CN110699477A - 用于区分毛橘红和光橘红原料植物的分子标记及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用于区分毛橘红和光橘红原料植物的分子标记,所述分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示,所述分子标记位于编码类黄酮3’‑羟化酶的基因上游0‑1kb处。本发明还提供了上述分子标记的应用以及区分毛橘红和光橘红原料植物的方法。本发明提供的分子标记不受果树生长阶段的限制,并且通过分子标记的方法进行检测准确可靠,操作方便。
Description
技术领域
本发明涉及分子标记及其应用,具体涉及一种用于区分毛橘红和光橘红原料植物的分子标记及应用。
背景技术
化州柚(Citrus grandis Osbeck var.tomentosa Hort.)为芸香科柑橘属柚类变种(中药大辞典),主产于广东省化州市,是道地中药材“化橘红”的原料植物。化橘红原材料品种复杂,可分为毛橘红和光橘红,毛橘红主要包括来自于正毛、副毛和假西洋等多个化州柚种质的果实,光橘红则主要来自于包括光青、琯溪蜜柚、沙田柚等普通柚种质的果实。市场上,化州柚是生产毛橘红的原料果实,毛橘红果肉酸苦不能鲜食,而大多数普通柚成熟果肉具有良好食用价值。化州柚以未成熟或近成熟干燥果皮(黄皮层和白皮层)入药,具有良好的祛痰止咳功效。
前人研究发现,化州柚果实黄皮层中含有丰富的类黄酮、多糖化合物和挥发性油,其主要药理成分为类黄酮且以柚皮苷含量最高,类黄酮含量比较分析表明,其中正毛、副毛和假西洋均属于化州柚,以正毛为首的毛橘红原料果实中类黄酮含量显著高于光橘红。因此,目前广东、广西一带新兴大规模化橘红产业园主要种植正毛等化州柚。但是,市场上橘红鲜果收购并没有统一标准,果实收购季节,果农多以普通柚果实掺入化州柚果实一同售卖,但普通柚的掺入会极大降低化橘红成品的药用价值。采摘后的鲜果在果皮受损时,很难直观分辨化橘红和光橘红,这对于标准化和高品质化的化橘红成品生产是一种极大的挑战。
近年来许多学者对多种化橘红原料植物种质资源进行分型分析,但除了毛橘红原料植物果实的类黄酮含量显著高于光橘红外,还未有分子标记可以明显区别毛橘红和光橘红的原料植物。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种可以明显区分毛橘红和光橘红原料植物的分子标记。
发明人在研究柑橘类黄酮代谢途径相关基因功能时发现,大多数基因从序列上无法区分毛橘红和光橘红原料植物,但是在扩增类黄酮3’-羟化酶基因及其启动子序列时发现,化州柚一条序列的启动子相较于普通柚有一段序列插入,而另一条序列的启动子与普通柚序列一致。可以开发针对类黄酮3’-羟化酶基因的启动子的分子标记,用以区分毛橘红和光橘红的原料植物。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下:
第一方面,本发明提供了一种用于区分毛橘红和光橘红原料植物的分子标记,所述分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示,所述分子标记位于编码类黄酮3’-羟化酶的基因上游0-1kb处。
第二方面,本发明提供了一种用于检测上述分子标记的引物对,引物序列可以根据分子标记前后的序列进行设计,需要满足既能同时扩增毛橘红和光橘红原料植物的类黄酮3’-羟化酶基因启动子序列,又能从扩增的序列长度上将毛橘红和光橘红的原料植物进行区分,本发明提供的所述引物对分别具有SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列。
第三方面,本发明提供了检测上述分子标记的试剂盒,所述试剂盒包含上述引物对,还可以包括Taq酶、dNTPs。
第四方面,本发明提供了上述分子标记在区分毛橘红和光橘红原料植物中的应用。
第五方面,本发明提供了上述引物对在区分毛橘红和光橘红原料植物中的应用。
第六方面,本发明提供了上述试剂盒在区分毛橘红和光橘红原料植物中的应用。
第七方面,本发明提供了一种区分毛橘红和光橘红原料植物的方法,步骤为:检测待测植物体的编码类黄酮3’-羟化酶的基因的上游0-1kb处是否存在SEQ ID NO:1所示序列,当其中一条染色体上编码类黄酮3’-羟化酶的基因的上游存在SEQ ID NO:1所示序列时,待测植物体的植株为毛橘红的原料植物,即为化州柚,当类黄酮3’-羟化酶基因所在的两条染色体上编码类黄酮3’-羟化酶的基因的上游均不存在SEQ ID NO:1所示序列时,待测植物体的植株为光橘红的原料植物。
进一步,所述待测植物体为毛橘红或光橘红原料植物的根、茎、叶、花、果皮、种子或者愈伤组织。
进一步,具体方法为:
S1、从待测植物体中提取基因组DNA;
S2、利用分别具有SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列的引物对对基因组DNA进行PCR扩增并检测扩增片段的长度,当同时扩增出568bp和524bp长度的扩增片段时,所述待测植物体的植株为毛橘红的原料植物,当只能扩增出524bp长度的扩增片段时,所述待测植物体的植株为光橘红的原料植物。
本发明的用于区分毛橘红和光橘红原料植物的分子标记及其应用具有如下优点:
(1)本发明提供的区分毛橘红和光橘红原料植物的分子标记不受果树生长阶段的限制,可用于毛橘红和光橘红原料植物的早期筛选、区分及鉴定,进而能够实现短时间、低成本、高准确性地区分毛橘红和光橘红原料植物;
(2)检测分子标记的方法,准确可靠,操作方便。
附图说明
图1为本发明17种柚类基因组用引物对进行扩增后扩增条带的凝胶电泳结果;
具体实施方式
以下结合附图及具体实施例对本发明的原理和特征进行描述,所举实例只用于解释本发明,并非用于限定本发明的范围。
下述实施例中的实验方法,如无特殊说明,均为常规方法,如分子克隆实验手册,或按照生化试剂制造厂商的说明书建议的条件。下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径获得。
1、区分毛橘红和光橘红原料植物的分子标记的鉴定
发明人在研究柑橘类黄酮代谢途径相关基因功能时发现,大多数基因从序列上无法区分毛橘红的原料植物(化州柚)和光橘红的原料植物(除化州柚外的其他普通柚),但是在扩增类黄酮3’-羟化酶基因及其启动子序列时发现,毛橘红原料植物(化州柚)一条序列的启动子相较于光橘红的原料植物(除化州柚外的其他普通柚)有一段序列插入,而另一条序列的启动子与光橘红原料植物序列一致。该插入序列位于类黄酮3’-羟化酶基因起始密码子上游第208bp处,核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示:
tttgctatgttacatacagagtctgtaacacagcaagctcccca(SEQ ID NO:1),
当其中一条染色体上编码类黄酮3’-羟化酶的基因的上游存在SEQ ID NO:1所示序列时,待测植物体的植株为毛橘红的原料植物,即化州柚,当类黄酮3’-羟化酶基因所在的两条染色体上编码类黄酮3’-羟化酶的基因的上游均不存在SEQ ID NO:1所示序列时,待测植物体的植株为光橘红的原料植物。
2、利用分子标记对毛橘红和光橘红原料植物进行区分
设计引物对类黄酮3’-羟化酶基因启动子区包含上述分子标记的片段进行扩增,引物设计需要满足既能同时扩增毛橘红和光橘红原料植物的类黄酮3’-羟化酶基因启动子区域,又能够从扩增序列长度上对毛橘红和光橘红原料植物进行区分。本实施例中的正向引物为5’-gagaaagaaacgattgtcacgga-3’(SEQ ID NO:2),反向引物为5’-aggggctgcttggagtgttatat-3’(SEQ ID NO:3)。
准备待测植物体,待测植物体可以选择毛橘红或光橘红原料植物的根、茎、叶、花、果皮、种子,或者愈伤组织,本实施例中以植物的幼嫩叶片为待测植物体,具体步骤如下:
1)取植株的幼嫩叶片,立即进行液氮冷冻,并保存在-80℃备用,从植株的幼嫩叶片中提取基因组DNA,本步骤采用新型植物DNA提取试剂盒(DN-Plant DNAMini Kit;Aidlab,China);
2)以上述基因组DNA为模板,SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示的序列为引物对,进行PCR扩增含有目的序列的片段,PCR反应条件为:95℃预变性5min;95℃变性30s,57℃退火30s,72℃延伸30s,35个循环;72℃延伸10min;12℃30min。
3)回收扩增产物,并进行凝胶电泳检测,如果同时扩增出568bp和524bp长度的扩增片段时,所述待测植物体的植株为毛橘红原料植物,即化州柚,当只能扩增出524bp长度的扩增片段时,所述待测植物体的植株为光橘红的原料植物。
其中524bp的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示:
gagaaagaaacgattgtcacggagttaacttcaattacttatcaattctagttagttttttaaaacatggagtaattaggtaggaaaattatgaataaattaaatcctgagttataatttcctaaatgtgtcaaaatctcgaaaaatcaaaataagagagaacatgcatatacaagtaaaggacaaggctacattgcagactccgtatgtaacagcacagtgcaaagtggccttgtatcagctgagttccaatagcttttcctctctcctgcaacgcgtggatgctccccaagtaaattaaacgacaaaaagagtgatccaaatatttacactctttttctttaaaagaacaatagctctctacacattacactcgttacctaacattcaatttcaaaatcactcgttagctcgtagcaagcgtaaccaccacgaacgagctagtcgcagcaaccatgcaggtaggggtgtacgtgtaagtacgtaaccacctttctatatatataacactccaagcagcccct(SEQ ID NO:4)
568bp的核苷酸列如SEQ ID NO:5所示:
gagaaagaaacgattgtcacggagttaacttcaattacttatcaattctagttagttttttaaaacatggagtaattaggtaggaaaattatgaataaattaaatcctgagttataatttcctaaatgtgtcaaaatctcgaaaaatcaaaataagagagaacatgcatatacaagtaaaggacaaggctacattgcagactccgtatgtaacagcacagtgcaaagtggccttgtatcagctgagttccaatagcttttcctctctcctgcaacgcgtggatgctccccatttgctatgttacatacagagtctgtaacacagcaagctccccaagtaaattaaacgacaaaaagagtgatccaaatatttacactctttttctttaaaagaacaatagctctctacacattacactcgttacctaacattcaatttcaaaatcactcgttagctcgtagcaagcgtaaccaccacgaacgagctagtcgcagcaaccatgcaggtaggggtgtacgtgtaagtacgtaaccacctttctatatatataacactccaagcagcccct(SEQ ID NO:5)
用上述方法检测了17种柚类,17种柚类的品种名、分类以及编号如下表所示:
结果如图1所示,3种毛橘红原料植物均扩增出两条条带,一条为568bp,另一条为524bp,而14种光橘红颜料之外均只扩增出一条524bp的条带,该特异性扩增能完全区分毛橘红和光橘红原料植物,利用本发明的分子标记可以对毛橘红和光橘红原料植物进行区分,准确可靠,操作方便,并且本发明提供的分子标记不受果树生长阶段的限制,可用于毛橘红和光橘红原料植物的早期区分,进而实现短时间、低成本、高准确性地区分毛橘红和光橘红原料植物。
以上所述仅为本发明的较佳实施例,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种用于区分毛橘红和光橘红原料植物的分子标记,其特征在于,所述分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示,所述分子标记位于编码类黄酮3’-羟化酶的基因上游0-1kb处。
2.一种用于检测权利要求1所述的分子标记的引物对,其特征在于,所述引物对分别具有SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列。
3.一种用于检测权利要求1所述的分子标记的试剂盒,其特征在于,包含权利要求2所述的引物对。
4.权利要求1所述的分子标记在区分毛橘红和光橘红原料植物中的应用。
5.权利要求2所述的引物对在区分毛橘红和光橘红原料植物中的应用。
6.权利要求3所述的试剂盒在区分毛橘红和光橘红原料植物中的应用。
7.一种区分毛橘红和光橘红原料植物的方法,其特征在于,检测待测植物体的编码类黄酮3’-羟化酶的基因的上游0-1kb处是否存在SEQ ID NO:1所示序列,当其中一条染色体上编码类黄酮3’-羟化酶的基因的上游存在SEQ ID NO:1所示序列时,待测植物体的植株为毛橘红原料植物,当类黄酮3’-羟化酶基因所在的两条染色体上编码类黄酮3’-羟化酶的基因的上游均不存在SEQ ID NO:1所示序列时,待测植物体的植株为光橘红原料植物。
8.根据权利要求7所述的方法,其特征在于,所述待测植物体为毛橘红或光橘红原料植物的根、茎、叶、花、果皮、种子或者愈伤组织。
9.根据权利要求7或8所述的方法,其特征在于,具体步骤如下:
S1、从待测植物体中提取基因组DNA;
S2、利用分别具有SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列的引物对对基因组DNA进行PCR扩增并检测扩增片段的长度,当同时扩增出568bp和524bp长度的扩增片段时,所述待测植物体的植株为毛橘红原料植物,当只能扩增出524bp长度的扩增片段时,所述待测植物体的植株为光橘红原料植物。
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