组10只。盐水组给予生理盐水，一天一次，一次0.3mL，连续给药7天；盐酸胍组按480mg/kg剂量腹腔注射药液，一天一次，一次0.3mL，连续给药7天；分别于第1，3，5，7天监测肿瘤体积，其中肿瘤体积（cm³）=1/2长×宽² 。

分别计算抑瘤率，抑瘤率=（盐水组小鼠肿瘤的平均体积-盐酸胍组小鼠肿瘤的平均体积）/盐水组小鼠肿瘤的平均体积×100%，具体抑瘤情况见表2：

表2 盐酸胍抑制小鼠肺癌肿瘤生长情况一览表

由表2可知，盐酸胍组注射药物7天后的肿瘤抑制率为56.8%，因此，盐酸胍能够明显抑制小鼠肺癌肿瘤生长。

Claims

1.盐酸胍作为治疗癌症/肿瘤的药物的用途。

2.权利要求1所述的用途，其特征在于，待治疗的患者患有癌症/肿瘤。

3.权利要求1所述的用途，其特征在于，待预防的患者为经历过癌症手术的患者。

4.权利要求1所述的用途，其特征在于，所述盐酸胍抑制癌细胞的摄取达到抑制癌细胞生长。

5.权利要求1所述的用途，其特征在于，所述盐酸胍的剂量为10-35mg/kg·日。

6.权利要求5所述的用途，其特征在于，所述盐酸胍自125mg/次、一日三次开始，逐渐加量至10-35mg/kg·日。

7.权利要求1所述的用途，其特征在于，盐酸胍为片剂、液体制剂。