CN110710612A - 一种提高肉鸡生产性能的中药发酵饲料添加剂及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种提高肉鸡生产性能的中药发酵饲料添加剂的制备方法，步骤如下：(1)当归补血汤药粉的制备；(2)发酵培养基的制备；(3)枯草芽孢杆菌的活化及种子液的制备；(4)发酵：将种子液接种到发酵培养基中，在37℃下摇床发酵培养。本发明还提供应用该方法制备得到的中药发酵饲料添加剂。本发明采用枯草芽孢杆菌液体发酵DBT的方式，通过42d饲喂试验和相关指标测定，日粮中添加1.0％的当归补血汤发酵产物能够显著促进白羽肉鸡的生长性能、免疫功能和抗氧化能力，并对小肠黏膜结构有显著的影响，饲喂效果明显优于未发酵组和空白对照组，可作为一种新型饲料添加剂广泛应用于畜禽养殖业。

Description

一种提高肉鸡生产性能的中药发酵饲料添加剂及其制备方法
技术领域
本发明属于医药制剂技术领域，具体涉及一种提高肉鸡生产性能的中药发酵饲料添加剂及其制备方法。
背景技术
随着畜禽养殖业规模的逐渐扩大，日粮饲料的消耗量也越来越大，其中，饲料添加剂的选择对于畜禽养殖业的发展起着重要作用，中药发酵饲料添加剂具有毒副作用小、无抗药性、功能多样等优点，近年来受到越来越多研究人员的关注，因此，研究和开发新型的绿色、无公害饲料添加剂来替代抗生素已成当前研究的必然发展趋势。天然药物产品具有抗菌、增强免疫、减轻应激等多种生物活性，作为家畜饲料添加剂在我国已广泛使用了数百年。当归补血汤(Danggui Buxue Tang，DBT)是一种传统的中药复方，由黄芪(AstragaliRadix，AR)和当归(Angelicae Sinensis Radix，ASR)组成，干重比例为1∶5，药理学研究表明，当归补血汤不仅具有促进造血功能，刺激心血管循环，预防骨质疏松，增加抗氧化活性，同时还可通过激活T细胞外信号调节激酶，达到刺激免疫反应的能力。Li等通过给肉鸡饮水给予当归补血汤，发现其生长性能及体内免疫细胞因子水平有一定提高。目前，中药饲料添加剂对于肉鸡的促生长及提高免疫力等功效已得到广泛认可，陈国顺等发现在日粮中添加0.3％中草药饲料添加剂可明显提高黄羽肉鸡的日增重，并降低料肉比。陈钢等通过在饲粮中添加中药复方，发现肉仔鸡的生长性能和免疫性能均有一定程度的提高。而在中药发酵过程中，益生菌通过其代谢活动中产生的各种酶和未知化合物，与中药进行互作，使中药有效成分得到充分释放的同时也可产生其他新物质，从而使中药药效、机体的生长及免疫性能都得到显著增强。李宗杰通过采用多种益生菌发酵复方中药作为饲料添加剂，可显著提高肉鸡日增重，降低料肉比并提高其免疫机能。此外，益生菌和中药对动物胃肠道菌群的平衡也起着重要作用。张国华等通过在肉鸡日粮中添加黄芪和乳酸菌制剂可显著降低盲肠中大肠杆菌的数量并提高乳酸杆菌的数量。因此，益生菌发酵中药可有效改善动物机体的生长和免疫机能。
近年来，随着畜禽养殖业的快速发展以及“禁抗”条例的逐步完善，中药饲料添加剂引起了人们的广泛关注。DBT作为经典中药复方，虽然在前期研究中发现其具有一定的促生长和提高免疫功能等作用，但效果不显著，不能完全发挥DBT中药复方中有效成分的活性作用，且缺乏其对雏鸡生长性能、免疫功能及抗氧化能力影响的系统研究。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供了一种有效提高肉鸡生产性能的中药发酵饲料添加剂。本发明采用枯草芽孢杆菌液体发酵DBT的方式，通过42d饲喂试验和相关指标测定，日粮中添加1.0％的当归补血汤发酵产物能够显著促进白羽肉鸡的生长性能、免疫功能和抗氧化能力，并对小肠黏膜结构有显著的影响，饲喂效果明显优于未发酵组和空白对照组，可作为一种新型饲料添加剂广泛应用于畜禽养殖业。
本发明提供一种提高肉鸡生产性能的中药发酵饲料添加剂的制备方法，步骤如下：
(1)当归补血汤药粉的制备：将黄芪和当归按照5：1的重量比混合并粉碎，得到当归补血汤药粉；作为优选，粉碎后过60目筛；
(2)发酵培养基的制备：0.5％-2％无水葡萄糖，0.5％-2％蛋白胨，0.3％酵母浸出粉，0.05％磷酸氢二钾，0.07％无水硫酸镁，0.02％碳酸钙，6％步骤(1)制备的当归补血汤药粉，100ml去离子水，初始pH为7.2；以上百分比为重量百分比；
(3)枯草芽孢杆菌的活化及种子液的制备；
(4)发酵：将步骤(3)得到的种子液接种到步骤(2)制备的发酵培养基中，在37℃下摇床发酵培养，接种量为1％-9％，发酵时间为24h-72h。
作为优选，步骤(2)中，所述无水葡萄糖的浓度为0.5％-1.0％；
作为优选，所述无水葡萄糖的浓度为0.95％。
作为优选，步骤(2)中，所述蛋白胨的浓度为0.5％～1.5％。
作为优选，步骤(2)中，所述蛋白胨的浓度为1.52％。
作为优选，步骤(3)中，所述种子液中枯草芽孢杆菌的浓度为3.6×108CFU/ml。
作为优选，步骤(4)中，所述接种量为2.9％-3％；作为优选，所述接种量为2.92％。
作为优选，步骤(4)中，所述发酵时间为35h-36h；作为优选，所述发酵时间为35.8h。
本发明提供一种中药发酵饲料添加剂，其是应用上述任一种方法制备得到的。
本发明提供上述中药发酵饲料添加剂在制备提高肉鸡生产性能、免疫能力、抗氧化能力和/或改善小肠黏膜结构的饲料添加剂中的应用；
作为优选，所述提高肉鸡生产性能为提高肉鸡日增重，提高肉鸡日采食量和降低肉鸡料肉比；提高肉鸡免疫能力为提高血清中新城疫抗体效价、IL-2、IL-6、INF-γ、TNF-α的含量，提高肉鸡抗氧化能力为提高血清中超氧歧化物歧化酶、总抗氧化能力谷胱和甘肽过氧化物的含量，降低丙二醛的含量；改善小肠黏膜结构为提高肉鸡十二指肠黏膜的绒毛高度和绒毛高度/隐窝深度比值，降低隐窝深度。
本发明提供一种饲料，所述饲料包括重量百分比为0.5％-2.0％的上述的中药发酵饲料添加剂；
作为优选，所述饲料包括重量百分比为1.0％-2.0％的上述的中药发酵饲料添加剂。
本发明采用枯草芽孢杆菌液体发酵DBT的方式，通过42d饲喂试验和相关指标测定，日粮中添加1.0％的当归补血汤发酵产物能够显著促进白羽肉鸡的生长性能、免疫功能和抗氧化能力，并对小肠黏膜结构有显著的影响，饲喂效果明显优于未发酵组和空白对照组，可作为一种新型饲料添加剂广泛应用于畜禽养殖业。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1为葡萄糖、蛋白胨添加量，接种量及发酵时间对DBT多糖提取率的影响。
图2为蛋白胨浓度和接种量对DBT多糖提取率的交互作用的等高线和响应面。
图3为蛋白胨浓度和发酵时间对DBT多糖提取率的交互作用的等高线和响应面。
图4为接种量和发酵时间对DBT多糖提取率的交互作用的等高线和响应面。
图5为DBT发酵产物对肉鸡血清新城疫抗体效价的影响。
图6为DBT发酵产物对肉鸡血清细胞因子的影响。
图7为DBT发酵产物对肉鸡血清抗氧化能力的影响。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均购自常规生化试剂公司。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
实施例1当归补血汤发酵工艺条件的优化
1材料与方法
1.1材料与试剂
黄芪，当归：均购自甘肃复兴厚生物医药科技有限公司；枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)：购自中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC10089)；无水葡萄糖、苯酚、3,5－二硝基水杨酸、无水乙醇，浓硫酸等均为分析纯。
1.2仪器与设备
200克手提式高速万能粉碎机：温岭市林大机械有限公司；标准60目筛：浙江上虞市金鼎标准筛具厂；Allegra X-15R台式冷冻离心机：贝克曼库尔特有限公司；HH-4型数显恒温水浴锅：常州国华电器有限公司；KQ-600DE型数控超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司；LGJ-10F型真空冷冻干燥机：北京松源华兴科技发展有限公司；BS224S电子天平：赛多利斯科学仪器(北京)有限公司；旋转蒸发仪：深圳市华测计量技术有限公司；全波长酶标仪：赛默飞世尔科技有限公司。
1.3试验方法
1.3.1当归补血汤(DBT)药粉的制备
将黄芪和当归洗净烘干后，按重量比为5:1的比例准确称取两种药材混合粉碎，并过60目筛，得到DBT药粉。
1.3.2发酵培养基组分
0.5％-2％无水葡萄糖，0.5％-2％蛋白胨，0.3％酵母浸出粉，0.05％磷酸氢二钾，0.07％无水硫酸镁，0.02％碳酸钙，6％步骤1.3.1制备的当归补血汤药粉，100ml去离子水，初始pH为7.2。以上百分比为重量百分比。
1.3.3菌种活化及种子液制备
无菌条件下，取-70℃下保存的枯草芽孢杆菌一环接种于血平板上，于37℃恒温箱中过夜培养。挑取单菌落于5ml LB肉汤中，在37℃，160r/min条件下培养15h，以2％的体积比接种于100ml LB肉汤中，于相同条件下传代培养，得到种子液。种子液中枯草芽孢杆菌的浓度为3.6×108CFU/ml。
1.3.4发酵
将步骤1.3.3中得到的种子液接种于发酵培养基中，在37℃，160r/min条件下发酵，接种量为1％-9％，发酵时间为24h-72h。
1.3.55％苯酚溶液的配制
称取80g苯酚于100ml烧杯中，加水溶解，并转移至棕色瓶中，取5ml苯酚溶液于75ml去离子水中，混匀得到5％的苯酚溶液。
1.3.6DNS试剂的配制
称取185g酒石酸钾钠溶于500ml蒸馏水，加热至45℃，再加入6.3g的3,5－二硝基水杨酸和262ml氢氧化钠(2mol/L)溶液，溶解后加入5g苯酚和5g亚硫酸钠，搅拌溶解。冷却后加蒸馏水定容至1000ml，贮存于棕色瓶中暗处保存7d备用。
1.3.7葡萄糖标准曲线的建立
准确称取无水葡萄糖100mg于100ml容量瓶中，加入去离子水定容至刻度，摇匀，配制成1mg/ml的标准溶液。采用DNS法测定还原糖含量溶液，分别取0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0ml于6支25mL比色管中，补充蒸馏水至1mL，混匀，加入2mLDNS试剂，摇匀，沸水浴5min，取出流水浴5min，补充蒸馏水至25ml，以空白管为对照，测定540nm波长处的吸光度。
准确吸取1.3.7中的葡萄糖标准溶液1ml于15ml试管中，加入9ml蒸馏水，混匀。分别取0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0ml于10ml比色管中，补充蒸馏水至1ml。加入1ml 5％苯酚溶液，然后迅速垂直加入5ml浓硫酸，摇匀，静置10min，于沸水浴中反应20min，冷却至室温后于490nm处测定其吸光度。
1.3.8供试品溶液的制备
添加10倍量的去离子水至步骤1.3.4发酵得到的发酵液中煎煮1h，4000r/min离心10min，收集上清，残渣加8倍量水继续煎煮1h，离心后合并两次上清，于旋转蒸发仪中浓缩后加入3倍体积的95％乙醇，搅拌均匀后在4℃下静置24h，4000r/min离心10min，沉淀于真空冷冻干燥机中冻干并称重，得到粗多糖冻干粉。取适量粗多糖冻干粉配制成5g/L的溶液，并取1ml稀释40倍，分别用于样品中还原糖和总糖的测定。同时对DBT进行煎煮并提取多糖，作为未发酵组。
1.3.9结果计算
DBT多糖提取率的测定
DBT多糖提取率＝(总糖质量-还原糖质量)/生药材质量×100％。
1.4单因素试验
1.4.1葡萄糖浓度对多糖提取率的影响
蛋白胨浓度为1％，接种量为3％，发酵时间为48h，研究不同葡萄糖浓度(0.5％、1％、1.5％、2％)对发酵液中多糖提取率的影响。
1.4.2蛋白胨浓度对多糖提取率的影响
葡萄糖浓度为1％，接种量为3％，发酵时间为48h，研究不同蛋白胨浓度(0.5％、1％、1.5％、2％)对发酵液中多糖提取率的影响。
1.4.3接种量对多糖提取率的影响
葡萄糖浓度为1％，蛋白胨浓度为1.5％，发酵时间为48h，研究不同接种量(1％、3％、5％、7％、9％)对发酵液中多糖提取率的影响。
1.4.4发酵时间对多糖提取率的影响
葡萄糖浓度为1％，蛋白胨浓度为1.5％，接种量为3％，研究不同发酵时间(24h、36h、48h、60h、72h)对发酵液中多糖提取率的影响。
1.5响应面实验设计
在单因素试验结果的基础上，采用Box-Benhnken中心组合试验设计，设计以葡萄糖浓度、蛋白胨浓度、接种量、发酵时间四因素三水平的回归方程，以拟合各因素与响应值多糖提取率的关系，利用Design-Expert 8.0.6软件系统进行响应面分析，以得到当归补血汤总多糖的最佳制备工艺参数。主要考察因素是(自变量)：葡萄糖浓度、蛋白胨浓度、接种量、发酵时间，分别用A、B、C、D表示，用-1、0、1分别表示自变量的低、中、高水平。试验设计因素编码及水平见表1。
表1响应面试验设计因素及水平
Figure BDA0002234427310000071
2结果与讨论
2.1标准曲线的建立
利用DNS法测定还原糖，以吸光度为纵坐标，葡萄糖浓度(g/L)为横坐标分别绘制标准曲线，得到y＝0.7754x+0.0513，R2＝0.9999，线性关系良好，可用于还原糖含量测定；苯酚—硫酸法测定总糖，以吸光度为纵坐标，葡萄糖浓度(g/L)为横坐标绘制标准曲线，得到y＝3.8586x+0.0662，R2＝0.9987，线性关系良好，用于总糖含量测定。
2.2单因素试验
由图1A、1B可知，葡萄糖和蛋白胨添加量分别在0.5％～1.0％和0.5％～1.5％之间时，多糖提取率随着添加量的增加而增大，在1.0％和1.5％时达到最大，多糖提取率分别为7.72％和8.26％，当葡萄糖和蛋白胨添加量分别大于1.0％和1.5％时，随着添加量的增加，多糖提取率呈现下降趋势。因此，培养基中葡萄糖和蛋白胨最适添加量分别为1.0％和1.5％。由图1C、1D可知，最适接种量和最佳发酵时间分别为3％和36h时，多糖提取率达到最大。
2.3响应面法优化结果
2.3.1模型方程的建立与显著性检验
通过响应面法设计得出DBT多糖提取率的数值，如表2所示。方差分析结果见表3。
表2 Box-Behnken试验设计及结果
Figure BDA0002234427310000081
Figure BDA0002234427310000091
表3方差分析结果
Figure BDA0002234427310000092
注：*为差异显著，P<0.05；**为差异极显著，P<0.01。
利用Design-Expert 8.0.6对表2中的数据进行分析，在对各因素进行回归分析后得到响应值多糖提取率(Y)对葡萄糖浓度(A)、蛋白胨浓度(B)、接种量(C)、发酵时间(D)的二次多项回归方程Y＝9.37-0.2A+0.087B-0.047C-0.023D-0.03AB-0.14AC+0.013A D-0.38BC+0.15BD-0.15CD-1.06A2-1.21B2-0.57C2-0.24D2。
由表3方差分析结果可知，各因素对多糖提取量影响的大小顺序依次为：葡萄糖浓度>蛋白胨浓度>接种量>发酵时间。同时本试验所选用的模型极显著(P＜0.01)，且方程失拟项不显著(P＝0.4438＞0.05)，说明未知因素对试验影响较小，此模型适合本试验。回归决定系数R2＝0.9839，校正决定系数R2 Adj＝0.9678，说明此模型具有相对较优的拟合程度，可以解释其中96.78％变化的响应值，仅有总变异的3.22％变化无法用此模型解释，具有统计学意义，可以用来对发酵提取当归补血汤多糖的工艺研究进行初步分析和预测。一次项A因素和B因素、交互项BD、CD以及二次项D2对响应值多糖提取率具有显著影响(P<0.05)，交互项BC及二次项A2、B2、C2对响应值多糖提取率影响极显著(P<0.01)。2.3.2各因素交互作用分析
通过Design-Expert 8.0.6软件分析后，可以分别得到任意两因素以及其交互作用对DBT多糖提取率的响应面图和等高线图。结果显示，葡萄糖添加量(A)与其他三个因素(B、C、D)两两之间交互作用不显著(P＞0.05)，而其他三因素(B、C、D)两两之间交互作用显著或极显著。蛋白胨添加量和接种量、蛋白胨添加量和发酵时间以及接种量和发酵时间对多糖提取率的影响见图2-图4。由图2-图4可知，当接种量一定时，随着蛋白胨添加量的增加，多糖的提取率呈现先递增后递减的趋势，反之，当蛋白胨添加量一定时，DBT多糖的提取率随着接种量的增加呈现先递增后递减的趋势，表明蛋白胨对多糖提取率影响较大，且两因素交互作用显著；当发酵时间一定时，随着蛋白胨添加量的增加，多糖的提取率呈现先递增后递减的趋势，而当蛋白胨添加量一定时，该趋势较为平缓，同时，随着两因素的逐渐增大，DBT多糖提取率也呈现先递增后递减的趋势，表明蛋白胨添加量对DBT多糖提取率影响较大，且两因素交互作用显著；当发酵时间和接种量同时增大时，多糖的提取率呈现先递增后递减的趋势，表明两因素交互作用显著。
2.3.3最佳工艺条件确定及验证试验
通过Design Expert 8.0.6软件分析的得到DBT多糖提取的最优工艺条件：葡萄糖浓度为0.95％，蛋白胨浓度为1.52％，接种量为2.92％，发酵时间为35.72h，DBT多糖提取率为9.38％。参考最优条件，结合实际对验证试验采取的工艺条件适当调整为：葡萄糖浓度为0.95％，蛋白胨浓度为1.52％，接种量为2.92％，发酵时间为35.8h。根据最终优化工艺条件进行验证试验，得到DBT多糖提取率为9.23％，与模型的理论值相差1.60％。同时，与未发酵组(4.62％)相比，DBT多糖提取率提高了近两倍。
实施例2
本发明的提高肉鸡生产性能的中药发酵饲料添加剂的制备方法为：
(1)当归补血汤(DBT)药粉的制备：将黄芪和当归洗净烘干后，按重量比为5:1的比例准确称取两种药材混合粉碎，并过60目筛，得到DBT药粉。
(2)发酵培养基的制备
0.95％无水葡萄糖，1.52％蛋白胨，0.3％酵母浸出粉，0.05％磷酸氢二钾，0.07％无水硫酸镁，0.02％碳酸钙，6％步骤1.3.1制备的当归补血汤药粉，100ml去离子水，初始pH为7.2。
(3)菌种活化及种子液制备
无菌条件下，取-70℃下保存的枯草芽孢杆菌一环接种于血平板上，于37℃恒温箱中过夜培养。挑取单菌落于5ml LB肉汤中，在37℃，160r/min条件下培养15h，以2％的体积比接种于100ml LB肉汤中，于相同条件下传代培养，得到种子液。种子液中枯草芽孢杆菌的浓度为3.6×108CFU/ml。
(4)发酵
将1.3.3中得到的种子液接种于发酵培养基中，在37℃，160r/min条件下发酵，接种量为2.92％，发酵时间为35.8h。
得到的发酵产物中活菌数约为6.8×108CFU/g。得到的DBT多糖提取率为9.23％。
实施例3
本发明的提高肉鸡生产性能的中药发酵饲料添加剂的制备方法为：
(1)当归补血汤(DBT)药粉的制备：将黄芪和当归洗净烘干后，按重量比为5:1的比例准确称取两种药材混合粉碎，并过60目筛，得到DBT药粉。
(2)发酵培养基的制备
1.0％无水葡萄糖，1.0％蛋白胨，0.3％酵母浸出粉，0.05％磷酸氢二钾，0.07％无水硫酸镁，0.02％碳酸钙，6％步骤1.3.1制备的当归补血汤药粉，100ml去离子水，初始pH为7.2。
(3)菌种活化及种子液制备
无菌条件下，取-70℃下保存的枯草芽孢杆菌一环接种于血平板上，于37℃恒温箱中过夜培养。挑取单菌落于5ml LB肉汤中，在37℃，160r/min条件下培养15h，以2％的体积比接种于100ml LB肉汤中，于相同条件下传代培养，得到种子液。种子液中枯草芽孢杆菌的浓度为3.6×108CFU/ml。
(4)发酵
将1.3.3中得到的种子液接种于发酵培养基中，在37℃，160r/min条件下发酵，接种量为5％，发酵时间为36h。
得到的发酵产物中活菌数约为7.6×108CFU/g。得到的DBT多糖提取率为7.79％。
实施例4
本发明的提高肉鸡生产性能的中药发酵饲料添加剂的制备方法为：
(1)当归补血汤(DBT)药粉的制备：将黄芪和当归洗净烘干后，按重量比为5:1的比例准确称取两种药材混合粉碎，并过60目筛，得到DBT药粉。
(2)发酵培养基的制备
0.5％无水葡萄糖，1.0％蛋白胨，0.3％酵母浸出粉，0.05％磷酸氢二钾，0.07％无水硫酸镁，0.02％碳酸钙，6％步骤1.3.1制备的当归补血汤药粉，100ml去离子水，初始pH为7.2。
(3)菌种活化及种子液制备
无菌条件下，取-70℃下保存的枯草芽孢杆菌一环接种于血平板上，于37℃恒温箱中过夜培养。挑取单菌落于5ml LB肉汤中，在37℃，160r/min条件下培养15h，以2％的体积比接种于100ml LB肉汤中，于相同条件下传代培养，得到种子液。种子液中枯草芽孢杆菌的浓度为3.6×108CFU/ml。
(4)发酵
将1.3.3中得到的种子液接种于发酵培养基中，在37℃，160r/min条件下发酵，接种量为3％，发酵时间为36h。
得到的发酵产物中活菌数约为4.5×108CFU/g。得到的DBT多糖提取率为7.09％。
实施例5当归补血汤发酵产物饲料添加对肉鸡生产、免疫、抗氧化性能及小肠黏膜结构的影响
1材料与方法
试验于2018年11月至2019年6月份在中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所大洼山标准化实验动物房和中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所兽用天然药物研究室完成。1.1试验材料
基础饲料购自北京科澳协力饲料有限公司；新城疫(Lasota株)、传染性法氏囊疫苗购自哈药集团有限公司。黄芪、当归均购自甘肃复兴厚生物医药科技有限公司；枯草芽孢杆菌购自中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC 10089)；实施例2制备的DBT发酵产物(活菌数约为6.8×108CFU/g)由本实验室制备。
试验采用单因素完全随机设计，210只1日龄体重相近、健康的白羽肉鸡，各组鸡的初始体重经方差检验差异不显著(P＞0.05)，随机分成5个处理，每个处理6个重复，每个重复7只鸡，A1为对照组，饲喂基础日粮，A2为未发酵组，在基础日粮中添加1％的DBT药粉，A3～A5为发酵组，在日粮中分别添加重量百分比为0.5％、1.0％、2.0％的DBT发酵产物。饲养试验在中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所大洼山标准化实验动物房进行，试验期为42d，1-21日龄为试验前期，22-42日龄为试验后期。
1.2试验饲粮与饲养管理
试验饲粮采用玉米-豆粕型基础饲粮，根据中国鸡饲养标准(2004)营养需要量配制饲粮。每笼7只肉鸡饲养在平养笼中，试验期间所有肉鸡饲养管理条件一致，环境温度从36℃逐渐降低至22℃，自由采食和饮水，24h光照，直至实验结束，期间每周消毒，并按照常规程序进行免疫接种。
1.3测定指标和方法
1.3.1生长性能
分别在肉鸡21日龄和42日龄，禁食12h，对每个重复进行全群称重，详细记录各阶段的饲料消耗量，计算不同生长阶段肉鸡的平均日增重(ADG)、平均日采食量(ADFI)和料肉比(F/G)。
1.3.2样品采集
分别在肉鸡21日龄和42日龄，禁食12h后，分别从每个重复中随机取2只肉鸡，心脏采血10mL后4℃过夜，血清析出后3000r/min离心10min，分离血清，将血清样本分装到2mL离心管中，-80℃保存，待测。
1.3.3免疫器官脏器指数测定
分别在肉鸡21日龄和42日龄，心脏采血后放血处死，剖检，采集脾脏、法氏囊并称重，脏器指数＝脏器湿重(g)/体重(g)×100％。
1.3.4十二指肠黏膜组织结构观察
分别在肉鸡21日龄和42日龄，心脏采血后放血处死，剖检，在十二指肠的中间部位截取约2-3cm，迅速浸入生理盐水中漂洗内容物，然后置于10％甲醛固定液中。将固定的标本经水洗、脱水、透明等步骤处理，再用石蜡包埋，冷却凝固后，制作厚度5μm的连续切片，苏木精伊红染色，树脂封片。在石蜡切片中选出典型视野，采用荧光倒置显色镜及显微图像分析系统，测量肠绒毛高度(Villous height,V)和隐窝深度(Crypt depth,C)，计算绒毛高度/隐窝深度(V/C)。
1.3.5新城疫抗体效价的测定
采用半微量血凝抑制实验法(HI)，HI抗体效价以Log2的几何平均值表示。
1.3.6细胞因子的测定
采用酶联免疫吸附法(ELISA)，测定白介素-2(IL-2)、白介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-γ(IFN-γ)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)，所用试剂购自北京索莱宝科技有限公司(生产批号：SBE221910)，详细步骤参考试剂盒说明书。
1.3.7抗氧化指标的测定
血清谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)、超氧化物歧化酶(SOD)、总抗氧化能力(T-AOC)、丙二醛(MDA)含量采用购自南京建成生物工程研究所的试剂盒进行测定(生产批号：20190526)，详细步骤参照试剂盒说明书。
1.4数据分析
试验数据采用SPSS17.0软件进行单因素(one-wayANOVA)方差分析，并采用LSD法进行组间差异显著性检验，以P＜0.05作为差异显著水平，数据分析结果用平均数±标准差表示。
2结果
2.1实施例2制备的DBT发酵产物对肉鸡生产性能的影响
表4 DBT发酵产物对肉鸡生长性能的影响
Figure BDA0002234427310000161
注：同行数据肩标无字母或相同字母表示差异不显著(P＞0.05)，不同小写字母表示差异显著(P＜
0.05)。下表同。
DBT发酵产物对肉鸡生产性能的影响见表4。由表4可知，在生长前期(1-21日龄)，各组肉鸡ADG无显著性差异。在生长后期(22-42日龄)，各试验组肉鸡(A2-A5)的ADG与对照组均有显著提高(P＜0.05)，分别增加了4.59％、6.28％、11.72％和14.76％，其中，1.0％和2.0％发酵组最为显著(P＜0.05)，但两组之间无显著性差异。从整个生长全期来看，各试验组肉鸡ADG与对照组相比均有所增加，但各组之间差异不显著。
在生长前期(1-21日龄)，1.0％和2.0％发酵组的ADFI与其他三组(A1-A3)相比显著减少(P＜0.05)，分别降低了7.49％、7.98％、8.29％和7.52％、8.00％、8.31％。在生长后期(22-42日龄)，试验组A2-A5的ADFI与对照组相比均显著减少(P＜0.05)，分别降低了3.22％、4.95％、5.13％、5.31％，但各试验组之间差异不显著。从整个生长全期来看，与生长前期规律相似，1.0％和2.0％发酵组的ADFI与对照组及试验组A2、A3相比显著减少(P＜0.05)，分别降低了5.75％、3.59％、2.41％和5.88％、3.73％、2.56％。在生长前期与全期中，1.0％和2.0％发酵组之间，未发酵组、0.5％发酵组与对照组之间都无显著性差异。
在生长前期(1-21日龄)，各试验组的F/G与对照组相比无显著性差异。在生长后期(22-42日龄)，与对照组相比，未发酵组与发酵组(0.5％、1.0％、2.0％)分别显著降低(P＜0.05)了7.73％、10.63％、15.46％、17.39％。从整个生长全期来看，与对照组相比，发酵组(0.5％、1.0％、2.0％)的F/G分别显著降低(P＜0.05)了5.49％、12.64％、13.73％，其中1.0％和2.0％影响最为显著(P＜0.05)，而未发酵组与对照组相比差异不显著。
2.2DBT发酵产物对肉鸡免疫器官指数的影响
DBT发酵产物对肉鸡免疫器官指数的影响见表5。
在21d时，1.0％发酵组与未发酵组相比脾脏指数显著增加9.52％(P<0.05)，其他各组之间差异不显著。发酵组(0.5％、1.0％、2.0％)的法氏囊指数与对照组和未发酵组相比具有显著性差异(P<0.05)，其中2.0％发酵组影响最为显著，分别增加了12.17％和9.28％，但未发酵组与对照组差异不显著。
在42d时，发酵组(0.5％、1.0％、2.0％)的脾脏指数与对照组和未发酵组相比具有显著性差异(P<0.05)，其中1.0％发酵组脾脏指数较高(P>0.05)，与对照组和未发酵组相比分别增加了20.42％和11.04％，各发酵组之间以及对照组与未发酵组之间差异不显著。1.0％和2.0％发酵组的法氏囊指数与其他三组相比具有显著性差异(P<0.05)，其中与对照组相比分别增加了21.43％和26.79％，但两组之间无显著性差异，0.5％发酵组和未发酵组与对照组相比差异也不显著。
表5 DBT发酵产物对肉鸡免疫器官指数的影响
Figure BDA0002234427310000171
2.3DBT发酵产物对肉鸡血清NDV-HI抗体效价的影响
图5为DBT发酵产物对肉鸡血清新城疫抗体效价的影响。
注：柱形标注不同字母表示差异显著(P＜0.05)。下同。
由图5可知，在21d和42d，1.0％和2.0％发酵组的抗体效价均比其他三组有显著性提高(P<0.05)，且2.0％发酵组高于1.0％发酵组(P<0.05)。2.0％发酵组在21d和42d时的抗体效价分别比对照组提高了18.93％和15.15％，未发酵组与0.5％发酵组与对照组相比较在21d时均有一定水平提高(P<0.05)，但在42d时差异不显著。
2.4DBT发酵产物对肉鸡血清细胞因子的影响
图6为DBT发酵产物对肉鸡血清细胞因子的影响。
由图6可知，在21d和42d时，与未发酵组和对照组相比，发酵组对于肉鸡血清中各个细胞因子的影响具有显著性差异(P<0.05)，其中，1.0％和2.0％发酵组影响较为突出，但两组之间差异不显著，从整体上看，日粮中添加1.0％的发酵产物可对血清中四种细胞因子含量起到显著性效果，与对照组相比，在21d时，1.0％发酵组可使血清中IL-2(A)、IL-6(B)、TNF-α(C)、INF-γ(D)含量分别提高17.63％、17.89％、9.75％和7.24％。未发酵组和对照组相比，在IL-2含量有显著性增加(P<0.05)，其他三个指标均无显著性差异。在42d时，IL-2和IL-6含量较21d时有所下降，与对照组相比，1.0％发酵组血清中IL-2、IL-6含量分别降低了22.92％、15.51％，TNF-α、INF-γ含量分别提高了20.42％、11.67％。与对照组相比，未发酵组在IL-2和IL-6含量上差异不显著，但在TNF-α、INF-γ含量上有显著性提高(P<0.05)。
2.5DBT发酵产物对肉鸡血清抗氧化指标的影响
图7为DBT发酵产物对肉鸡血清抗氧化能力的影响。
由图7可知，在21d时，各组之间的超氧歧化物歧化酶(A)及总抗氧化能力(B)含量无显著性差异(P>0.05)，与对照组相比较，各试验组(A2-A5)谷胱甘肽过氧化物(GSH-Px)(C)含量分别提高(P<0.05)了1.73％、3.22％、8.19％、7.27％，但各试验组之间差异不显著(P>0.05)。1.0％和2.0％发酵组与其他三组相比较，血清中丙二醛(D)含量显著性降低(P<0.05)，但两发酵组以及其他三组之间差异不显著。在42d时，与未发酵组和对照组相比，1.0％和2.0％发酵组对于肉鸡血清中各抗氧化指标的影响较未发酵组与对照组显著(P<0.05)，但两组之间差异不显著，1.0％发酵组与对照组相比，超氧歧化物歧化酶、总抗氧化能力及谷胱甘肽过氧化物含量分别提高了19.11％、42.81％、8.28％，丙二醛含量降低了13.69％。
2.6DBT发酵产物对肉鸡十二指肠黏膜组织结构的影响
DBT发酵产物对肉鸡十二指肠黏膜组织结构的影响见表6。由表6可知，在21d，与对照组和未发酵组相比较，1.0％和2.0％发酵组的肉鸡十二指肠黏膜的绒毛高度有所增加，且隐窝深度相对降低，同时，绒毛高度/隐窝深度比值增加，此外，未发酵组与对照组相比，各指标也表现出相同的变化趋势，但各组之间无显著性差异(P>0.05)。
在42d，各试验组与对照组相比，绒毛高度都有所增加，且发酵组高于未发酵组，但各组之间差异不显著(P>0.05)。各试验组的隐窝深度与对照组相比都有所下降，且发酵组低于未发酵组，其中，1.0％发酵组显著降低了6.74％(P<0.05)，其他各组之间无差异性显著。1.0％发酵组的绒毛高度/隐窝深度比值比对照组和未发酵组分别提高了14.72％(P<0.05)和11.32％(P<0.05)。2.0％发酵组与对照组相比也显著提高了10.71％(P<0.05)，其他各组之间差异不显著(P>0.05)。
表6 DBT发酵产物对肉鸡十二指肠黏膜结构的影响
Figure BDA0002234427310000191
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种提高肉鸡生产性能的中药发酵饲料添加剂的制备方法，其特征在于：步骤如下：
(1)当归补血汤药粉的制备：将黄芪和当归按照5：1的重量比混合并粉碎，得到当归补血汤药粉；作为优选，粉碎后过60目筛；
(2)发酵培养基的制备：0.5％-2％无水葡萄糖，0.5％-2％蛋白胨，0.3％酵母浸出粉，0.05％磷酸氢二钾，0.07％无水硫酸镁，0.02％碳酸钙，6％步骤(1)制备的当归补血汤药粉，100ml去离子水，初始pH为7.2；以上百分比为重量百分比；
(3)枯草芽孢杆菌的活化及种子液的制备；
(4)发酵：将步骤(3)得到的种子液接种到步骤(2)制备的发酵培养基中，在37℃下摇床发酵培养，接种量为1％-9％，发酵时间为24h-72h。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(2)中，所述无水葡萄糖的浓度为0.5％-1.0％；作为优选，所述无水葡萄糖的浓度为0.95％。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(2)中，所述蛋白胨的浓度为0.5％～1.5％。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(2)中，所述蛋白胨的浓度为1.52％。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(3)中，所述种子液中枯草芽孢杆菌的浓度为3.6×108CFU/ml。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(4)中，所述接种量为2.9％-3％；作为优选，所述接种量为2.92％。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(4)中，所述发酵时间为35h-36h；作为优选，所述发酵时间为35.8h。
8.一种中药发酵饲料添加剂，其是应用权利要求1-7任一种方法制备得到的。
9.权利要求8所述的中药发酵饲料添加剂在制备提高肉鸡生产性能、免疫能力、抗氧化能力和/或改善小肠黏膜结构的饲料添加剂中的应用；
作为优选，所述提高肉鸡生产性能为提高肉鸡日增重，提高肉鸡日采食量和降低肉鸡料肉比；提高肉鸡免疫能力为提高血清中新城疫抗体效价、IL-2、IL-6、INF-γ、TNF-α的含量，提高肉鸡抗氧化能力为提高血清中超氧歧化物歧化酶、总抗氧化能力谷胱和甘肽过氧化物的含量，降低丙二醛的含量；改善小肠黏膜结构为提高肉鸡十二指肠黏膜的绒毛高度和绒毛高度/隐窝深度比值，降低隐窝深度。
10.一种饲料，其特征在于：所述饲料包括重量百分比为0.5％-2.0％的权利要求8所述的中药发酵饲料添加剂；
作为优选，所述饲料包括重量百分比为1.0％-2.0％的权利要求8所述的中药发酵饲料添加剂。
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