CN110755380A - 一种甲状旁腺激素1-34鼻喷剂、其制备方法及用途 - Google Patents
一种甲状旁腺激素1-34鼻喷剂、其制备方法及用途 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种甲状旁腺激素1‑34药物组合物及其制备方法，具体而言，本发明涉及一种甲状旁腺激素1‑34药物组合物，其含有甲状旁腺激素1‑34作为活性成分以及药学上可接受的载体，所述载体至少包含缓冲液、促透剂、稳定剂和防腐剂。所述甲状旁腺激素1‑34药物组合物为甲状旁腺激素1‑34鼻喷剂或鼻喷剂组合。通过本发明方法制备的甲状旁腺激素1‑34鼻喷剂或鼻喷剂组合具有避免首过效应，生物利用度高；起效快；给药方便，患者顺应性强，使用过程中通过鼻粘膜吸收等优点，可以有利的减少多肽类药物注射给药的痛苦等。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域，涉及一种甲状旁腺激素1-34鼻喷剂、其制备方法及用途。
背景技术
人甲状旁腺激素1-34(下文称为PTH(1-34))是甲状旁腺主细胞分泌的含84个氨基酸残基的单链多肽激素中的氨基端1-34片段，其氨基端1-34片段保留了全部的成骨活性。内源性的84个氨基酸的PTH是肾脏和骨骼中钙、磷代谢的主要调节剂。PTH的生理作用包括骨代谢的调控、肾小管对钙、磷的重吸收以及肠钙的吸收。PTH和PTH(1-34)对骨骼的影响取决于全身的药物剂量。每天一次给药PTH(1-34)，对于成骨细胞的刺激活性高于破骨细胞，可以刺激骨小梁和皮层骨表面新骨的形成。在人体中，PTH(1-34)对合成代谢的影响表现为：增加骨量，增加骨形成和重吸收的标记物，增大骨强度。
目前临床所用PTH(1-34)为注射剂，需每天皮下注射20μg。由于PTH(1-34)的治疗周期一般为最短6个月，最长不超过2年，在相对较长的治疗周期内每天请专业医护人员注射给药，这种给药方式和频率对患者有较大的精神负担，也会带来注射部位的疼痛。
PTH(1-34)分子式C181H291N55O51S2·5CH3COOH，相对分子量为4117.8，白色块状物或粉末，无臭，略有酸味，极易溶于水或稀醋酸。水溶性好且相对分子量较大，不利于透过鼻黏膜吸收。要使PTH(1-34)鼻喷剂具备成药性，实现较高的生物利用度和较低的刺激性是鼻喷剂开发的一个难点。
目前，尚需要研发一种给药简便易行、无痛、患者可以自助用药、长治疗周期下不影响用药顺应性，每日使用不会给患者带来过多疼痛与心理负担的PTH(1-34)鼻腔给药制剂。
发明内容
本发明经过深入的研究和创造性的劳动，制得了一种人甲状旁腺激素1-34鼻喷剂，其使用方便、生物利用度高、患者顺应性强，是PTH(1-34)的非常具有应用前景的新型制剂。由此提供了下述发明：
本发明的一个方面涉及一种甲状旁腺激素1-34鼻喷剂，其包括有效量的人PTH(1-34)或其生物类似物，以及如下辅料：
至少一种非离子型表面活性剂、透明质酸酶和缓冲盐溶液。
在本发明的一个或多个实施方案中，所述的鼻喷剂，其余量为水。
在本发明的一个或多个实施方案中，所述的鼻喷剂，其中，人PTH(1-34)或其生物类似物的浓度为2-20mg/mL，优选为2.5-15mg/mL，更优选为5-15mg/mL、5-12mg/mL或8-12mg/mL，例如5mg/mL、6mg/mL、7mg/mL、8mg/mL、9mg/mL、10mg/mL、11mg/mL、12mg/mL；特别优选为8mg/mL或10mg/mL。
在本发明的一个或多个实施方案中，所述的鼻喷剂，其中，所述非离子型表面活性剂为
HS·15；
优选地，HS·15的浓度为5％-20％(50-200mg/mL)，优选为5％-17％，更优选为8％-12％，特别优选为10％。
在本发明的一个或多个实施方案中，所述的鼻喷剂，其中，每mL鼻喷剂中的透明质酸酶的量为500-3000U，优选为500-1500U，更优选为800-1200U，特别优选为1000U。
在本发明的一个或多个实施方案中，所述的鼻喷剂，其中所述缓冲盐溶液为选自磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、醋酸钠和冰醋酸中的一种或多种的缓冲盐溶液，优选磷酸二氢钠和磷酸氢二钠的缓冲盐溶液；更优选pH值为7.2-7.5例如7.4的磷酸盐缓冲液，特别优选0.1M的磷酸盐缓冲液。
在本发明的一个或多个实施方案中，所述的鼻喷剂，其中，所述缓冲盐溶液为磷酸盐缓冲液，优选为0.1M的磷酸盐缓冲液。
在本发明的一个或多个实施方案中，所述的鼻喷剂，其包含如下组分：
人PTH(1-34)或其生物类似物5-12mg/mL或8-12mg/mL，
透明质酸酶800-1200U/mL，以及
适量的磷酸盐缓冲液例如0.1M的磷酸盐缓冲液；
优选地，所述鼻喷剂包含如下组分：
人PTH(1-34)或其生物类似物8mg/mL或10mg/mL，
透明质酸酶1000U/mL，以及
适量的磷酸盐缓冲液例如0.1M的磷酸盐缓冲液。
在本发明的一个或多个实施方案中，所述的鼻喷剂，其还包含适量的防腐剂；优选地，所述防腐剂选自间甲酚、氮气、苯扎氯铵、三氯叔丁醇、山梨醇、苯甲酸和苯甲酸钠中的一种或多种，优选苯扎氯铵。
在本发明的一个或多个实施方案中，所述的鼻喷剂，其还包含适量的稳定剂；优选地，所述稳定剂选自选自D-甘露醇、蔗糖、海藻糖、肌酐、甘氨酸、辛酸钠中的一种或多种，更优选D-甘露醇和/或蔗糖。
本发明的另一方面涉及一种药物产品，其包含本发明中任一项所述的鼻喷剂以及盛有所述鼻喷剂的包装容器；
优选地，所述包装容器内还充有氮气；
优选地，所述药物产品的单位剂量为1mL；
可选地，所述药物产品还包含药品说明书。
本发明的再一方面涉及一种制备本发明中任一项所述的鼻喷剂的方法，包括下述步骤：
1)将除了人PTH(1-34)或其生物类似物的其余组分溶于缓冲盐溶液中配制成稀释液；
2)人PTH(1-34)或其生物类似物加入到稀释液中，定容并充分混匀；
可选地，还包括下述步骤：
3)包装并充入氮气。
本发明还涉及本发明中任一项所述的鼻喷剂在制备治疗和/或预防骨质疏松症特别是绝经后骨质疏松症的药物中的用途。
本发明的PTH(1-34)药物组合物以单剂量给药形式施用，每日给药剂量在100～1500μg范围内。
本发明中，术语“增渗”和“促透”具有基本相同的含义。通常情况下，本领域技术人员习惯将“增渗”用于体外实验描述的中，将“促透”用于体内实验的描述中。
本发明中，如果没有特别说明，所述磷酸盐缓冲液为包含磷酸二氢钠和磷酸氢二钠的缓冲液。所述0.1M的磷酸盐缓冲液是指磷酸盐缓冲液的终浓度为0.1M。
发明的有益效果
本发明取得了如下的技术效果中的一项或多项：
(1)充分利用了HS·15和透明质酸酶促透的协同作用，本发明的PTH(1-34)药物组合物，特别是PTH(1-34)鼻喷剂能够及时有效地防治骨质疏松症。
(2)本发明提高了使用者的顺应性，使用者能够方便使用，并且体积小，易携带，使用者能够随时随地使用。
(3)本发明的制备方法，能够简单有效地制备PTH(1-34)药物组合物，其无需昂贵的设备和材料，既能够完成该产品的制备。
附图说明
图1：
HS·15对PTH(1-34)的促羊鼻黏膜透过累积量影响。
图2：透明质酸酶对PTH(1-34)的促羊鼻黏膜透过累积量影响。
图3：
HS·15、透明质酸酶单用以及联用对PTH(1-34)的促羊鼻黏膜透过累积量影响。
图4：不同缓冲盐对PTH(1-34)体外扩散的影响。
图5A－图5F：本发明PTH(1-34)药物组合物促透剂安全性评估试验中，各组给药后鼻粘膜5000倍扫描电镜照片。其中：
图5A为生理盐水阴性对照组；
图5B为10mg/mL PTH(1-34)；
图5C为10mg/mL PTH(1-34)+10％
HS·15；
图5D为10mg/mL PTH(1-34)+1000U透明质酸酶；
图5E为0.08mg/mL苯扎氯铵；
图5F为10mg/mL PTH(1-34)+10％
HS·15+1000U透明质酸酶。
图6：不同PTH(1-34)制剂经皮下及鼻腔给药后，大鼠体内血药浓度。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
PTH(1-34)(下面的实施例和附图中也简称为PTH)，深圳翰宇；批号：CY26181201Pe-2。
透明质酸酶，SIGMA；批号：SLBX1080。
制备例1：PTH(1-34)鼻喷剂样品1的制备
配制0.4M pH7.4磷酸盐缓冲液：磷酸二氢钠7.48mg、磷酸氢二钠73.12mg，溶于水配制成0.4M磷酸缓冲液。
称取PTH(1-34)80mg溶于水中配制成40mg/mL母液，精密量取0.25mLPTH(1-34)母液，加入适量0.4M磷酸盐缓冲液(终浓度为0.1M)，加入
HS·15 100mg、再加入苯扎氯铵0.08mg，最后利用水定容至1mL，充分混匀，装入瓶内并充入氮气。PTH(1-34)在制剂中的浓度为10mg/mL。
制备例2：PTH(1-34)鼻喷剂样品2的制备
配制0.4M pH7.4磷酸盐缓冲液：磷酸二氢钠7.48mg、磷酸氢二钠73.12mg，溶于水配制成0.4M磷酸缓冲液。
称取PTH(1-34)80mg溶于水中配制成40mg/mL母液，精密量取0.25mLPTH(1-34)母液，加入适量0.4M pH7.4磷酸盐缓冲液(终浓度为0.1M)，加入适量透明质酸酶1000U，再加入苯扎氯铵0.08mg，最后利用水定容至1mL，充分混匀，装入瓶内并充入氮气。PTH(1-34)在制剂中的浓度为10mg/mL。
制备例3：PTH(1-34)鼻喷剂样品3的制备
首先配制0.1M的pH7.4磷酸盐缓冲液：磷酸二氢钠1.87mg、磷酸氢二钠18.28mg。
其次配制0.4M pH7.4磷酸盐缓冲液：磷酸二氢钠7.48mg、磷酸氢二钠73.12mg，溶于水配制成0.4M磷酸缓冲液。
称取适量
HS·15，利用蒸馏水配制成400mg/mL浓溶液。
称取PTH(1-34)80mg溶于水中配制成40mg/mL母液，精密量取0.25mL PTH(1-34)母液，加入适量0.4M磷酸盐缓冲液(终浓度为0.1M)，加入0.25mL 400mg/mL
HS·15浓溶液、透明质酸酶1000U，再加入苯扎氯铵0.08mg，最后利用水定容至1mL，充分混匀，装入瓶内并充入氮气。PTH(1-34)在制剂中的浓度为10mg/mL。
制备例4：PTH(1-34)鼻喷剂样品4的制备
配制0.1M的pH7.4磷酸盐缓冲液：磷酸二氢钠1.87mg、磷酸氢二钠18.28mg。
称取适量
HS·15、适量透明质酸酶、适量苯扎氯铵，利用0.1M的pH7.4磷酸盐缓冲液配制为10％
HS·15+1000U透明质酸酶+0.08mg/mL苯扎氯铵的稀释液。
称取PTH(1-34)10mg，加入适量上述稀释液定容至1mL，充分混匀，装入瓶内并充入氮气。PTH(1-34)在制剂中的浓度为10mg/mL。
实验例1：不同促透剂的研究
1.实验分组
(1)对
HS·15的研究
10mg/mL PTH(1-34)，配制方法如下：
配制0.1M的pH7.4磷酸盐缓冲液：磷酸二氢钠1.87mg、磷酸氢二钠18.28mg，取适量PTH(1-34)利用0.1M的pH7.4磷酸盐缓冲液配制为10m/mL。
10mg/mL PTH(1-34)+5％ 
HS·15，配制方法如下：
配制0.1M的pH7.4磷酸盐缓冲液：磷酸二氢钠1.87mg、磷酸氢二钠18.28mg，取适量
HS·15利用0.1M的pH7.4磷酸盐缓冲液配制为稀释液，取适量PTH(1-34)利用上述稀释液配制。
10mg/mL PTH(1-34)+10％ 
HS·15，配制方法如下：
配制0.1M的pH7.4磷酸盐缓冲液：磷酸二氢钠1.87mg、磷酸氢二钠18.28mg，取适量
HS·15利用0.1M的pH7.4磷酸盐缓冲液配制为稀释液，取适量PTH(1-34)利用上述稀释液配制。
10mg/mL PTH(1-34)+17％ HS·15，配制方法如下：
配制0.1M的pH7.4磷酸盐缓冲液：磷酸二氢钠1.87mg、磷酸氢二钠18.28mg，取适量
HS·15利用0.1M的pH7.4磷酸盐缓冲液配制为稀释液，取适量PTH(1-34)利用上述稀释液配制。
(2)对透明质酸酶的研究
10mg/mL PTH(1-34)，配制方法如下：
配制0.1M的pH7.4磷酸盐缓冲液：磷酸二氢钠1.87mg、磷酸氢二钠18.28mg，取适量PTH(1-34)利用0.1M的pH7.4磷酸盐缓冲液配制为10m/mL。
10mg/mL PTH(1-34)+1000U透明质酸酶，配制方法如下：
配制0.1M的pH7.4磷酸盐缓冲液：磷酸二氢钠1.87mg、磷酸氢二钠18.28mg，取适量透明质酸酶利用0.1M的pH7.4磷酸盐缓冲液配制为稀释液，取适量PTH(1-34)利用上述稀释液配制。
10mg/mL PTH(1-34)+2000U透明质酸酶，配制方法如下：
配制0.1M的pH7.4磷酸盐缓冲液：磷酸二氢钠1.87mg、磷酸氢二钠18.28mg，取适量透明质酸酶利用0.1M的pH7.4磷酸盐缓冲液配制为稀释液，取适量PTH(1-34)利用上述稀释液配制。
10mg/mL PTH(1-34)+3000U透明质酸酶，配制方法如下：
配制0.1M的pH7.4磷酸盐缓冲液：磷酸二氢钠1.87mg、磷酸氢二钠18.28mg，取适量透明质酸酶利用0.1M的pH7.4磷酸盐缓冲液配制为稀释液，取适量PTH(1-34)利用上述稀释液配制。
(3)对
HS·15与透明质酸酶联用的研究
10mg/mL PTH(1-34)(空白对照)，配制方法如下：
配制0.1M的pH7.4磷酸盐缓冲液：磷酸二氢钠1.87mg、磷酸氢二钠18.28mg，取适量PTH(1-34)利用0.1M的pH7.4磷酸盐缓冲液配制为10m/mL。
10mg/mL PTH(1-34)+10％ 
HS·15，配制方法如下：
配制0.1M的pH7.4磷酸盐缓冲液：磷酸二氢钠1.87mg、磷酸氢二钠18.28mg，取适量
HS·15利用0.1M的pH7.4磷酸盐缓冲液配制为稀释液，取适量PTH(1-34)利用上述稀释液配制。
10mg/mL PTH(1-34)+1000U透明质酸酶，配制方法如下：
配制0.1M的pH7.4磷酸盐缓冲液：磷酸二氢钠1.87mg、磷酸氢二钠18.28mg，取适量透明质酸酶利用0.1M的pH7.4磷酸盐缓冲液配制为稀释液，取适量PTH(1-34)利用上述稀释液配制。
10mg/mL PTH(1-34)+10％ 
HS·15+1000U透明质酸酶+0.08mg/mL苯 扎氯铵：
配制方法参照前面的制备例4，将制得的样品装入安瓿内并充入氮气排除空气溶封。
2.实验方法
体外实验模型：
利用Franz扩散池；
离体新鲜羊鼻粘膜作为动物模型；
供给液：0.4mL药液；
接收池：14.3mL生理盐水；
取样量：0.2mL/取样点；
取样时间(min)：0、10、30、60、90、120、180、300、420。
3.实验结果
如图1至图3所示。实验结果表明：
(1)加入
HS·15作为吸收促进剂时，当浓度从50mg/mL增加至10％时增渗倍数跟着增加，但浓度由10％增加至170mg/mL时，增渗倍数反而降低。这个结果提示，促透剂
HS·15的浓度与增渗倍数之间不存在线性关系，当浓度增加至一定值后，对药物的渗透作用达到饱和。
(2)加入透明质酸酶作为吸收促进剂时，当浓度增加，增渗倍数反而降低，即透明质酸酶增加，PTH透过量不增反降。
(3)10％
HS·15+1000U透明质酸酶联用，与分别单用HS·15或1000U透明质酸酶相比，PTH(1-34)透过量有显著增加。
实验例2：不同缓冲液的研究
1.实验分组
(1)0.1M pH 7.4的磷酸盐缓冲液；
(2)0.1M pH4.3的醋酸盐缓冲液；
(3)10mg/mL PTH(1-34)，0.1M pH 7.4的磷酸盐缓冲液的溶液；
(4)10mg/mL PTH(1-34)，0.1M pH4.3的醋酸盐缓冲液的溶液。
2.实验方法
体外实验模型：
利用Franz扩散池；
离体新鲜羊鼻粘膜作为动物模型；
供给液：0.4mL药液；
接收池：14.3mL生理盐水；
取样量：0.2mL/取样点；
取样时间(min)：0、10、30、60、90、120、180、300、420。
3.实验结果
如图4所示。
结果显示：PTH(1-34)在两种溶剂的透膜量有差异，0.1M pH7.4的磷酸盐缓冲液对PTH(1-34)促透效果明显优于醋酸盐缓冲液(P<0.05)，这可能是因为PTH的理论等电点约为9.8，磷缓的pH值较高，PTH分子态数量更多，而分子态相较于离子态药物更易透膜，因此PTH(1-34)在pH7.4磷缓中的透膜量要高于在pH4.3醋缓中的透膜量。
考虑到鼻腔刺激性，pH7.4磷酸盐缓冲液值刺激性更小，更接近生理pH，因而选择0.1M pH7.4的磷酸盐缓冲液为本制剂的溶剂。
实验例3：不同制备工艺对的PTH(1-34)鼻喷剂稳定性影响
1.实验样品
制备例3－4制备的PTH(1-34)鼻喷剂样品3和样品4。
2.实验方法
制剂样品中PTH(1-34)的含量测定方法参照欧洲药典9.0第3732-3733页，高效液相色谱仪测定方法。
3.实验结果
制备例3将PTH(1-34)溶于磷酸盐缓冲液后，出现不透明絮状物，振摇及静置均不能恢复澄清；制备例4所得PTH(1-34)鼻喷剂样品4澄清透明，含量测定符合要求。
结果表明，鼻喷剂的制备过程中首先配制0.1M pH7.4磷酸缓冲液，其次取适量辅料加入0.1M pH7.4磷酸缓冲液配制成稀释液，最后取适量PTH(1-34)利用上述稀释液配制为10mg/mL。
实验例4：纤毛毒性实验(离体法)
很多药物和辅料有纤毛毒性，也可以简略地理解为刺激性。本实验选用公认的有严重纤毛毒性的去氧胆酸钠作为阳性对照，生理盐水为空白对照，评价了不同浓度的主药、磷酸盐缓冲液、不同促透剂的鼻纤毛毒性。
1.实验样品
阳性对照(1％去氧胆酸钠)。
空白对照(0.9％生理盐水)。
其它样品如表1中所示(配制方法如制备例4中制剂工艺进行配制)。
2.实验方法
采用蟾蜍上腭粘膜离体法测定纤毛持续运动时间(Lasting time of cilliarymovement，LTCM)。每个样品对应不同的蟾蜍上颚黏膜。
将蟾蜍固定，用手术剪剪下上腭粘膜，置于生理盐水中，洗净血块和杂物，迅速用眼科剪剪取约3×3mm2的上腭粘膜，粘膜纤毛面向上平铺于载玻片上，于粘膜表面加0.1ML药液，轻轻盖上盖玻片，40倍显微镜下观察纤毛运动情况，直至纤毛运动停止，记录给药到停止的时间。利用生理盐水小心洗净粘膜上的药液，继续观察粘膜纤毛是否恢复运动、记录纤毛恢复运动时间并计算相对百分比。
相对百分比的计算公式是：
3.实验结果
表1：各实验组的纤毛持续运动情况
4.实验结论
(1)空白对照组显微镜下粘膜表面完好，纤毛活跃。
(2)阳性对照组显微镜下粘膜表面纤毛脱落，纤毛不摆动。
(3)处方中溶剂pH7.4磷酸盐缓冲液对纤毛无影响，接近空白对照组。
(4)PTH(1-34)纤毛毒性随着PTH(1-34)的浓度增加而增加，但影响幅度小，也是可逆的。
(5)促透剂1000U透明质酸酶纤毛毒性较小，也是可逆的。
(6)促透剂10％
HS·15纤毛毒性稍大，但其停止运动后可短时间内恢复运动，并且考虑到鼻腔给药吸收快药物停留时间短，所以10％
HS·15的纤毛毒性是可接受的。
实验例5：辅料的纤毛毒性研究(在体法)
1.实验样品
如表2所示(配制方法如制备例4中制剂工艺进行配制)。
空白对照为0.9％生理盐水。
2.实验方法
将蟾蜍(体重相近若干只)仰卧固定，使口腔张开，于上腭粘膜处滴加药液0.5mL使其完全浸没上腭，接触60min后用生理盐水洗净药物，分离上腭粘膜以供显微镜观察纤毛运动情况。粘膜分离后立即洗净，平铺于载玻片上，于粘膜表现滴加生理盐水，盖上盖玻片，观察和记录纤毛运动的持续时间，并计算相对百分比。
相对百分比的计算公式是：
3.实验结果
表2：各实验组的纤毛持续运动情况
通过在体法对制备例1－3制备的PTH(1-34)鼻喷剂的纤毛毒性进行了评价，实验发现纤毛持续运动时间均长于离体法。分析原因，可能是离体法时，整块粘膜完全浸没在药液中，纤毛及其它各部分组织均可受药物影响，因此很可能通过其它机制间接影响纤毛运动。
在体法实验表明，虽然鼻喷剂样品3的纤毛毒性不是最小的，但是在可接受的范围内，并且综合考虑促透效果，本发明人选择制备例4制备的鼻喷剂样品4进一步的研究。
实验例6：在体给药纤毛毒性评价
1.实验样品
阴性对照(0.9％生理盐水)。
利用实验例2中0.1M pH 7.4的磷酸盐缓冲液，配制10mg/mLPTH(1-34)。
利用实验例2中0.1M pH 7.4的磷酸盐缓冲液，配制1000U/mL透明质酸酶。
利用实验例2中0.1M pH 7.4的磷酸盐缓冲液，配制10％
HS·15。具体方法是：取适量HS·15、适量透明质酸酶、适量苯扎氯铵利用实验例2中的0.1M pH 7.4的磷酸盐缓冲液配制为稀释液，称取一定量PTH(1-34)利用上述稀释液配制为10mg/mL PTH(1-34)+10％
HS·15+1000U透明质酸酶+0.08mg/mL苯扎氯铵。
2.实验方法
乙醚麻醉(24只SD雄鼠，体重在260-280g。)，鼻腔给药100μL，早晚各1次。连续给药8天，第9天大鼠恢复一天，第10天麻醉后取鼻中隔粘膜，生理盐水洗净，2.5％戊二醛固定、制备电镜样品并以扫描电镜拍摄。
3.实验结果
如图5A至图5F所示。结果显示：
1)与生理盐水组相比，10mg/mL PTH与加入10mg/mL PTH(1-34)+1000U透明质酸酶组大鼠纤毛均显示整齐完整，没有明显的损伤现象。
2)与生理盐水组相比，加入10mg/mL PTH(1-34)+10％
HS·15组和10mg/mL PTH(1-34)+10％
HS·15+1000U透明质酸酶+0.08mg/mL苯扎氯铵组的大鼠鼻腔纤毛没有脱落，但略显杂乱。显示10mg/mL PTH(1-34)+10％
HS·15有一定的鼻纤毛毒性。
实验例7：大鼠体内药动学研究
1.实验样品
(1)皮下给药0.03mg/mL PTH(1-34)，配制方法如下：
配制0.1M的pH7.4磷酸盐缓冲液：磷酸二氢钠1.87mg、磷酸氢二钠18.28mg，取适量PTH(1-34)利用0.1M的pH7.4磷酸盐缓冲液配制为0.03mg/mL。
(2)鼻腔给药0.3mg/mL PTH(1-34)，配制方法如下：
配制0.1M的pH7.4磷酸盐缓冲液：磷酸二氢钠1.87mg、磷酸氢二钠18.28mg，取适量PTH(1-34)利用0.1M的pH7.4磷酸盐缓冲液配制为0.3mg/mL。
(3)鼻腔给药0.3mg/mL PTH(1-34)+10％HS·15，配制方法如下：
配制0.1M的pH7.4磷酸盐缓冲液：磷酸二氢钠1.87及适量苯扎氯铵利用0.1M的pH7.4磷酸盐缓冲液配制为制剂稀释液，取适量PTH(1-34)利用上述稀释液配制为0.3mg/mL。
(4)鼻腔给药0.3mg/mL PTH(1-34)+10％HS·15+1000U透明质酸酶，配制方法如下：
配制0.1M的pH7.4磷酸盐缓冲液：磷酸二氢钠1.87mg、磷酸氢二钠18.28mg，取适量
HS·15与适量透明质酸酶利用0.1M的pH7.4磷酸盐缓冲液配制制剂稀释液，取适量PTH(1-34)利用上述稀释液配制为0.3mg/mL。
(5)鼻腔给药0.3mg/mL PTH(1-34)+1000U透明质酸酶，配制方法如下：
配制0.1M的pH7.4磷酸盐缓冲液：磷酸二氢钠1.87mg、磷酸氢二钠18.28mg，取适量透明质酸酶利用0.1M的pH7.4磷酸盐缓冲液配制制剂稀释液，取适量PTH(1-34)利用上述稀释液配制为0.3mg/mL。
备注：大鼠体内药代实验所选择制剂浓度低于制备例中制剂10mg/ml的浓度原因在于，该药代实验血药浓度分析手段为酶联免疫试剂盒法，由于试剂盒灵敏度原因，过高的浓度会是显色过快酶标仪无法测定，因此大鼠体内所选浓度比制剂浓度低。
2.实验方法
体重约220g的雌性SD大鼠以乌拉坦麻醉，分为五组，每组6只。一组鼻腔给予100μg/kg制备例4制备的PTH(1-34)鼻喷剂样品4；另一组皮下注射给予100μg/kg的PTH(1-34)pH7.4磷酸盐缓冲液。在给药后0min、5min、10min、15min、30min、45min、60min、90min、120min、150min、180min和240min分别眼眶取血150μL，离心后取上清以ELISA测定PTH(1-34)浓度，绘制药时曲线，并计算曲线下面积和相对生物利用度。
3.实验结果
如下面的表3和图6所示。
结果显示，10％HS·15与1000U透明质酸酶联用表现出最好的生物利用度。单独利用1000U透明质酸酶作为促透剂时，其在体内的促透效果并不佳，其生物利用度甚至逊于鼻腔给予PTH(1-34)空白组，但与10％HS·15联用时明显可以提高PTH(1-34)的促透。以AUC0-240为例，鼻腔给药PTH(1-34)+10％HS·15是382.26±56.45ng·min·mL-1，而鼻腔给药PTH(1-34)+10％HS·15+1000U透明质酸酶是586.69±11.24ng·min·mL-1，显著高于前者。显然，透明质酸酶显著提高了HS·15的促透效果。并且考虑到单独用透明质酸酶促透效果不佳(与空白组大致相同)，单用透明质酸酶的促透效果基本可以忽略，可见透明质酸酶与HS·15在促透效果上存在协同作用。
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。
Claims (10)
1.一种甲状旁腺激素1-34鼻喷剂，其包括有效量的人PTH(1-34)或其生物类似物，以及如下辅料：
至少一种非离子型表面活性剂、透明质酸酶和缓冲盐溶液。
2.根据权利要求1所述的鼻喷剂，其中，人PTH(1-34)或其生物类似物的浓度为2-20mg/mL，优选为5-15mg/mL，更优选为5-12mg/mL或8-12mg/mL，特别优选为8mg/mL、9mg/mL或10mg/mL。
3.根据权利要求1至2中任一权利要求所述的鼻喷剂，其中，所述非离子型表面活性剂为
HS·15；
优选地，
HS·15的浓度为50-200mg/mL，优选为50-170mg/mL，更优选为80-120mg/mL，特别优选为10％。
4.根据权利要求1至3中任一权利要求所述的鼻喷剂，其中，每mL鼻喷剂中的透明质酸酶的量为500-3000U，优选为500-1500U，更优选为800-1200U，特别优选为1000U。
5.根据权利要求1至4中任一权利要求所述的鼻喷剂，其中，所述缓冲盐溶液为选自磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、醋酸钠和冰醋酸中的一种或多种的缓冲盐溶液，优选磷酸二氢钠和磷酸氢二钠的缓冲盐溶液；更优选pH值为7.2-7.5例如7.4的磷酸盐缓冲液，特别优选0.1M的磷酸盐缓冲液。
6.根据权利要求1至5中任一权利要求所述的鼻喷剂，其还包含适量的防腐剂和/或稳定剂；
优选地，所述防腐剂选自间甲酚、氮气、苯扎氯铵、三氯叔丁醇、山梨醇、苯甲酸和苯甲酸钠中的一种或多种，优选苯扎氯铵；
优选地，所述稳定剂选自选自D-甘露醇、蔗糖、海藻糖、肌酐、甘氨酸、辛酸钠中的一种或多种，更优选D-甘露醇和/或蔗糖。
7.根据权利要求1至6中任一权利要求所述的鼻喷剂，其包含如下组分：
人PTH(1-34)或其生物类似物8-12mg/mL，
HS·15为80-120mg/mL，
透明质酸酶800-1200U/mL，以及
适量的磷酸盐缓冲液例如0.1M的磷酸盐缓冲液；
优选地，所述鼻喷剂包含如下组分：
人PTH(1-34)或其生物类似物8mg/mL、9mg/mL或10mg/mL，
透明质酸酶1000U/mL，以及
适量的磷酸盐缓冲液例如0.1M的磷酸盐缓冲液。
8.一种药物产品，其包含权利要求1至7中任一权利要求所述的鼻喷剂以及盛有所述鼻喷剂的包装容器；
优选地，所述包装容器内还充有氮气；
优选地，所述药物产品的单位剂量为1mL；
可选地，所述药物产品还包含药品说明书。
9.一种制备权利要求1至7中任一权利要求所述的鼻喷剂的方法，包括下述步骤：
1)将除了人PTH(1-34)或其生物类似物的其余组分溶于缓冲盐溶液中配制成稀释液；
2)人PTH(1-34)或其生物类似物加入到稀释液中，定容并充分混匀；
可选地，还包括下述步骤：
3)包装并充入氮气。
10.权利要求1至7中任一权利要求所述的鼻喷剂在制备治疗和/或预防骨质疏松症特别是绝经后骨质疏松症的药物中的用途。
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