CN110702494B - 一种三苯甲烷染料及其代谢产物高选择性固相微萃取探针的制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种三苯甲烷染料及其代谢产物高选择性固相微萃取探针，包括带有尖端的金属基质和通过化学键合的方式涂覆到基质上的涂层材料，制备方法包括以下步骤：首先通过氧化和羟基化对金属基质的表面进行预处理，使其带有丰富的羟基，然后将涂层材料与预处理过的基质通过硅烷化和磺化反应获得；制备方法简单，重现性好，将AMS与SPME技术联用，能够大大的提高检测灵敏度、降低复杂基体的基质效应，同时又能实现复杂生物样品的直接、快速的分析。

Description

一种三苯甲烷染料及其代谢产物高选择性固相微萃取探针的 制备方法与应用

技术领域：

本发明涉及微萃取电喷雾探针，具体涉及一种三苯甲烷染料及其代谢产物高选择性固相微萃取探针的制备方法与应用。

背景技术：

三苯甲烷(Triphenylmethane，TPM)染料是纺织品、纸张、药品和食品染色中最常用的合成着色剂之一。然而，这类染料具有持久性、生物毒性和生物蓄积性等持久性有机污染物的典型特征，因此不允许将其非法用于食用动物。但由于它们是有效而价廉的抗真菌和抗寄生虫类药物，因此被继续在水产养殖中非法使用。当这些TPM染料及其隐色代谢物进入到有机生物体时，最容易在体内的血清、肝脏、肾脏、肌肉、受精卵等生物组织中积累，具有致畸、致癌和致突变的潜能。因此，监测TPM染料及其代谢产物在个体生物体中的残留具有重要意义，也是必不可少的工作。

近年来，常压敞开质谱(Ambient mass spectrometry,AMS)已成为分析化学的新兴领域，它为我们提供了在敞开的常压条件下对复杂样品进行体内、原位和微观分析的机会。而固相微萃取(solid-phase microextraction，SPME)是集采样、萃取和浓缩于一体的前处理技术，一般是将具有吸附萃取功能的涂层材料固载在一定的基质表面，与样品进行直接或间接的接触，将目标分析物富集浓缩，然后进行解吸，从而达到对样品中的目标物进行分析的目的。现有技术公开的可直接用于生物体内痕量三苯甲烷染料及其代谢产物原位、微观分析的高选择性固相微萃取探针很少。

发明内容：

本发明的目的是提供一种可直接用于生物体内痕量三苯甲烷染料及其代谢产物原位、微观分析的三苯甲烷染料及其代谢产物高选择性固相微萃取探针及其制备方法与应用，制备方法简单，重现性好，将AMS与SPME技术联用，能够大大的提高检测灵敏度、降低复杂基体的基质效应，同时又能实现复杂生物样品的直接、快速的分析。

本发明是通过以下技术方案予以实现的：

一种三苯甲烷染料及其代谢产物高选择性固相微萃取探针，包括带有尖端的金属基质和通过化学键合的方式涂覆到基质上的涂层材料，其制备方法包括以下步骤：首先通过氧化和羟基化对金属基质的表面进行预处理，使其带有丰富的羟基，然后将涂层材料与预处理过的基质通过硅烷化和磺化反应获得；

具体步骤如下：

1)将金属基质浸入到含有高锰酸钾和重铬酸钾的硫酸溶液中，加热回流1～5d，然后放入氢氧化钠溶液中加热回流1～5d，用甲醇清洗，氮气吹干；

2)再放入到含有三甲氧基(4-乙烯基苯基)硅烷的无水DMF中，无水条件下加热回流1～24h，反应结束后用甲醇清洗，接着放入到含有焦亚硫酸钠的溶液中，恒温反应12～48h,最后再用甲醇清洗，氮气吹干，得到修饰好的SPME探针。

其中，金属基质以金属钨更优，尖端直径在0.05～0.15μm范围。

所述三苯甲烷染料包括孔雀石绿(MG)、结晶紫(CV)，其代谢产物分别对应为隐色孔雀石绿(LMG)、隐色结晶紫(LCV)。

步骤1)中，高锰酸钾的浓度优选为20～50mg/mL，重铬酸钾的浓度优选为10～30mg/mL，硫酸的浓度优选为20～50wt％。

所述的焦亚硫酸钠的溶液，其pH值优选为6.5。

由硅烷化试剂先在预处理后的带有丰富羟基的金属基质表面进行硅烷化引入苯环和双键，再经过焦亚硫酸钠与双键的磺化反应将带负电的磺酸基团键合在探针上，从而形成一种新型SPME探针，该探针表面含有丰富的作用位点，包括磺酸基和苯环结构，其中磺酸基，由于静电相互作用能选择性地吸附带正电荷的目标分析物；此外，探针表面还含有苯环结构，与目标分析物之间的π-π堆积相互作用又进一步提高了富集效率。总之该探针可有效地选择性吸附目标物，提高检测灵敏度，可应用于复杂基质中三苯甲烷类染料及其代谢物的高选择性和高富集能力萃取，可以有效地抑制基体干扰，提高检测灵敏度。

本发明还保护所述三苯甲烷染料及其代谢产物高选择性固相微萃取探针的应用，用于生物体内痕量三苯甲烷染料及其代谢产物原位、微观分析，在常压敞开的条件下，直接对探针中富集的化合物进行电喷雾质谱分析，实现了固相微萃取与常压敞开式质谱的联用。

所述的固相微萃取探针对样品中的目标物进行萃取富集后，直接进行微萃取探针电喷雾离子源-质谱分析。所述的固相微萃取探针尖端对准质谱入口并距离质谱入口处3-8mm的支架，在微萃取探针上施加2.0-4.0KV的高压电场进行电喷雾离子源-质谱分析。

本发明的有益效果如下：

1)本发明固相微萃取探针(SPME探针)可应用于复杂的生物样品中三苯甲烷染料及其代谢物的高选择性和高富集能力萃取，该探针表面含有丰富的作用位点，可以有效地抑制基体干扰，提高检测灵敏度。

2)本发明的SPME探针制备条件相对温和、操作简便，重现性和稳定性较好。

(3)本发明的SPME探针具有微米级的大小，可直接用于活体的原位分析，并可在常压敞开的条件下，直接对探针中富集的化合物进行电喷雾质谱分析，并实现了固相微萃取与常压敞开式质谱的联用。

附图说明：

图1是本发明的实施例1中的SPME探针的制备过程及SPME探针纳升电喷雾离子化质谱分析示意图。

图2是未经修饰的钨针基质(a,b)以及本发明实施例1的SPME探针(c,d)的扫描电镜图。

图3是实施例1得到的SPME探针实验条件的考察结果，(a)萃取时间；(b)解吸溶剂的种类。

图4是MG(a))、LMG(b))、CV(c))和LCV(d))的生物积累动力学曲线图，通过分析不同暴露时间的单个斑马鱼得到(不同符号表示不同时间点检测到的斑马鱼体内目标物的浓度，黑线为每6个样本生物积累趋势的平均曲线)。

图5是暴露在40ng mL^-1的MG和CV中24h的斑马鱼不同部位的目标物含量情况。

具体实施方式：

以下是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

实施例1：

一种新型SPME探针，由以下步骤制得：

(1)先用含有30mg mL-1高锰酸钾和15mg mL-1重铬酸钾的30％(wt/wt)硫酸溶液与钨针在90℃的条件下回流5天，然后用氢氧化钠溶液与钨针在90℃的条件下回流5天，再用甲醇清洗，常温下氮气吹干；

(2)将(1)中处理好的钨针置于双颈烧瓶中，加入50mL无水N,N-二甲基甲酰胺和2.5mL三甲氧基(4-乙烯基苯基)硅烷，通入氮气，加热至120℃回流反应12h。反应完成后，将表面键合了硅烷化试剂的钨针用甲醇反复清洗三遍，常温下氮气吹干；

(3)将(2)中吹干的钨针置于3M的焦亚硫酸钠溶液中(氢氧化钠调整pH为6.5)，常温下氮气保护中反应24h，反应完成后，将表面键合了硅烷化试剂的钨针用甲醇反复清洗三遍，常温下氮气吹干，得到一种新型SPME探针。其扫描电镜图如图2所示，图2显示了未经修饰的钨针基质以及本发明的SPME探针的扫描电镜图，图中可以清楚地显示，在200×的放大倍数下，未修饰的钨针基质表面光滑(图2中a))；而本发明的SPME探针表面粗糙不平(图2中c))。在20000×的放大倍数下，可显示出更为清晰的平面结构。未修饰的钨针基质表面平整(图2中b))；而本发明的SPME探针表面显著不同于前者，其表面形成了许多类似于小山丘的突起结构(图2中d))，这种结构提供了更多的吸附比表面积,也很好的证明了涂层材料成功的修饰到了基质上。

实施例2：

实施例1制得的SPME探针实验条件研究。

首先考察了10、20、40、60、120、180、300s等一系列萃取时间。从图3中a)可以看出，随着提取时间的增加，信号强度逐渐增大，直到60s以上达到一个平台，较长的提取时间并没有明显增加信号强度。另一方面，由于后续要进行活体分析，萃取时间也不宜过长，所以60s被作为最佳萃取时间。

本发明同时研究了多种脱附溶剂的萃取结果(图3中b))，包括甲醇、乙腈、甲醇/水(v/v＝1:1)和乙腈/水(v/v＝1:1)，从图中可以看出，当脱附溶剂为甲醇的时候，信号强度最好，最终选择甲醇为脱附溶剂。

实施例3：

在实施例2确定的最优的实验条件下，探究了实施例1制备的SPME探针的萃取性能和定量能力，具体包括以下步骤：

将两克匀质化的鱼肉转移到一个干净的10毫升玻璃管中，然后加入2毫升去离子水，混匀10分钟。99μL的鱼肉加入1μL的MG、CV、LMG和LCV标准溶液(甲醇/水小于1:9,v/v),形成一系列浓度在0.1、0.5、1、5和10ng mL^-1的标准样品。

将氘代孔雀石绿(简记为d₅-MG)、氘代结晶紫(简记为d₆-CV)、氘代隐色孔雀石绿简记为(d₆-LMG)和氘代隐色孔雀石绿(简记为d₆-LCV)添加到喷雾溶剂中，作为1ng mL^-1浓度水平下的同位素内标化合物。内标化合物用于分析过程的误差校准，可以大大地提高方法的重现性。

结果表明，本发明方法具有良好的线性关系，相关系数(r²)不低于0.9925(表1)。最低检出限和定量限分别为0.014–0.023ng mL^-1和0.046–0.077ng mL^-1(由信噪比为3和10时出峰的浓度确定)。

在重复性实验中，单根探针6次重复萃取实验，在同样条件下萃取添加了1ng mL^{- 1}MG、CV、LMG和LCV的鱼肉样品，结果表明RSD小于9.1％。从实验结果可知，该微萃取探针可重复多次使用，具有良好的重复性和稳定性。

发明人同时研究了不同探针之间的可重现性实验，以同样的发明方法制备6根不同的微萃取探针，该实验结果也显示了良好的重现性，RSDs不高于13.9％。回收率试验显示该方法具有良好的准确性，回收率达到89.3-111.1％。

这些结果显示了本发明的SPME探针电喷雾质谱法可以适用于痕量水平MG、CV、LMG和LCV的直接定量检测。

表1

^a匀质化鱼肉中加入1ng mL^-1的MG,CV,LMG和LCV。

实施例4

利用上述实施例中的SPME探针纳升电喷雾质谱法探究TPM染料(MG和CV)在斑马鱼体内的生物富集动力学情况。

利用表面涂覆SPME探针的微米级探针尖端，通过分析不同暴露时间的单个斑马鱼，成功地研究了TPM染料在斑马鱼体内的生物积累动力学。在每一个时间点，通过对斑马鱼背部肌肉取样，对6条单独的斑马鱼进行平行分析。图4中a)、b)、c)和d)分别是MG、LMG、CV和LCV的生物积累动力学曲线图，从图中可以看出MG和CV的生物积累动力学曲线非常相似，而LMG跟LCV是相似的。也证明了MG和CV会在生物体内转换成它们的隐色代谢产物LMG和LCV。

实施例5

采用上述实施例中的SPME探针纳升电喷雾质谱法探究了暴露在40ng mL^-1的MG和CV中24h的斑马鱼不同部位的MG、CV及其代谢产物的含量情况。

如图5所示，所研究的TPM染料和代谢物的浓度在肠道中最高，其次是卵巢，在心脏中也能检测到。这说明TPM染料和代谢物更容易富集在这些组织中，进而诱发这些组织病变。这一现象与之前报道的MG会损坏生殖腺和抑制心跳速率相吻合。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种三苯甲烷染料及其代谢产物高选择性固相微萃取探针，所述三苯甲烷染料包括孔雀石绿、结晶紫，其代谢产物分别对应为隐色孔雀石绿、隐色结晶紫，其特征在于，包括带有尖端的金属基质和通过化学键合的方式涂覆到基质上的涂层材料，其制备方法包括以下步骤：

1)将金属基质浸入到含有高锰酸钾和重铬酸钾的硫酸溶液中，加热回流1～5d，然后放入氢氧化钠溶液中加热回流1～5d，用甲醇清洗，氮气吹干；

2)再放入到含有三甲氧基(4-乙烯基苯基)硅烷的无水DMF中，无水条件下加热回流1～24h，反应结束后用甲醇清洗，接着放入到含有焦亚硫酸钠的溶液中，恒温反应12～48h,最后再用甲醇清洗，氮气吹干，得到修饰好的SPME探针。

2.根据权利要求1所述的三苯甲烷染料及其代谢产物高选择性固相微萃取探针，其特征在于，金属基质为金属钨，尖端直径在0.05～0.15μm范围。

3.根据权利要求1或2所述的三苯甲烷染料及其代谢产物高选择性固相微萃取探针，其特征在于，步骤1)中，高锰酸钾的浓度为20～50mg/mL，重铬酸钾的浓度为10～30mg/mL，硫酸的浓度为20～50wt％。

4.根据权利要求1或2所述的三苯甲烷染料及其代谢产物高选择性固相微萃取探针，其特征在于，所述的焦亚硫酸钠的溶液，pH值为6.5。

5.权利要求1-4中任意一项权利要求所述三苯甲烷染料及其代谢产物高选择性固相微萃取探针的应用，其特征在于，用于生物体内痕量三苯甲烷染料及其代谢产物原位、微观分析，在常压敞开的条件下，直接对探针中富集的化合物进行电喷雾质谱分析；所述三苯甲烷染料包括孔雀石绿、结晶紫，其代谢产物分别对应为隐色孔雀石绿、隐色结晶紫。

6.根据权利要求5所述的三苯甲烷染料及其代谢产物高选择性固相微萃取探针的应用，其特征在于，所述固相微萃取探针对样品中的目标物进行萃取富集后，直接进行固相微萃取探针电喷雾离子源-质谱分析。

7.根据权利要求6所述的三苯甲烷染料及其代谢产物高选择性固相微萃取探针的应用，其特征在于，所述的固相微萃取探针尖端对准质谱入口并固定于距离质谱入口处3-8mm的支架上，在固相微萃取探针上施加2.0-4.0KV的高压电场进行电喷雾离子源-质谱分析。

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