CN104193753A - 一种由红豆杉枝叶提取物制备光敏剂hpph的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种由红豆杉枝叶提取物制备光敏剂HPPH的方法，包括如下步骤：(1)叶绿素-a的提取；(2)脱镁叶绿酸-a甲酯的制备；(3)焦脱镁叶绿酸-a甲酯的合成；(4)2-(1-氧-正己基乙基)-2-去乙烯基焦脱镁叶绿酸-a正己酯的合成；(5)2-[1-(氧-正己基)]-2-去乙烯基焦脱镁叶绿酸-a(HPPH)的合成。本发明通过对红豆杉枝叶的再提取综合利用获得叶绿素作为HPPH的合成原料，实现了红豆杉枝叶的合理利用。
Description
技术领域
本发明涉及一种由红豆杉枝叶提取物制备光敏剂HPPH的方法。
背景技术
一类新药新型抗肿瘤光敏剂2-[1-hexyloxyethyl]-2-devinylpyropheophorbide-a，HPPH(Photochlor)，又名红光吩，其为第二代光敏剂，属于二氢卟酚类化合物，其结构式如下所示：
RPCI研究人员从绿色植物中提取、纯化以及半合成的二氢卟酚类化合物，通过检测这些化合物的光谱学特性、光毒性、暗毒性和体外抑癌试验，进行构效关系研究，得到结构单一、长激发波长和暗毒性小的二氢卟酚类化合物HPPH。
HPPH具有很好的光动力活性、理想的作用光谱以及很好的靶向性，对肿瘤组织的穿透率高，临床用于肺癌、食管癌、头面颈癌、膀胱癌、胃癌等多种实体肿瘤的治疗；较第一代光敏剂相比，其光毒性明显降低，基本不需要避光，用量小，使用方便，是一种极富市场潜力的PDT治疗癌症用光敏剂。
发明内容
在已有技术的基础上，本发明的目的在于提供一种由红豆杉枝叶提取物制备光敏剂HPPH的方法。
为了达到上述目的，本发明采用了如下技术方案：
一种由红豆杉枝叶提取物制备光敏剂红光吩(HPPH)的方法，所述方法包括如下步骤：
(1)叶绿素-a的提取：
从红豆杉枝叶中提取叶绿素-a；
(2)脱镁叶绿酸-a甲酯(Methyl Pheophorbide-a)的制备
取叶绿素-a加入硫酸甲醇溶液中溶解，室温搅拌，然后加饱和碳酸氢钠水溶液及碳酸氢钠粉末，并调节pH至7～8，然后蒸发去除甲醇，分离得到有机相，干燥，过滤，浓缩得到墨绿色油状物，重结晶，得到墨绿色固体，即脱镁叶绿酸-a甲酯(Methyl Pheophorbide-a)；
(3)焦脱镁叶绿酸-a甲酯(Methyl Pyropheophorbide-a)的合成
将脱镁叶绿酸-a甲酯溶于2,4,6-三甲基吡啶，在惰性气体保护下加热回流，待反应结束后，去除溶剂，层析，将得到的洗脱液去除溶剂，抽滤，得到蓝黑色固体粉末，即焦脱镁叶绿酸-a甲酯(Methyl Pyropheophorbide-a)；
(4)2-(1-氧-正己基乙基)-2-去乙烯基焦脱镁叶绿酸-a正己酯(HPPH Hexyleaster)的合成
向反应容器中加入HBr/HOAc溶液，然后在搅拌的条件下将焦脱镁叶绿酸-a甲酯缓慢加入，室温下进行水解反应，待反应结束后，将去除冰醋酸后的产物冷却至室温，然后向其中加入正己醇搅拌溶解，在惰性气体保护下，置于冰箱中冷藏过夜进行反应，待反应结束后，再将产物放置于室温下进行反应，至2-(1-正己氧基乙基)-2-去乙烯基焦脱镁叶绿酸-а-甲酯全部转化为2-(1-正己氧基乙基)-2-去乙烯基焦脱镁叶绿酸-а正己酯；
(5)2-[1-(氧-正己基)]-2-去乙烯基焦脱镁叶绿酸-a(HPPH)的合成
在惰性气体保护下，将2-(1-正己氧基乙基)-2-去乙烯基焦脱镁叶绿酸-a正己酯加入THF中，搅拌溶解，然后加入1.3％氢氧化钠/甲醇/水混合溶液，在室温下进行反应，待反应结束后，得到2-[1-(氧-正己基)]-2-去乙烯基焦脱镁叶绿酸-a(HPPH)。
优选地，步骤(1)叶绿素-a的提取方法为：
将红豆杉枝叶提取10-去乙酰基巴卡丁III后的产物加入丙酮中，控制提取10-去乙酰基巴卡丁III后的产物的重量g与丙酮的体积ml比为1:1～1:10(例如1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8或1:9)，加热回流8～14h(例如8.5h、9h、9.5h、10h、10.5h、11h、11.5h、12h、12.5h、13h或13.5h)，然后经过氧化铝层析，由二氯甲烷洗脱获得叶绿素-a。
优选地，步骤(2)中每160g叶绿素-a加入2～4升(例如2.2升、2.4升、2.6升、2.8升、3升、3.2升、3.4升、3.6升或3.8)的硫酸甲醇溶液。
优选地，室温搅拌的时间为14～20h，例如14.5h、15h、15.5h、16h、16.5h、17h、17.5h、18h、18.5h、19h或19.5h，优选16h。
在本发明中，通过加入饱和碳酸氢钠水溶液和碳酸氢钠粉末调节pH至7～8，例如7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8或7.9。
所述分离过程为：加入二氯甲烷，分液，水层用二氯甲烷萃取，至水层无色，将有机相合并，得到有机相。
优选地，水层用二氯甲烷萃取3次。
优选地，采用无水硫酸钠干燥。
优选地，然后利用甲醇和二氯甲烷的混合溶剂重结晶。
优选地，甲醇和二氯甲烷的体积比为5:1。
所述反应时间可以通过HPLC检测原料完全消失的时间来确定。
优选地，步骤(3)中每16g脱镁叶绿酸-a甲酯溶于240～480mL(例如260mL、280mL、300mL、320mL、340mL、360mL、380mL、400mL、420mL、440mL或460ml)2,4,6-三甲基吡啶。
优选地，步骤(3)中采用中性氧化铝减压柱和二氯甲烷洗脱剂进行层析。
优选地，步骤(3)中减压蒸发去除溶剂。
优选地，步骤(3)中将去除溶剂后的产物加入甲醇搅拌均匀，抽滤，得到蓝黑色固体粉末。
优选地，在步骤(4)中，HBr/HOAc溶液的浓度为33％。
优选地，在步骤(4)中，HBr/HOAc溶液的体积ml和焦脱镁叶绿酸-а甲酯的重量g比为20～30，例如21、22、23、24、25、26、27、28或29。
优选地，在步骤(4)中，正己醇的体积ml和焦脱镁叶绿酸-а甲酯的重量g比为20～30，例如21、22、23、24、25、26、27、28或29。
在上述反应中，采用HPLC监控反应进程，直至原料消失，视为反应结束。
优选地，步骤(4)还包括如下分离过程：向室温下的反应产物中加入880mL～1.5L二氯甲烷稀释反应液，依次用水和10％碳酸氢钠水溶液洗涤反应液至中性，将有机层加入无水硫酸钠干燥，过滤除去干燥剂，采用水泵减压浓缩去除二氯甲烷后，以油泵减压浓缩去除正己醇，将残余物溶于二氯甲烷，中性氧化铝拌样，过200-300目的硅胶柱，以乙酸乙酯和石油醚梯度洗脱，得到纯度为99％及以上的2-(1-正己氧基乙基)-2-去乙烯基焦脱镁叶绿酸-а-正己酯。
优选地，以乙酸乙酯和石油醚体积比1/7→1/4梯度洗脱。
优选地，步骤(5)采用TLC监控反应进程，其中，展开剂为体积比为13～1的二氯甲烷和甲醇的混合溶剂。
优选地，步骤(5)THF的体积ml和2-(1-正己氧基乙基)-2-去乙烯基焦脱镁叶绿酸-a正己酯g的重量比为100～120，例如102、104、106、108、110、112、114、116或118。
优选地，氢氧化钠/甲醇/水混合溶液的体积ml和2-(1-正己氧基乙基)-2-去乙烯基焦脱镁叶绿酸-a正己酯的重量g比为306.25。
优选地，步骤(5)反应结束后，还包括如下分离过程：
待反应结束后，加入0～5℃的水，并用2％的HOAc水溶液调节pH为6.0，然后加入THF，用二氯甲烷萃取反应液至水相无色，有机相加入无水硫酸钠干燥，约2小时后过滤去除干燥剂，减压蒸干，将残物溶于二氯甲烷，硅胶柱层析，以二氯甲烷→1.5％甲醇/二氯甲烷梯度洗脱，再以甲醇重结晶，得到2-[1-(氧-正己基)]-2-去乙烯基焦脱镁叶绿酸-a。
优选地，冷水的体积ml和2-(1-正己氧基乙基)-2-去乙烯基焦脱镁叶绿酸-a正己酯的重量g比为100～120，例如102、104、106、108、110、112、114、116或118。
优选地，所述HOAc水溶液的浓度为1.8～2.5％，例如1.9％、2％、2.1％、2.2％、2.3％或2.4％，优选2％。
优选地，梯度洗脱得到的产品的重量g和甲醇的体积ml比为1:25。
上述方法的反应式如下所示：
与已有技术相比，本发明具有如下有益效果：
红豆杉枝叶目前作为紫杉醇和10-去乙酰基巴卡丁III的主要原料，在紫杉醇与10-DAB提取完后，红豆杉枝叶还富含叶绿素，是HPPH的主要合成起始原料。本发明通过对红豆杉枝叶的再提取综合利用获得叶绿素作为HPPH的合成原料，实现了红豆杉枝叶的合理利用。
采用本发明所述方法得到的HPPH的纯度高，可达到99％及以上，收率可达到70％及以上。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。
实施例1
(1)叶绿素-a的提取
取红豆杉枝叶提取10-去乙酰基巴卡丁III后的产物16公斤粉末，将其加入丙酮中，控制提取10-去乙酰基巴卡丁III后的产物的重量与丙酮的体积比为1:1～1:5，加热回流8～14h，然后经过氧化铝层析，由二氯甲烷洗脱获得墨绿色膏状物叶绿素-a170g；
(2)脱镁叶绿酸-a甲酯(Methyl Pheophorbide-a)的制备
取叶绿素-a 160克加入2.0升5％硫酸甲醇溶液溶解，室温搅拌16小时，加饱和碳酸氢钠水溶液及碳酸氢钠粉末，调pH＝7～8，然后蒸发去除甲醇，加入二氯甲烷，分液，水层用适量二氯甲烷萃取3次，至水层无色，合并有机相，将其采用无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩得墨绿色油状物52克，然后利用体积比为5:1的甲醇/二氯甲烷混合溶剂重结晶，得18.4克墨绿色固体，重量收率为11.5％。
(3)焦脱镁叶绿酸-a甲酯(Methyl Pyropheophorbide-a)的合成
取16g脱镁叶绿酸-a甲酯溶于240mL2,4,6-三甲基吡啶，氮气保护，加热回流2小时后HPLC检测原料消失，视为反应结束，减压浓缩掉反应试剂，采用中性氧化铝减压柱和1L二氯甲烷洗脱剂进行层析，收集洗脱液，减压蒸掉大部分溶剂。向残余物中加入40mL甲醇搅拌均匀，抽滤，得蓝黑色固体粉末11.8克，收率为81.55％。对该蓝黑色固体粉末进行核磁共振测试，具体结果为：1H-NMR(CDCl3500MHz)δppm 9.50(s,1H),9.38(s,1H),8.55(s,1H),8.04～7.98(m,1H),6.30(d,1H),6.15(d,1H),5.30～5.09(q,2H),4.50(m,1H)，4.30(m,1H)，3.71(q,2H)，3.67(s,3H)，3.61(s,3H)，3.41(s,3H)，3.24(s,3H)，2.73～2.69(m,1H)，2.60～2.54(m,1H)，2.34～2.26(m,1H)，1.82(d,3H)，1.70(t,3H)，3.41(s,3H)，-1.68(s,2H)。
(4)2-(1-氧-正己基乙基)-2-去乙烯基焦脱镁叶绿酸-a正己酯(HPPHHexyl easter)的合成
在配有机械搅拌、干燥管的三口瓶中加入220mL 33％的HBr/HOAc，搅拌条件下下将11g焦脱镁叶绿酸-а甲酯分批缓缓加入，室温下进行反应，HPLC监控反应进程直至原料消失，然后水浴加热减压蒸除冰醋酸。将得到的残余物冷至室温后加入220mL正己醇搅拌溶解，N2保护下，置于冰箱中冷藏过夜，HPLC检测原料消失后，再将产物置于室温下反应，用HPLC监控反应进程，至反应生成的2-(1-正己氧基乙基)-2-去乙烯基焦脱镁叶绿酸-а-甲酯全部转化为2-(1-正己氧基乙基)-2-去乙烯基焦脱镁叶绿酸-а己酯。然后加入880mL二氯甲烷稀释反应液，依次用水和10％碳酸氢钠水溶液洗涤反应液至中性，有机层加入无水硫酸钠干燥。过滤除去干燥剂，水泵减压浓缩净二氯甲烷后，以油泵减压浓缩掉正己醇。将残余物溶于二氯甲烷，中性氧化铝拌样，过硅胶(200-300目)柱，以乙酸乙酯/石油醚体积比1/7→1/4梯度洗脱得99％纯度的2-(1-正己氧基乙基)-2-去乙烯基焦脱镁叶绿酸-а-正己酯8.3克，收率为57.43％。
(5)2-[1-(氧-正己基)]-2-去乙烯基焦脱镁叶绿酸-a(HPPH)
在N2保护下，将8克2-(1-正己氧基乙基)-2-去乙烯基焦脱镁叶绿酸-a正己酯加入960mL THF中，搅拌溶解，加入事先配好的1.3％氢氧化钠/甲醇/水(2450mL)混合溶液，保持室温进行反应，TLC监控反应进程(展开剂为体积比为13:1的二氯甲烷-甲醇混合溶剂)，反应完毕后，加入960mL的0～5℃的水，用2％的HOAc水溶液调节pH＝6.0，然后加入260mL THF，用二氯甲烷萃取反应液至水相无色。有机相加入无水硫酸钠干燥，约2小时后过滤去除干燥剂，减压蒸干。将残物溶于二氯甲烷，硅胶柱层析，以二氯甲烷→1.5％甲醇/二氯甲烷梯度洗脱得纯度97％左右的产品，再以甲醇重结晶(其中，g/mL＝1/25)，得到纯度≥99％的产品4.92克。收率69.6％。1H-NMR(CDCl3500MHz)δppm 9.76(s,1H),9.52(s,1H),8.54(s,1H),5.90(q,1H),5.21(q,2H),4.50(q,1H),4.34(d,2H),3.73～3.58(m,7H)，3.37(s,3H)，3.27(s,3H)，2.72～2.58(m,2H)，2.32～2.30(m,2H)，2.11(d,3H)，1.82(d,3H)，1.72～1.68(m,5H)，1.41～1.34(m,2H)，1.21(s,4H)，0.77(s,3H)。
实施例2
(1)叶绿素-a的提取
取红豆杉枝叶提取10-去乙酰基巴卡丁III后的产物16公斤粉末，将其加入丙酮中，控制提取10-去乙酰基巴卡丁III后的产物的重量与丙酮的体积比为1:1～1:5，加热回流8～14h，然后经过氧化铝层析，由二氯甲烷洗脱获得墨绿色膏状物叶绿素-a170g；
(2)脱镁叶绿酸-a甲酯(Methyl Pheophorbide-a)的制备
取叶绿素-a 160克加入2.0升5％硫酸甲醇溶液溶解，室温搅拌16小时，加饱和碳酸氢钠水溶液及碳酸氢钠粉末，调pH＝7～8，然后蒸发去除甲醇，加入二氯甲烷，分液，水层用适量二氯甲烷萃取3次，至水层无色，合并有机相，将其采用无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩得墨绿色油状物52克，然后利用体积比为5:1的甲醇/二氯甲烷混合溶剂重结晶，得18.4克墨绿色固体，重量收率为11.5％。
(3)焦脱镁叶绿酸-a甲酯(Methyl Pyropheophorbide-a)的合成
取16g脱镁叶绿酸-a甲酯溶于240mL2,4,6-三甲基吡啶，氮气保护，加热回流2小时后HPLC检测原料消失，视为反应结束，减压浓缩掉反应试剂，采用中性氧化铝减压柱和1L二氯甲烷洗脱剂进行层析，收集洗脱液，减压蒸掉大部分溶剂。向残余物中加入50mL甲醇搅拌均匀，抽滤，得蓝黑色固体粉末11.8克，收率为81.55％。
(4)2-(1-氧-正己基乙基)-2-去乙烯基焦脱镁叶绿酸-a正己酯(HPPHHexyl easter)的合成
在配有机械搅拌、干燥管的三口瓶中加入330mL 33％的HBr/HOAc，搅拌条件下下将11g焦脱镁叶绿酸-а甲酯分批缓缓加入，室温下进行反应，HPLC监控反应进程直至原料消失，然后水浴加热减压蒸除冰醋酸。将得到的残余物冷至室温后加入330mL正己醇搅拌溶解，N2保护下，置于冰箱中冷藏过夜，HPLC检测原料消失后，再将产物置于室温下反应，用HPLC监控反应进程，至反应生成的2-(1-正己氧基乙基)-2-去乙烯基焦脱镁叶绿酸-а-甲酯全部转化为2-(1-正己氧基乙基)-2-去乙烯基焦脱镁叶绿酸-а己酯。然后加入880mL二氯甲烷稀释反应液，依次用水和10％碳酸氢钠水溶液洗涤反应液至中性，有机层加入无水硫酸钠干燥。过滤除去干燥剂，水泵减压浓缩净二氯甲烷后，以油泵减压浓缩掉正己醇。将残余物溶于二氯甲烷，中性氧化铝拌样，过硅胶(200-300目)柱，以乙酸乙酯/石油醚体积比1/7→1/4梯度洗脱得99％纯度的2-(1-正己氧基乙基)-2-去乙烯基焦脱镁叶绿酸-а-正己酯8.5克，收率为60.25％。
(5)2-[1-(氧-正己基)]-2-去乙烯基焦脱镁叶绿酸-a(HPPH)
在N2保护下，将8克2-(1-正己氧基乙基)-2-去乙烯基焦脱镁叶绿酸-a正己酯加入960mL THF中，搅拌溶解，加入事先配好的1.3％氢氧化钠/甲醇/水(2450mL)混合溶液，保持室温进行反应，TLC监控反应进程(展开剂为体积比为13:1的二氯甲烷-甲醇混合溶剂)，反应完毕后，加入960mL 0～5℃的水，用2％的HOAc水溶液调节pH＝6.0，然后加入260mL THF，用二氯甲烷萃取反应液至水相无色。有机相加入无水硫酸钠干燥，约2小时后过滤去除干燥剂，减压蒸干。将残物溶于二氯甲烷，硅胶柱层析，以二氯甲烷→1.5％甲醇/二氯甲烷梯度洗脱得纯度97％左右的产品，再以甲醇重结晶(其中，g/mL＝1/25)，得到纯度≥99％的产品5.02克。收率71.2％。
实施例3
(1)叶绿素-a的提取
取红豆杉枝叶提取10-去乙酰基巴卡丁III后的产物16公斤粉末，将其加入丙酮中，控制提取10-去乙酰基巴卡丁III后的产物的重量与丙酮的体积比为1:1～1:5，加热回流8～14h，然后经过氧化铝层析，由二氯甲烷洗脱获得墨绿色膏状物叶绿素-a170g；
(2)脱镁叶绿酸-a甲酯(Methyl Pheophorbide-a)的制备
取叶绿素-a 160克加入2.0升5％硫酸甲醇溶液溶解，室温搅拌16小时，加饱和碳酸氢钠水溶液及碳酸氢钠粉末，调pH＝7～8，然后蒸发去除甲醇，加入二氯甲烷，分液，水层用适量二氯甲烷萃取3次，至水层无色，合并有机相，将其采用无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩得墨绿色油状物52克，然后利用体积比为5:1的甲醇/二氯甲烷混合溶剂重结晶，得18.4克墨绿色固体，重量收率为11.5％。
(3)焦脱镁叶绿酸-a甲酯(Methyl Pyropheophorbide-a)的合成
取16g脱镁叶绿酸-a甲酯溶于240mL2,4,6-三甲基吡啶，氮气保护，加热回流2小时后HPLC检测原料消失，视为反应结束，减压浓缩掉反应试剂，采用中性氧化铝减压柱和1L二氯甲烷洗脱剂进行层析，收集洗脱液，减压蒸掉大部分溶剂。向残余物中加入50mL甲醇搅拌均匀，抽滤，得蓝黑色固体粉末11.8克，收率为81.55％。
(4)2-(1-氧-正己基乙基)-2-去乙烯基焦脱镁叶绿酸-a正己酯(HPPHHexyl easter)的合成
在配有机械搅拌、干燥管的三口瓶中加入280mL 33％的HBr/HOAc，搅拌条件下下将11g焦脱镁叶绿酸-а甲酯分批缓缓加入，室温下进行反应，HPLC监控反应进程直至原料消失，然后水浴加热减压蒸除冰醋酸。将得到的残余物冷至室温后加入280mL正己醇搅拌溶解，N2保护下，置于冰箱中冷藏过夜，HPLC检测原料消失后，再将产物置于室温下反应，用HPLC监控反应进程，至反应生成的2-(1-正己氧基乙基)-2-去乙烯基焦脱镁叶绿酸-а-甲酯全部转化为2-(1-正己氧基乙基)-2-去乙烯基焦脱镁叶绿酸-а己酯。然后加入880mL二氯甲烷稀释反应液，依次用水和10％碳酸氢钠水溶液洗涤反应液至中性，有机层加入无水硫酸钠干燥。过滤除去干燥剂，水泵减压浓缩净二氯甲烷后，以油泵减压浓缩掉正己醇。将残余物溶于二氯甲烷，中性氧化铝拌样，过硅胶(200-300目)柱，以乙酸乙酯/石油醚体积比1/7→1/4梯度洗脱得99％纯度的2-(1-正己氧基乙基)-2-去乙烯基焦脱镁叶绿酸-а-正己酯8.5克，收率为60.25％。
(5)2-[1-(氧-正己基)]-2-去乙烯基焦脱镁叶绿酸-a(HPPH)
在N2保护下，将8克2-(1-正己氧基乙基)-2-去乙烯基焦脱镁叶绿酸-a正己酯加入960mL THF中，搅拌溶解，加入事先配好的1.3％氢氧化钠/甲醇/水(2450mL)混合溶液，保持室温进行反应，TLC监控反应进程(展开剂为体积比为13:1的二氯甲烷-甲醇混合溶剂)，反应完毕后，加入960mL 0～5℃的水，用2％的HOAc水溶液调节pH＝6.0，然后加入260mL THF，用二氯甲烷萃取反应液至水相无色。有机相加入无水硫酸钠干燥，约2小时后过滤去除干燥剂，减压蒸干。将残物溶于二氯甲烷，硅胶柱层析，以二氯甲烷→1.5％甲醇/二氯甲烷梯度洗脱得纯度97％左右的产品，再以甲醇重结晶(其中，g/mL＝1/25)，得到纯度≥99％的产品5.02克。收率71.2％。
实施例4
(1)叶绿素-a的提取
取红豆杉枝叶提取10-去乙酰基巴卡丁III后的产物16公斤粉末，将其加入丙酮中，控制提取10-去乙酰基巴卡丁III后的产物的重量与丙酮的体积比为1:5～1:10，加热回流8～14h，然后经过氧化铝层析，由二氯甲烷洗脱获得墨绿色膏状物叶绿素-a170g；
(2)脱镁叶绿酸-a甲酯(Methyl Pheophorbide-a)的制备
取叶绿素-a 160克加入4升5％硫酸甲醇溶液溶解，室温搅拌20小时，加饱和碳酸氢钠水溶液及碳酸氢钠粉末，调pH＝7～8，然后蒸发去除甲醇，加入二氯甲烷，分液，水层用适量二氯甲烷萃取3次，至水层无色，合并有机相，将其采用无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩得墨绿色油状物52克，然后利用体积比为5:1的甲醇/二氯甲烷混合溶剂重结晶，得19.4克墨绿色固体，重量收率为11.5％。
(3)焦脱镁叶绿酸-a甲酯(Methyl Pyropheophorbide-a)的合成
取16g脱镁叶绿酸-a甲酯溶于480mL2,4,6-三甲基吡啶，氮气保护，加热回流2小时后HPLC检测原料消失，视为反应结束，减压浓缩掉反应试剂，采用中性氧化铝减压柱和1L二氯甲烷洗脱剂进行层析，收集洗脱液，减压蒸掉大部分溶剂。向残余物中加入50mL甲醇搅拌均匀，抽滤，得蓝黑色固体粉末11.8克，收率为81.55％。
(4)2-(1-氧-正己基乙基)-2-去乙烯基焦脱镁叶绿酸-a正己酯(HPPHHexyl easter)的合成
在配有机械搅拌、干燥管的三口瓶中加入280mL 33％的HBr/HOAc，搅拌条件下下将11g焦脱镁叶绿酸-а甲酯分批缓缓加入，室温下进行反应，HPLC监控反应进程直至原料消失，然后水浴加热减压蒸除冰醋酸。将得到的残余物冷至室温后加入280mL正己醇搅拌溶解，N2保护下，置于冰箱中冷藏过夜，HPLC检测原料消失后，再将产物置于室温下反应，用HPLC监控反应进程，至反应生成的2-(1-正己氧基乙基)-2-去乙烯基焦脱镁叶绿酸-а-甲酯全部转化为2-(1-正己氧基乙基)-2-去乙烯基焦脱镁叶绿酸-а己酯。然后加入1.5L二氯甲烷稀释反应液，依次用水和10％碳酸氢钠水溶液洗涤反应液至中性，有机层加入无水硫酸钠干燥。过滤除去干燥剂，水泵减压浓缩净二氯甲烷后，以油泵减压浓缩掉正己醇。将残余物溶于二氯甲烷，中性氧化铝拌样，过硅胶(200-300目)柱，以乙酸乙酯/石油醚体积比1/7→1/4梯度洗脱得99％纯度的2-(1-正己氧基乙基)-2-去乙烯基焦脱镁叶绿酸-а-正己酯8.5克，收率为60.25％。
(5)2-[1-(氧-正己基)]-2-去乙烯基焦脱镁叶绿酸-a(HPPH)
在N2保护下，将8克2-(1-正己氧基乙基)-2-去乙烯基焦脱镁叶绿酸-a正己酯加入800mL THF中，搅拌溶解，加入事先配好的1.3％氢氧化钠/甲醇/水(2450mL)混合溶液，保持室温进行反应，TLC监控反应进程(展开剂为体积比为13:1的二氯甲烷-甲醇混合溶剂)，反应完毕后，加入800mL 0～5℃的水，用2.5％的HOAc水溶液调节pH＝6.0，然后加入260mL THF，用二氯甲烷萃取反应液至水相无色。有机相加入无水硫酸钠干燥，约2小时后过滤去除干燥剂，减压蒸干。将残物溶于二氯甲烷，硅胶柱层析，以二氯甲烷→1.5％甲醇/二氯甲烷梯度洗脱得纯度97％左右的产品，再以甲醇重结晶(其中，g/mL＝1/25)，得到纯度≥99％的产品5.02克。收率71.2％。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
Claims (10)
1.一种由红豆杉枝叶提取物制备光敏剂HPPH的方法，所述方法包括如下步骤：
(1)叶绿素-a的提取：
从红豆杉枝叶中提取叶绿素-a；
(2)脱镁叶绿酸-a甲酯的制备：
取叶绿素-a加入硫酸甲醇溶液中溶解，室温搅拌，然后加饱和碳酸氢钠水溶液及碳酸氢钠粉末，并调节pH至7～8，然后蒸发去除甲醇，分离得到有机相，干燥，过滤，浓缩得到墨绿色油状物，重结晶，得到墨绿色固体，即脱镁叶绿酸-a甲酯；
(3)焦脱镁叶绿酸-a甲酯的合成
将脱镁叶绿酸-a甲酯溶于2,4,6-三甲基吡啶，在惰性气体保护下加热回流，待反应结束后，去除溶剂，层析，将得到的洗脱液去除溶剂，抽滤，得到蓝黑色固体粉末，即焦脱镁叶绿酸-a甲酯；
(4)2-(1-氧-正己基乙基)-2-去乙烯基焦脱镁叶绿酸-a正己酯的合成
向反应容器中加入HBr/HOAc溶液，然后在搅拌的条件下将焦脱镁叶绿酸-a甲酯缓慢加入，室温下进行水解反应，待反应结束后，将去除冰醋酸后的产物冷却至室温，然后向其中加入正己醇搅拌溶解，在惰性气体保护下，置于冰箱中冷藏过夜进行反应，待反应结束后，再将产物放置于室温下进行反应，至2-(1-正己氧基乙基)-2-去乙烯基焦脱镁叶绿酸-а-甲酯全部转化为2-(1-正己氧基乙基)-2-去乙烯基焦脱镁叶绿酸-а正己酯；
(5)2-[1-(氧-正己基)]-2-去乙烯基焦脱镁叶绿酸-a的合成
在惰性气体保护下，将2-(1-正己氧基乙基)-2-去乙烯基焦脱镁叶绿酸-a正己酯加入THF中，搅拌溶解，然后加入1.3％氢氧化钠/甲醇/水混合溶液，在室 温下进行反应，待反应结束后，得到2-[1-(氧-正己基)]-2-去乙烯基焦脱镁叶绿酸-a。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)叶绿素-a的提取方法为：
将红豆杉枝叶提取10-去乙酰基巴卡丁III后的产物加入丙酮中，控制提取10-去乙酰基巴卡丁III后的产物的重量g与丙酮的体积ml比为1:1～1:10，加热回流8～14h，然后经过氧化铝层析，由二氯甲烷洗脱获得叶绿素-a。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(2)中每160g叶绿素-a加入2～4升的硫酸甲醇溶液；
优选地，步骤(2)室温搅拌的时间为14～20h，优选16h；
优选地，步骤(2)分离过程为：加入二氯甲烷，分液，水层用二氯甲烷萃取，至水层无色，将有机相合并，得到有机相；
优选地，水层用二氯甲烷萃取3次。
4.如权利要求1-3之一所述的方法，其特征在于，步骤(2)采用无水硫酸钠干燥；
优选地，步骤(2)利用甲醇和二氯甲烷的混合溶剂重结晶。
优选地，甲醇和二氯甲烷的体积比为5:1。
5.如权利要求1-4之一所述的方法，其特征在于，步骤(3)中每16g脱镁叶绿酸-a甲酯溶于240～480mL 2,4,6-三甲基吡啶；
优选地，步骤(3)中减压蒸发去除溶剂；
优选地，步骤(3)中采用中性氧化铝减压柱和二氯甲烷洗脱剂进行层析；
优选地，步骤(3)中将去除溶剂后的产物加入甲醇搅拌均匀，抽滤，得到蓝黑色固体粉末。
6.如权利要求1-5之一所述的方法，其特征在于，步骤(4)中HBr/HOAc溶液的浓度为33％；
优选地，步骤(4)中HBr/HOAc溶液的体积ml和焦脱镁叶绿酸-а甲酯的重量g比为20～30；
优选地，步骤(4)中正己醇的体积ml和焦脱镁叶绿酸-а甲酯的重量g比为20～30；
优选地，采用HPLC监控反应进程，直至原料消失，视为反应结束。
7.如权利要求1-6之一所述的方法，其特征在于，步骤(4)还包括如下分离过程：向室温下的反应产物中加入880mL～1.5L二氯甲烷稀释反应液，依次用水和10％碳酸氢钠水溶液洗涤反应液至中性，将有机层加入无水硫酸钠干燥，过滤除去干燥剂，采用水泵减压浓缩去除二氯甲烷后，以油泵减压浓缩去除正己醇，将残余物溶于二氯甲烷，中性氧化铝拌样，过200-300目的硅胶柱，以乙酸乙酯和石油醚梯度洗脱，得到2-(1-正己氧基乙基)-2-去乙烯基焦脱镁叶绿酸-а-正己酯；
优选地，以乙酸乙酯和石油醚体积比1/7→1/4梯度洗脱。
8.如权利要求1-7之一所述的方法，其特征在于，步骤(5)采用TLC监控反应进程，其中，展开剂为体积比为13:1的二氯甲烷和甲醇的混合溶剂；
优选地，步骤(5)中THF的体积ml和2-(1-正己氧基乙基)-2-去乙烯基焦脱镁叶绿酸-a正己酯的重量g比为100～120；
优选地，氢氧化钠/甲醇/水混合溶液的体积ml和2-(1-正己氧基乙基)-2-去乙烯基焦脱镁叶绿酸-a正己酯的重量g比为306.25。
9.如权利要求1-8之一所述的方法，其特征在于，步骤(5)反应结束后，还包括如下分离过程：
待反应结束后，加入0-5℃的水，并用2％的HOAc水溶液调节pH为6.0，然后加入THF，用二氯甲烷萃取反应液至水相无色，有机相加入无水硫酸钠干燥，约2小时后过滤去除干燥剂，减压蒸干，将残物溶于二氯甲烷，硅胶柱层析，以二氯甲烷→1.5％甲醇/二氯甲烷梯度洗脱，再以甲醇重结晶，得到2-[1-(氧-正己基)]-2-去乙烯基焦脱镁叶绿酸-a。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，冷水的体积ml和2-(1-正己氧基乙基)-2-去乙烯基焦脱镁叶绿酸-a正己酯g的重量比为100～120；
优选地，所述HOAc水溶液的浓度为1.8～2.5％，优选2％；
优选地，梯度洗脱得到的产品的重量g和甲醇的体积ml比为1:25。
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