CN110759924A - 脱镁叶绿酸a甲酯的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于化学制药合成领域。更具体而言，本发明涉及脱镁叶绿酸a甲酯的制备方法，以及通过该方法得到的脱镁叶绿酸a甲酯在制备光敏剂中的应用。本发明方法经济环保和一次加工量大，目标产物纯度和收率高。

Description

脱镁叶绿酸a甲酯的制备方法

技术领域

本发明属于化学制药合成领域。更具体而言，本发明涉及脱镁叶绿酸a甲酯的制备方法，并在此基础上可合成卟啉和二氢卟酚，并最终用于光动力治疗。

背景技术

光动力疗法是治疗恶性肿瘤的一种新型治疗方法，正是因为恶性细胞的生物化学特性才使光敏剂能够选择性聚集在肿瘤组织中，并且在特定波长光照射下该组织会发生反应，产生单线态氧和其他活性基团，对肿瘤细胞产生毒性作用(光动力治疗肿瘤，第二和第三代光敏剂.Ed.J.G.Moser,Harwood Academic Publishers,1998,阿姆斯特丹；AllmanR.,Cowburn P.,Mason M.“光动力治疗与电离辐射相结合对头颈部鳞状细胞癌的治疗效果”；Br.J.Cancer.2000.Vol.83.P.655-661)。

在全球光动力治疗的临床实践中最常用的卟啉和二氢卟吩是由脱镁叶绿酸a甲酯制备而成。因此，将精氨酸-二氢卟酚e6和赖氨酰-二氢卟吩P6(已取得专利)作为光敏剂用于光动力疗法进行癌症治疗。(US5378835(A)：水溶性脱镁叶绿酸a钠盐的制备方法(Methodof producing water-soluble sodium pheophorbide a))。

脱镁叶绿酸a甲酯是将脱镁叶绿素(脱镁叶绿素是由叶绿素经酸处理获取)进行醇解反应制备。而叶绿素可从植物原料中进行提取。这种新型高效的从植物原料的个别叶绿素衍生物中制备制剂的方法是当前迫切任务，包括制备高纯度、高质量和高产量的脱镁叶绿酸a甲酯。

根据1940年文献描述，脱镁叶绿酸a甲酯是由脱镁叶绿酸盐a和重氮甲烷两者相互发生反应制备而成(FischerН.,Stern A.Die chemie des Pyrrols.-Bd.II,1940.-S.63-65)。该脱镁叶绿酸盐a是由荨麻叶绿素经化学反应制得。

现有制备脱镁叶绿酸a甲酯的方法，是从植物原料中的叶绿素衍生物中提取，即从Serratula coronate L(麻花头属)类植物的脂溶性成分提取，对叶绿素衍生物进行甲基化作用并对化合物进行色谱分离制备(КучинА.В.,КармановаЛ.П.,БелыхД.В.“脱镁叶绿酸a甲酯制备方法”，专利号99106221，2001年3月20日公布)。

现有制备脱镁叶绿酸a甲酯的方法是用重氮甲烷进行酯化反应或将脱镁叶绿素混合物进行醇解反应制得(卟啉:结构，性质，合成；К.А.Аскаров,Б.Д.Березинидр.-科学杂志189-191页；1985年)，从干燥的碎荨麻叶中提取脱镁叶绿酸a甲酯：将5g脱镁叶绿素混合物放入含5％硫酸的400ml甲醇溶液中，在避光处搅拌混合15小时。接着用400ml氯仿进行稀释，用清水冲洗(2*1L)，然后蒸发干燥，再加入甲醇随后会从二氯甲烷溶液中析出沉淀，获得脱镁叶绿酸a甲酯和脱镁叶绿酸b甲酯的混合物。

从陆上植物原料中制备脱镁叶绿酸a甲酯的主要缺点是：目标产物产量低。

现有从微藻中制备脱镁叶绿酸a甲酯的方法是：先从微藻中提取叶绿素a，在45～50℃温度下，将叶绿素a在浓乙酸溶液中用25～30kHz频率的超声波进行脱金属反应，2～2.5小时后可获得脱镁叶绿酸a。将脱镁叶绿酸a沉淀析出分离，在50～55℃温度下，将脱镁叶绿酸a沉淀在含有硫酸的四氢呋喃溶液中进行甲基化反应1～1.5小时，然后将目标产物沉淀物分离析出，向二氯甲烷中加入乙醇进行二次沉淀，得到脱镁叶绿酸a甲酯。产物质量取决于超声波处理程度和水平，1000g钝顶螺旋藻(Spirulina Platensis)可制备3.1～3.5g目标产物——脱镁叶绿酸a甲酯。但以上这种制备方法不足之处是：引进用于超声波处理的复杂设备存在难度。

与本发明更接近脱镁叶绿酸a甲酯的制备发明最接近的现有技术是：用于光动力学治疗的水溶性卟啉衍生物、其使用和制备方法(Water-soluble porphyrin derivativesfor photodynamic therapy,their use and manufacture)(US6777402(B2),公告日：2004年8月17日)。所述制备方法包括：将植物原料进行混合，如：钝顶螺旋藻、或极大螺旋藻(Spirulina maxima)、或小球藻(Chlorella)、或干荨麻叶粉、或冻干菠菜叶，然后将其放入含有浓硫酸的甲醇溶液中在室温下放置3小时。这样可从植物原料中提取出叶绿素a，然后使用硫酸对叶绿素a进行脱金属反应得到脱镁叶绿酸a，再用甲醇对脱镁叶绿酸a进行酯化反应得到脱镁叶绿酸a甲酯。反应产物包含甲醇及溶于其中的目标产物--脱镁叶绿酸a甲酯、剩余甲醇、剩余硫酸、无叶绿素的植物原料残渣、以及未完全提取叶绿素的植物原料、未完全脱镁的叶绿素、未完全甲基化的脱镁叶绿酸a。然后从反应产物中将目标产物分离出来。用甲醇将目标产物稀释并用Celit硅藻土进行过滤，后用甲醇将沉淀物进行多次反复冲洗。用己烷对滤液进行二次萃取，继而以氯仿萃取出目标产物，再用氯化钾水溶液洗涤，最后对氯仿溶液进行干燥去除水分，并将其他溶剂蒸发。此时10g钝顶螺旋藻可制备得0.06g脱镁叶绿酸a甲酯。为了对脱镁叶绿酸a甲酯沉淀进行进一步提纯，以氯仿溶解后，经氧化铝色谱分离(己烷-氯仿作为洗脱剂)，收集洗脱液，蒸馏去除溶剂，加入少许二氯甲烷，溶解后，加入甲醇析出沉淀，对该沉淀再以上述的二氯甲烷和甲醇重复操作一次，得到脱镁叶绿酸a甲酯。此时脱镁叶绿酸a甲酯产量<0.03g，纯度<95％。

上述这种制备方法的缺点是：

1.不能一次性加工大量植物原料(不能多于500g)：

-从植物原料中提取叶绿素a，然后脱金属化反应得到脱镁叶绿酸a，用甲醇将脱镁叶绿酸a进行再酯化反应，在整个操作过程中由于各种试剂不断的加入会导致最终反应物溶液体积增加很多；

-反应物高粘稠度，需要用到专门的设备(搅拌器、过滤器等)。

2.在剩余反应物里很多无效、废弃的物质包括：不含叶绿素的植物原料、以及未完全提取叶绿素的植物原料，随着溶剂体积不断增加，阻碍了目标产物提纯、过滤等操作。

3.10g钝顶螺旋藻制备得0.06g脱镁叶绿酸a甲酯，但是纯度低。在用氧化铝色谱分离法进行进一步提纯后，产物纯度也不会超过95％，而且此时目标产物的产量减少2倍(10g海藻中制备脱镁叶绿酸a甲酯的产量小于0.03g)。

4.用于制备脱镁叶绿酸a甲酯的溶剂(甲醇、己烷、氯仿)都存在于混合溶液中且没法分离和回收利用。这样的话，将冲洗溶液排到下水道里的方式从经济角度看是没什么经济效益的，且从生态环保角度来看此做法也是危险有害的。

发明内容

本发明旨在提供一种用于从微藻中，高效且经济环保地制备脱镁叶绿酸a甲酯的方法。所述方法能够降低对生态环境的危害性，并且提高目标产物的纯度和产量。

本发明通过具有如下特征的方法实现了上述发明目的：

一种脱镁叶绿酸a甲酯的制备方法，包括下列步骤：

(a)将一种或多种植物原料加入含硫酸的甲醇溶液中，混合搅拌反应40小时以上，得到反应产物；

(b)过滤反应产物，浓缩滤液，加入水中，以强碱中和酸，形成沉淀，再经硅藻土过滤分离沉淀；

(c)用水、己烷(或石油醚)冲洗沉淀，弃滤液；依次用丙酮、丙酮和氯仿(或二氯甲烷)的混合液洗涤沉淀；合并洗涤液，蒸发分离得到脱镁叶绿酸a甲酯；再用醇和己烷(或石油醚)分别冲洗固体，干燥；以及

(d)固体以二氯甲烷(或氯仿)溶解后，经硅胶柱色谱分离，以二氯甲烷(或氯仿)和醚作为洗脱剂，洗脱液浓缩后，向二氯甲烷(或氯仿)溶液中加入醇，得到脱镁叶绿酸a甲酯沉淀，过滤，醇冲洗，干燥。

根据本发明，所述植物原料选自螺旋藻、小球藻、绿藻、干荨麻叶、冻干菠菜叶、紫杉叶和蚕砂，优选为螺旋藻。

根据本发明，所述螺旋藻为钝顶螺旋藻或极大螺旋藻，优选为钝顶螺旋藻。

根据本发明，步骤(a)中将所述植物原料加入含硫酸的甲醇溶液中室温下搅拌反应40-50hr。

根据本发明，步骤(a)包括从植物原料中提取叶绿素a，硫酸对叶绿素a脱金属反应得到脱镁叶绿酸a，甲醇对脱镁叶绿酸a酯化反应得到含目标产物脱镁叶绿酸a甲酯的反应产物。

根据本发明，所述含有硫酸的甲醇溶液中甲醇与硫酸的比率为50:1～10:1，例如40:1、30:1或20:1。

根据本发明，步骤(b)中的强碱为NaOH或KOH，浓度优选为10％。

根据本发明，步骤(c)中丙酮和氯仿(或二氯甲烷)的混合液比例为1:1。

根据本发明，步骤(c)和(d)中的醇为甲醇或乙醇，优选为甲醇。

根据本发明，步骤(d)中的干燥温度为18-30℃。

根据本发明，步骤(d)中干燥得到的产物纯度>95％，优选>96％，>97％，>98％或99％。

通过本发明方法得到的脱镁叶绿酸a甲酯在制备光敏剂(例如，卟啉和二氢卟酚)中的应用。

具体而言，本发明将一种或多种植物原料混合物，加入含硫酸的甲醇溶液中室温下搅拌40小时以上，例如40小时、42小时、44小时、46小时、48小时或50小时，通过反应得到脱镁叶绿酸a甲酯粗产物；过滤粗产物，滤液浓缩后加入水中，以10％NaOH中和酸，形成沉淀物，经Celite硅藻土过滤分离沉淀物；用水、己烷冲洗沉淀物以去除部分杂质；再依次用丙酮、丙酮和氯仿的混合液(例如1:1)洗涤，合并洗涤液，蒸发分离得到脱镁叶绿酸a甲酯；接着用甲醇和己烷分别冲洗固体，干燥，得到脱镁叶绿酸a甲酯固体精品；固体精品以二氯甲烷溶解后，经硅胶柱色谱分离，以二氯甲烷和乙醚作为洗脱剂，洗脱液浓缩后，向二氯甲烷溶液中加入甲醇，得到脱镁叶绿酸a甲酯沉淀，过滤，甲醇冲洗，18-30℃下干燥，得到脱镁叶绿酸a甲酯纯品，纯度>97％。

本发明的主要特点是：粗产物反应时间40小时以上；粗产物过滤后需浓缩滤液，目的是从反应物中去除废弃物质和减少后续处理的体积，用碱中和酸形成沉淀，并经Celite硅藻土过滤分离，先以脱镁叶绿酸a甲酯不溶性的水和溶剂冲洗杂质，再以可溶性的有机溶剂洗涤溶解；最后通过硅胶柱色谱分离法进一步纯化，从而得到目标产物脱镁叶绿酸a甲酯。该目标产物纯度高(>97％)，收率高(0.35％)，实现了高纯度和高收率之间的平衡。

有益效果

1.大大提高了微藻钝顶螺旋藻的目标产物加工产量，可一次性加工处理0.1kg～10kg原料用来制备脱镁叶绿酸a甲酯，1kg海藻可制备出3～10g脱镁叶绿酸a甲酯(产量多少取决于原料质量)。

2.目标产物纯度提高到95％以上，尤其97～99.9％。产物纯度根据Fufrhop J.H.,Smith K.M.–In:卟啉和金属卟啉/Ed.K.M.Smith,Amsterdam etc.:Elesvier,1975,P.880-881确定。

3.该制备方法更环保、更经济节约，试验溶剂可回收再利用，并且有效降低废水废物排放。

具体实施方式

实施例1

往18L的甲醇中注入3kg小球藻，缓慢加入0.9L浓H₂SO₄，然后在22℃下混合搅拌反应48小时。

滤除多余废弃物质，滤液蒸发浓缩，剩余物加入水中，用10％的NaOH进行中和形成沉淀物。将沉淀物放入冷却箱内12小时，分层，取出并去除澄清液体，剩余部分通过硅藻土过滤，用水反复冲洗5次，再用1800ml己烷对产物进行冲洗，以去除杂质。接着依次用丙酮(2100ml)及丙酮:氯仿(1:1)(5000ml)的混合液对目标产物进行冲洗，合并洗涤液，蒸发分离得到目标产物--脱镁叶绿酸a甲酯。然后用甲醇和石油醚依次冲洗固体，干燥。

固体以二氯甲烷溶解后，采用硅胶柱色谱分离法(层析法)提纯(3根硅胶柱，每根80g硅胶；每根柱子里洗脱剂二氯甲烷和乙醚比例为900:45)，将主要产物集中起来进行浓缩。向二氯甲烷溶液中加入甲醇，形成脱镁叶绿酸a甲酯沉淀。过滤，以甲醇对沉淀物冲洗，22℃下干燥。

产物：10.5g纯度98％的脱镁叶绿酸a甲酯(收率0.35％)。

实施例2：

往60L的甲醇中注入10kg钝顶螺旋藻，缓慢加入3L浓H₂SO₄，然后在室温下混合搅拌反应40小时。

滤除多余废弃物质，滤液蒸发浓缩，剩余物加入水中，用10％的KOH进行中和形成沉淀物。将沉淀物放入冷却箱内18小时，分层，取出并去除澄清液体，剩余部分通过硅藻土过滤，用水反复冲洗10次，再用8L己烷对产物进行冲洗，以去除杂质。接着依次用丙酮(9L)及丙酮:氯仿(1:1)(20L)的混合液对目标产物进行冲洗，合并洗涤液，蒸发分离得到目标产物--脱镁叶绿酸a甲酯。然后用甲醇和己烷依次冲洗，干燥。

固体以氯仿溶解后，进行硅胶柱色谱分离法(层析法)提纯(2根硅胶柱，每根400g硅胶；每根柱子里洗脱剂氯仿和乙醚比例为900:45)，将主要产物集中起来进行浓缩。向氯仿溶液中加入甲醇，形成脱镁叶绿酸a甲酯沉淀。过滤，以甲醇对沉淀物冲洗，30℃温度下干燥。

产物：50g纯度97％的脱镁叶绿酸a甲酯(收率0.5％)。

实施例3

往0.6L的甲醇中注入0.1kg钝顶螺旋藻，缓慢加入0.03L浓H₂SO₄，然后在22℃下混合搅拌反应50小时。

滤除多余废弃物质，滤液蒸发浓缩，剩余物加入水中，用10％的NaOH进行中和形成沉淀物。将沉淀物放入冷却箱内24小时，分层，取出并去除澄清液体，剩余部分通过硅藻土过滤，用水反复冲洗3次，再用60ml己烷对产物进行冲洗，以去除杂质。接着依次用丙酮(70ml)及丙酮:氯仿(1:1)(200ml)的溶液对目标产物进行冲洗，合并洗涤液，蒸发分离得到目标产物--脱镁叶绿酸a甲酯。然后用甲醇和己烷依次冲洗，干燥。

固体以二氯甲烷溶解后，进行硅胶柱色谱分离法(层析法)提纯(1根硅胶柱，内含40g硅胶；每根柱子里洗脱剂二氯甲烷和乙醚比例为900:45)，将主要产物集中起来进行浓缩。向二氯甲烷溶液中加入甲醇，形成脱镁叶绿酸a甲酯沉淀。过滤，以甲醇对沉淀物冲洗，室温下空气干燥。

产物：1g纯度99.9％的脱镁叶绿酸a甲酯(收率1％)。

Claims (10)

1.一种脱镁叶绿酸a甲酯的制备方法，包括下列步骤：

(a)将一种或多种植物原料加入含硫酸的甲醇溶液中，混合搅拌反应40小时以上；

(b)过滤反应产物，浓缩滤液，加入水中，以强碱中和酸，形成沉淀，再经硅藻土过滤分离沉淀；

(c)用水、己烷或石油醚冲洗沉淀，弃滤液；依次用丙酮、丙酮和氯仿或二氯甲烷的混合液洗涤沉淀；合并洗涤液，蒸发分离得到脱镁叶绿酸a甲酯；再用醇和己烷或石油醚分别冲洗固体，干燥；以及

(d)固体以二氯甲烷或氯仿溶解后，经硅胶柱色谱分离，以二氯甲烷或氯仿和醚作为洗脱剂，洗脱液浓缩后，向二氯甲烷或氯仿溶液中加入醇，得到脱镁叶绿酸a甲酯沉淀，过滤，醇冲洗，干燥。

2.权利要求1的制备方法，其中所述植物原料选自螺旋藻、小球藻、绿藻、干荨麻叶、冻干菠菜叶、紫杉叶和蚕砂，优选为螺旋藻。

3.权利要求2的制备方法，其中所述螺旋藻为钝顶螺旋藻或极大螺旋藻，优选为钝顶螺旋藻。

4.权利要求1的制备方法，其中步骤(a)中将所述植物原料加入含硫酸的甲醇溶液中室温下混合搅拌反应40-50小时。

5.权利要求1的制备方法，其中步骤(b)中的强碱为NaOH或KOH，浓度优选为10％。

6.权利要求1的制备方法，其中步骤(c)中丙酮和氯仿或二氯甲烷的混合液比例为1:1。

7.权利要求1的制备方法，其中步骤(c)和(d)中的醇为甲醇或乙醇，优选为甲醇。

8.权利要求1的制备方法，其中步骤(d)中的干燥温度为18-30℃。

9.权利要求1的制备方法，其中步骤(d)中干燥得到的产物纯度>95％，优选>96％，>97％，>98％或99％。

10.由权利要求1-9任一项的制备方法得到的脱镁叶绿酸a甲酯在制备光敏剂中的应用。