CN110680961B - 一种复层螺旋尿道组织工程支架的制备方法 - Google Patents

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Abstract

一种复层螺旋尿道组织工程支架的制备方法，以热塑性可降解聚合物为打印原料，采用熔融沉积型3D打印机制备带有镂空花纹的矩形长条胚体，并螺旋卷曲后得到胚体螺旋管，经热处理、嵌套后得到由内外层胚体螺旋管组成的双层支架，并用聚乳酸缝合线将双层支架一端缝合，在外层胚体螺旋管内壁上依序内衬培养时转染了血管内皮生长因子和成纤维细胞生长因子的内皮细胞片层、尿路上皮细胞片层以及培养时转染了人血小板生长因子的平滑肌细胞片层，并填充细胞外基质，再缝合双层支架的另一端，经凝血酶固定后即可得尿道组织工程支架。本发明制备得到的支架能够保持尿道通畅，有利于愈合受损伤的尿道组织，及时实现尿道支架的血管化并能快速实现血运重建。

Description

一种复层螺旋尿道组织工程支架的制备方法
技术领域
本发明属于生物医疗器械领域，具体涉及一种用于治疗尿道缺损等尿道疾病组织工程尿道支架的制备技术。
发明背景
现有尿道支架制备方式的缺陷在于：利用聚合物薄膜卷曲成的支架虽然易于制造且具有较高的顺应性，但在降解过程中容易产生突然崩解的现象，形成较大的碎片，容易造成尿道堵塞，妨碍尿道进行正常的生理活动；另外单纯依靠螺旋支架的自扩张性，扩张速率相对缓慢，存在着支架植入后脱位的可能。编织成型的支架的制备过程缓慢，效率不高，费时且缺乏对支架结构的精确控制；顺应性不足抗弯强度较高，在支架在植入之后患者的异物感强烈。采用如心血管冠脉支架的激光雕刻技术在支架表面雕刻镂空的花纹可以达到增加支架的自膨胀性，但是该技术的成本较高。用传统的支架制造方法可重复性差，并且限制了支架结构设计的改进。
尿道缺损常见病例为小儿尿道下裂，尿道下裂最佳手术治疗时间段为6-18月大，此时小儿尿道直径较细小，常在4.0-7.0mm之间。XYZ三轴熔融沉积型3D打印机在Z轴方向堆积时受到仪器本身精度的限制，达不到长而细且精密的支架的结构要求，此外通过直接Z轴方向堆积打印出来的支架存在支架壁厚较厚的情况，壁厚较大时会存在支架较硬而缺乏顺应性和径向的弹性，无法满足支架的相关力学性能要求，同时在Z轴方向直接堆叠时不能满足支架在成型过程中温度条件的一致性。另外，在治疗长短尿道缺损时需要满足人体生理构造特征，支架需要具备一定的顺应性能才不致介入人体内的异物感。针对这一缺陷的改进，目前比较先进的3D打印快速成型技术如中国专利CN 102149859A中所述的支架采用3D4轴快速成型系统制备出的支架虽然打印出来的支架顺应性可观，但是由于打印过程速度较快，高分子材料冷却速率快导致支架整体脆性较大，径向支撑力不足，难以维持尿道的畅通性。另外其对设备的要求较XYZ 3D打印系统精度要求高，以及支架直径的变换困难；设备成本的提高也增加了支架的整体成本。此外，如文献1所述采用紫外光固化成型(SLA)联立连续液态界面生产(CLIP)技术虽可实现超细血管支架的制备，但该制备手段对需要使用精密的仪器；除此之外，SLA制造方式的原材料为光敏树脂，其在形成体型结构达到固化的目的时，固化的树脂材料应用于人体内后的降解机制不再是类聚乳酸一类的线性材料的降解机制，其降解机制为体型高分子材料典型的吸水溶胀的机制，存在着植入人体后的诱发安全隐患的风险(见非专利文献1)。
利用快速成型技术在生产过程中，以聚乳酸材料为例为例，其从高温打印机喷头中流出并沉积在打印机的热床表面，骤降的温度接近于或低于聚乳酸的玻璃化转变温度(Tg)，在该Tg值以下，高分子链运动困难，分子链的链段单元被冻结，难以形成规整排列。导致打印成品在室温下基本上呈现玻璃态，其强度低，脆性大，无法满足支架的力学性能要求。
单纯地将携带有细胞植入生物体内缺损部位附近容易存在因营养物质供应不足而导致细胞死亡的问题。当三维组织的厚度达到一定的水平(＞1cm)时，营养物质和氧气的输送以及废物的排出将直接影响组织内细胞的存活和生理功能的实现，故细胞不能在较厚且不连通的组织或者器官内存活以及增殖。
由于上述原因，一种可重复性高，效率高，低成本，支架弹性，径向支撑力，顺应性良好的管状支架的制备方法亟待提出。同时针对不同的人体腔道环境的支架尺寸需要灵活调控；以及联合尿道组织工程技术并植入人体后尽快实现血运重建也是现有技术的难点。
发明内容
本发明提供一种能够保持尿道通畅、有利于愈合受损伤的尿道组织、及时实现尿道支架的血管化并能快速实现血运重建的复层螺旋尿道组织工程支架及其的制备方法。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：
一种复层螺旋尿道组织工程支架的制备方法，
步骤1以热塑性可降解聚合物为打印原料，采用熔融沉积型3D打印机制备带有镂空花纹的矩形长条胚体，
步骤2分别对矩形长条胚体进行螺旋卷曲后得到内径匹配并可同轴嵌套的成对胚体螺旋管，对胚体螺旋管进行热处理、嵌套后得到由内外层胚体螺旋管组成的双层支架，并用聚乳酸缝合线将双层支架一端缝合，
步骤3在外层胚体螺旋管内壁上依序内衬培养时转染了血管内皮生长因子和成纤维细胞生长因子的内皮细胞片层、尿路上皮细胞片层以及培养时转染了人血小板生长因子的平滑肌细胞片层，并填充细胞外基质，再缝合双层支架的另一端，经凝血酶固定5-10分钟后即可得尿道组织工程支架；所述细胞外基质包括作为必要成分的纤维蛋白原、纤维蛋白原和糖胺聚糖所构成的凝胶，且其体积百分比分别为60-80％的纤维蛋白原、10-20％的胶原蛋白和10-20％的糖胺聚糖，凝血酶固定的细胞外基质中的纤维蛋白原迅速纤维化形成纤维蛋白，并构成连通的空间网络结构。
本发明的有益效果如下：
1、将直径匹配的两支架同轴嵌套后构成的夹层有效地将功能尿路细胞组织封锁在支架夹层内，防止了功能细胞在尿流冲击下的脱落；在支撑狭窄尿道，引导尿流的同时发挥了局部治疗损伤尿道组织的作用。将直径匹配的两支架同轴嵌套后构成的夹层有效地将功能尿路细胞组织包覆在支架夹层内；在加入了纤维蛋白原后细胞外基质在凝血酶的作用下迅速纤维化形成纤维蛋白，诱发纤维蛋白原的聚合形成网络结构以将功能尿路细胞组织封锁于支架夹层内，并构成连通的空间网络结构，有效防止了功能细胞在尿流冲击下发生脱落；在支撑狭窄尿道，引导尿流的同时发挥了局部治疗损伤尿道组织的作用。
2、与Z轴竖向(见图8)3D打印堆叠而成支架相比，预制支架侧面样条曲线形的花纹的薄片结构保障了支架在整体成型过程中温度条件的一致性，薄片3D打印无需耗材支撑以实现堆叠高度，最大程度上降低了一个支架成型所需的原料，故显著降低了支架表面覆盖率，其具备如下优点：
(1)降解后产生的残渣较少，有效地避免了尿道堵塞地发生；支架在降解时因其较低的表面覆盖率和低结晶度(Xc＝4.14％，见附图9)导致其本体晶区-非晶区间系带结构松散，使得在尿流环境中支架本体材料更易被水分子侵入而以表面降解机制腐蚀，细小的碎片从支架本体剥离并能及时被尿流冲走排出体外而不致尿道堵塞，无需二次手术取出支架残骸，减轻了病人的生理和精神负担；
(2)降低患者罹受尿路结石的风险；尿道的特殊生理环境使支架表面易形成尿路结石，低表面覆盖率的支架为结石晶体的形核提供的空间减少，减弱了结石形核生长的速率以降低结石发生率；
(3)维持支架结构稳定；支架在热处理时易受热膨胀导致热变形，表面镂空处为支架材料变形提供一定空间以维持表面流线型的花纹结构，不致对尿流造成扰动，减少了相关并发症的发生率；
(4)防止支架移位滑脱；样条曲线状支架杆的变形能力和螺旋结构的纵向伸缩能力二者的协同作用可以达到更好的支架径向弹性，在支架植入尿道后全方位与尿道壁吻合，可有效地防止支架在尿流冲击下发生移位和滑脱。
3、支架夹层内填充了细胞生长所必须的细胞外基质，为尿路细胞的健康生长和增殖提供了良好的生存环境，便于介入材料与原受损尿路组织的融合构成新生组织；功能尿路细胞培养时所接种的利于尿道组织的预血管化的生长因子，大大缩短新植入组织与原尿道壁建立血运联系的时间，而不致尿路组织因无法及时供血和代谢而坏死，极大提高功能尿路细胞修复受损尿道的成功率；可直接移植至受损的尿道中而无需进行活体皮下预埋培养。
4、较分散的细胞植入，本发明采用在复层支架外层的内表面内衬细胞片层的方法能保证功能细胞覆盖均匀性，有效避免了无支架杆部位无法黏附细胞而导致局部组织未及时修复的问题。细胞片层的嵌入使得胞间蛋白与基质得以保留，复层支架与原损伤尿路组织间建立组织联系并发挥修复功能更为快速和均匀，保证了与支架接触的受损尿路组织均得以同步重建。
5、现有的Z轴方向堆叠3D打印技术制备的支架因高度限制导致壁厚较厚，使得支架轴向顺应性差，难以满足弯曲尿道所需的顺应性要求；本发明所述的支架可实现壁薄且具有类弹簧的螺旋结构，在轴向上较传统竖向打印支架的顺应性更优良(见附图10)，易随尿道生理弯曲走形而改变其折弯方向，减轻患者的异物感；且弯曲方向不受限，可适合尿道上任何部位的安放。
6、不同患者对支架的力学性能和几何尺寸要求不同，利用先3D打印带有花纹的矩形长条胚体结构，再螺旋卷曲可实现支架直径以及壁厚尺寸的可控性调整，不受3D打印机仪器精度限制，满足不同人群对支架性能的需求；3D打印的方法避免了原材料浪费及有机溶剂残留，成型时间在5min内，工作效率高，可重复性强。
附图说明
为了更清楚地描述本发明的技术方案，下面将结合附图作简要介绍。附图以样条形的侧面花纹为例，但不意图对支架花纹进行限定。
附图中涉及的附图标记和组成部分如下所示：
001复层尿道支架内层骨架
002复层尿道支架外层骨架
003尿路组织片层及细胞外基质填充层
004线径0.2mm的聚乳酸手术缝合线
图1为复层螺旋尿道组织工程支架的制备工艺流程图。
图2为实施例1中制备的夹层内填充功能尿路细胞片层/细胞外基质后的复层螺旋尿道支架纵截面剖视图。
图3为实施例1中制备的复层螺旋尿道支架横截面图示。
图4为实施例1中制备的螺旋尿道支架矩形长条胚体结构示意图。
图5为实施例1中矩形胚体的螺旋卷曲方式。
图6为实施例1中制备的双层螺旋尿道支架壳体中内层支架抽出结构示意图。
图7为实施例1中制备的未填充尿路组织的双层螺旋尿道支架纵截面剖视图。
图8为Z轴竖向3D打印方向示意图。
图9为3D打印成型并在100℃下热处理20min后支架材料差示扫描量热曲线。
图10为与本发明所述支架和与此支架直径相同的Z轴堆叠支架的轴向顺应性示意图(三点弯曲实验结果)。
具体实施方式
下面结合一些具体实施例(以雄性新西兰大白兔为实验对向)对本发明作进一步的说明，实际不止下列实施例。
实施例1
一种尿道组织工程支架的制备，包括如下步骤：
(1)以聚乳酸-羟基乙酸(PLGA)共聚物为原料(LA∶GA＝75∶25，Mv＝100000)，三维建模后将.stl文件导入熔融沉积型3D打印机并打印出两条表面覆盖率为20％且带有样条曲线花纹的矩形长条胚体；支架壁厚即矩形长条胚体厚度为0.1mm；分别将两个矩形长条胚体螺旋卷曲在直径分别为φ1为3.0mm和φ2为5.6mm的模具上；两端分别用细铜丝固定；再放入120℃的真空干燥箱中退火10min以促进高分子结晶和支架的定型；待冷却后抽取模具即得到不同直径的单层支架，再剪裁成长度为30.0mm的长管。
(2)将等长的且直径匹配的支架同轴嵌套固定后构成双层支架，利用消毒后且线径为为0.2mm的聚乳酸手术缝合线缝合双层支架一端，所得双层支架夹层d为1.2mm，将双层支架进行灭菌处理。
(3)取10g兔皮下脂肪组织，经胰蛋白酶消化后并培养获得脂肪干细胞，当其增殖至70％～80％融合时予以1∶3传代继续培养。
(4)平滑肌细胞的获取：取第4代生长至80％融合的脂肪干细胞，均匀接种于6孔板。向其中加入诱导培养基(DMEM(含各种氨基酸和葡萄糖的培养基)培养液+10％胎牛血清+50ng/ml PDGF-BB(人血小板生长因子))，培养14天获得平滑肌细胞，再将平滑肌细胞移植到温度敏感性培养皿中进行细胞爬片处理，从37℃降温至20℃取下其细胞片层。
(5)脂肪干细胞诱导分化为内皮细胞：将第3代脂肪干细胞种入瓶，24h后，加入内皮细胞诱导液(DMEM(含各种氨基酸和葡萄糖的培养基)+10％FBS(胎牛血清)+50ug/L血管内皮生长因子+10ug/L成纤维细胞生长因子)。细胞80％融合时传代，继续诱导7天获得内皮细胞，再将内皮细胞移植到温度敏感性培养皿中进行细胞爬片处理，从37℃降温至20℃取下其细胞片层。
(6)尿路上皮细胞的获取：使用第三代尿路上皮细胞作为种子细胞。种子细胞悬液均匀接种于培养皿上的6孔板上，37℃，5％CO2条件下培养2周，可得尿路上皮细胞，再将尿路上皮细胞移植到温度敏感性培养皿中进行细胞爬片处理，从37℃降温至20℃取下其细胞片层。
(7)取大块纤维蛋白原按照2％(w/v)比例溶于PBS(磷酸盐缓冲溶液)得纤维蛋白原溶液；取大块胶原蛋白按照5％(w/v)比例溶于PBS中得胶原蛋白溶液；将糖胺聚糖溶解于蒸馏水中，得到5％(w/v)的糖胺聚糖溶液；再将2％(w/v)的纤维蛋白原溶液与5％(w/v)的胶原蛋白及5％(w/v)糖胺聚糖按体积比6∶2∶2(v/v/v)混合，制成必需成分的纤维蛋白原/胶原蛋白/糖胺聚糖凝胶；取层粘连蛋白按照5％(w/v)比例溶于PBS中得层粘连蛋白溶液以得到非必需成分；将必需成分和非必需成分按照3∶2的体积比混合制成细胞外基质水凝胶。
(8)将上述所得的细胞外基质水凝胶与(4)(5)(6)中获得的功能细胞片层内衬于支架夹层中，再利用注射器将细胞外基质水凝胶注入支架夹层内，另一端再用聚乳酸缝合线缝合得到复层支架。
(9)将复合支架浸没于20mL 50IU/mL的凝血酶溶液中，固定时间为5min，在凝血酶的作用下纤维蛋白原聚合成纤维蛋白，将细胞片层/细胞外基质封锁在支架内，用于治疗男性尿道缺损或下裂的3D打印复层组织工程支架。
实施例2
一种尿道组织工程支架的制备，包括如下步骤：
(1)以聚乳酸(分子量100000)为原料，三维建模后将.stl文件导入熔融沉积型3D打印机并打印出两条表面覆盖率为30％且带有样条曲线花纹的矩形长条胚体，支架壁厚即矩形长条胚体的厚度为0.3mm；分别将两个矩形长条胚体螺旋卷曲在直径分别为φ1＝4.0mm和φ2＝6.8mm的模具上；两端分别用细铜丝固定；再放入90℃的真空干燥箱中退火10min并定型；待模具冷却后抽取模具即得到不同直径的单层支架，均剪裁成长度为40.0mm的长管。
(2)将等长的且直径匹配的支架同轴嵌套固定后构成双层支架，利用消毒后且线径为0.2mm的聚乳酸手术缝合线缝合双层支架一端，所得双层同轴支架夹层d为1.1mm，再将双层支架进行灭菌处理。
(3)取10g量兔皮下脂肪组织，经胰蛋白酶消化后并培养获得脂肪干细胞，当其增殖至70％～80％融合时予以1∶3传代继续培养。
(4)平滑肌细胞的获取：取第4代生长至80％融合的脂肪干细胞，均匀接种于6孔板。向其中加入诱导培养基(DMEM(含各种氨基酸和葡萄糖的培养基)培养液+10％胎牛血清+50ng/ml PDGF-BB(人血小板生长因子))，培养14天获得平滑肌细胞，再将平滑肌细胞移植到温度敏感性培养皿中进行细胞爬片处理取下其细胞片层。
(5)脂肪干细胞诱导分化为内皮细胞：将第3代脂肪干细胞种入瓶，24h后，加入内皮细胞诱导液(DMEM(含各种氨基酸和葡萄糖的培养基)+10％FBS(胎牛血清)+50ug/L血管内皮生长因子+10ug/L成纤维细胞生长因子)。细胞80％融合时传代，继续诱导7天获得内皮细胞，再将内皮细胞移植到温度敏感性培养皿中进行细胞爬片处理，从37℃降温至20℃取下其细胞片层。
(6)尿路上皮细胞片层的获取：使用第三代尿路上皮细胞作为种子细胞。将上述种子细胞悬液均匀接种于培养皿上的6孔板上，37℃，5％CO2条件下培养2周，隔天换液，可得尿路上皮细胞，再将尿路上皮细胞移植到温度敏感性培养皿中进行细胞爬片处理，从37℃降温至20℃取下其细胞片层。
(7)取大块纤维蛋白原按照2％(w/v)比例溶于PBS(磷酸盐缓冲溶液)得纤维蛋白原溶液；取大块胶原蛋白按照5％(w/v)比例溶于PBS中得胶原蛋白溶液；将糖胺聚糖溶解于蒸馏水中，得到5％(w/v)的糖胺聚糖溶液；再将2％(w/v)的纤维蛋白原溶液与5％(w/v)的胶原蛋白及5％(w/v)糖胺聚糖按体积比7∶1∶2(v/v/v)混合，制成必需成分的纤维蛋白原/胶原蛋白/糖胺聚糖凝胶；取层粘多糖按照5％(w/v)比例溶于PBS中得粘多糖溶液以得到非必需成分；将必需成分和非必需成分按照4∶2的体积比混合制成细胞外基质水凝胶。
(8)将上述所得的细胞外基质水凝胶与(4)(5)(6)中的功能细胞片层内衬于支架夹层内，用注射器将细胞外基质水凝胶注入支架夹层中，另一端再用聚乳酸缝合线缝合得到复层支架。
(9)将复合支架浸没于20mL 50IU/mL的凝血酶溶液中，固定时间为6min，在凝血酶的作用下纤维蛋白原聚合成纤维蛋白，将功能尿路细胞/细胞外基质封锁在支架内，得到联合预血管化细胞片层技术的用于治疗男性尿道缺损或下裂的3D打印复层组织工程支架。
实施例3
一种尿道组织工程支架的制备，包括如下步骤：
(1)以聚己内酯(分子量50000)为原料，三维建模后将.st1文件导入熔融沉积型3D打印机并打印出两条表面覆盖率为40％且带有样条曲线花纹的矩形长条状胚体，支架壁厚即矩形长条胚体的厚度为0.4mm；分别将两个矩形长条胚体螺旋卷曲在直径分别为φ1＝4.5mm和φ2＝7.3mm的模具上；两端分别用细铜丝固定；再放入30℃的真空干燥箱中退火20min并定型；待模具冷却后抽取模具即得到不同直径的单层支架，均剪裁成长度为60.0mm的长管。
(2)将等长的且直径匹配的支架同轴嵌套固定后构成双层支架，利用消毒后且线径为为0.2mm的聚乳酸手术缝合线缝合双层支架一端，所得双层同轴支架夹层d为1.0mm，再将双层支架进行灭菌处理。
(3)取10g量兔皮下脂肪组织，经胰蛋白酶消化后并培养获得脂肪干细胞，当其增殖至70％～80％融合时予以1∶3传代继续培养。
(4)平滑肌细胞的获取：取第4代生长至80％融合的脂肪干细胞，均匀接种于6孔板。向其中加入诱导培养基(DMEM(含各种氨基酸和葡萄糖的培养基)培养液+10％胎牛血清+50ng/ml PDGF-BB(人血小板生长因子))，培养14天获得平滑肌细胞，再将平滑肌细胞移植到温度敏感性培养皿中进行细胞爬片处理，从37℃降温至20℃取下其细胞片层。
(5)脂肪干细胞诱导分化为内皮细胞：将第3代脂肪干细胞种入瓶，24h后，加入内皮细胞诱导液(DMEM(含各种氨基酸和葡萄糖的培养基)+10％FBS(胎牛血清)+50ug/L血管内皮生长因子+10ug/L成纤维细胞生长因子)。细胞80％融合时传代，继续诱导7天获得内皮细胞。再将内皮细胞移植到温度敏感性培养皿中进行细胞爬片处理，从37℃降温至20℃取下其细胞片层。
(6)尿路上皮细胞片层的获取：使用第三代尿路上皮细胞作为种子细胞。将上述种子细胞悬液均匀接种于培养皿上的6孔板上，37℃，5％CO2条件下培养2周，隔天换液，可得尿路上皮细胞。再将尿路上皮细胞移植到温度敏感性培养皿中进行细胞爬片处理，从37℃降温至20℃取下其细胞片层。
(7)取大块纤维蛋白原按照2％(w/v)比例溶于PBS(磷酸盐缓冲溶液)得纤维蛋白原溶液；取大块胶原蛋白按照5％(w/v)比例溶于PBS中得胶原蛋白溶液；将糖胺聚糖溶解于蒸馏水中，得到5％(w/v)的糖胺聚糖溶液；再将2％(w/v)的纤维蛋白原溶液与5％(w/v)的胶原蛋白及5％(w/v)糖胺聚糖按体积比7∶2∶1(v/v/v)混合，制成必需成分的纤维蛋白原/胶原蛋白/糖胺聚糖凝胶；取接触蛋白按照5％(w/v)比例溶于PBS中得接触蛋白溶液以得到非必需成分；将必需成分和非必需成分按照3∶1的体积比混合制成细胞外基质水凝胶。
(8)将上述所得的细胞外基质水凝胶与平滑肌细胞混合培养3天。利用细胞片层技术将(4)(5)(6)获得的细胞片层内衬于支架夹层内；再将细胞外基质水凝胶利用注射器注入支架夹层内，另一端再用聚乳酸缝合线缝合得到复层支架。
(9)将复合支架浸没于30mL 50IU/mL的凝血酶溶液中，固定时间为8min，在凝血酶的作用下纤维蛋白原聚合成纤维蛋白，将细胞片层/细胞外基质封锁在支架内，得到联合预血管化细胞片层技术的用于治疗男性尿道缺损或下裂的3D打印复层组织工程支架。
实施例4
一种尿道组织工程支架的制备，包括如下步骤：
(1)以聚乳酸和聚己内酯为原料(质量比PLA∶PCL＝20∶80，PLA分子量Mv＝80000，PCL分子量Mv＝50000)，三维建模后将.stl文件导入熔融沉积型3D打印机并打印出两条表面覆盖率为50％且带有样条曲线花纹的矩形长条状胚体，支架壁厚即矩形长条胚体厚度为0.5mm；分别将两个矩形长条胚体螺旋卷曲在直径分别为φ1为5.0mm和φ2为8.0mm的模具上；两端分别用细铜丝固定；再放入120℃的真空干燥箱中退火10min以促进高分子结晶和支架的定型；待模具冷却后抽取模具即得到不同直径的单层支架，再剪裁成长度为80.0mm的长管。
(2)将等长的且直径匹配的支架同轴嵌套固定后构成双层支架，利用消毒后且线径为为0.2mm的聚乳酸手术缝合线缝合双层支架一端，所得双层同轴支架夹层d为1.0mm，再将双层支架进行灭菌处理。
(3)取10g量兔皮下脂肪组织，经胰蛋白酶消化后并培养获得脂肪干细胞，当其增殖至70％～80％融合时予以1∶3传代继续培养。
(4)平滑肌细胞的获取：取第4代生长至80％融合的脂肪干细胞，均匀接种于6孔板。向其中加入诱导培养基(DMEM(含各种氨基酸和葡萄糖的培养基)培养液+10％胎牛血清+50ng/ml PDGF-BB(人血小板生长因子))，培养14天获得平滑肌细胞，再将平滑肌细胞移植到温度敏感性培养皿中进行细胞爬片处理取下其细胞片层。
(5)脂肪干细胞诱导分化为内皮细胞：将第3代脂肪干细胞种入瓶，24h后，加入内皮细胞诱导液(DMEM(含各种氨基酸和葡萄糖的培养基)+10％FBS(胎牛血清)+50ug/L血管内皮生长因子+10ug/L成纤维细胞生长因子)。细胞80％融合时传代，继续诱导7天获得内皮细胞，再将内皮细胞移植到温度敏感性培养皿中进行细胞爬片处理，从37℃降温至20℃取下细胞片层。
(6)尿路上皮细胞片层的获取：使用第三代尿路上皮细胞作为种子细胞。将上述种子细胞悬液均匀接种于培养皿上的6孔板上，37℃，5％CO2条件下培养2周，隔天换液，可得尿路上皮细胞，再将尿路上皮细胞移植到温度敏感性培养皿中进行细胞爬片处理，从37℃降温至20℃取下其细胞片层。
(7)取大块纤维蛋白原按照2％(w/v)比例溶于PBS(磷酸盐缓冲溶液)得纤维蛋白原溶液；取大块胶原蛋白按照5％(w/v)比例溶于PBS中得胶原蛋白溶液；将糖胺聚糖溶解于蒸馏水中，得到5％(w/v)的糖胺聚糖溶液；再将2％(w/v)的纤维蛋白原溶液与5％(w/v)的胶原蛋白及5％(w/v)糖胺聚糖按体积比8∶1∶1(v/v/v)混合，制成必需成分的纤维蛋白原/胶原蛋白/糖胺聚糖凝胶；取基底膜蛋白按照5％(w/v)比例溶于PBS中得基底膜蛋白溶液以得到非必需成分；将必需成分和非必需成分按照4∶1的体积比混合制成细胞外基质水凝胶。
(8)将上述所得的细胞外基质水凝胶与平滑肌细胞混合培养3天。利用细胞片层技术将由(4)(5)(6)获得的细胞片层内衬于支架夹层内；再将细胞外基质水凝胶利用注射器注入支架夹层内，另一端再用聚乳酸缝合线缝合得到复层支架。
(9)将复合支架浸没于40mL 50IU/mL的凝血酶溶液中，固定时间为10min，在凝血酶的作用下纤维蛋白原聚合成纤维蛋白，将细胞片层/细胞外基质封锁在支架内，得到联合预血管化细胞片层技术的用于治疗男性尿道缺损或下裂的3D打印复层组织工程支架。
实施例5
一种复层螺旋尿道组织工程支架的制备方法，参照图1，
步骤1以热塑性可降解聚合物为打印原料，采用熔融沉积型3D打印机制备带有镂空花纹的矩形长条胚体，
步骤2分别对矩形长条胚体进行螺旋卷曲后得到内径匹配并可同轴嵌套的成对胚体螺旋管，对胚体螺旋管进行热处理、嵌套后得到由内外层胚体螺旋管组成的双层支架，并用聚乳酸缝合线将双层支架一端缝合，
步骤3在外层胚体螺旋管内壁上依序内衬培养时转染了血管内皮生长因子和成纤维细胞生长因子的内皮细胞片层、尿路上皮细胞片层以及培养时转染了人血小板生长因子的平滑肌细胞片层，并填充细胞外基质，再缝合双层支架的另一端，经凝血酶固定5～10分钟后即可得尿道组织工程支架；所述细胞外基质包括作为必要成分的纤维蛋白原、纤维蛋白原和糖胺聚糖所构成的凝胶，且其体积百分比分别为60-80％的纤维蛋白原、10-20％的胶原蛋白和10-20％的糖胺聚糖，凝血酶固定的细胞外基质中的纤维蛋白原迅速纤维化形成纤维蛋白，并构成连通的空间网络结构。所述凝血酶溶液用于诱发纤维蛋白原的聚合形成网络结构以将功能尿路细胞组织封锁于支架夹层内。
本实施例可以进一步采取以下技术措施：
所述热塑性可降解聚合物为医用级别的聚乳酸、聚己内酯、聚羟基乙酸三种热塑性可降解聚合物的单体聚合物或共聚物及其混合物中的一种或几种。
内外层胚体螺旋管的内径相差2.0-2.4mm，矩形长条胚体的厚度为0.1-0.5mm，缝合线采用线径0.2mm的聚乳酸丝并做进行灭菌处理，内径匹配并可同轴嵌套的成对胚体螺旋管；螺旋卷曲可以是将两条矩形长条胚体分别螺旋缠绕在不同直径的圆棒模具上，并用细铜丝固定两端，经退火定型处理后，抽取模具后即可内径匹配并可同轴嵌套的成对胚体螺旋管，对胚体螺旋管进行的热处理为退火处理，退火的温度为30-120℃，退火时间为5-20min。
所述带有花纹的矩形长条胚体的表面覆盖率为20-40％，所谓表面覆盖率是指有聚合物填充的花纹面积占整个矩形面积的比例。
所述细胞外基质包括必要成分和非必须成分，即：所述细胞外基质至少还包括作为非必需成分的层粘连蛋白、纤维黏结蛋白、接触蛋白、抗黏附蛋白、肌腱生长蛋白、骨黏连蛋白、基底膜蛋白和粘多糖中的一种，且必要成分与非必需成分之体积百分比为3～4∶2～1。填充细胞外基质利用注射器向其中注入。
所述内皮细胞片层是利用温度敏感性培养皿于37℃下对转染了血管内皮生长因子和成纤维细胞生长因子的内皮细胞进行细胞爬片，并降温至20℃剥离得到的细胞片层；所述尿路上皮细胞片层是利用温度敏感性培养皿于37℃下对尿路上皮细胞进行细胞爬片，并降温至20℃剥离得到的细胞片层；所述平滑肌细胞片层是利用温度敏感性培养皿于37℃下对转染了人血小板生长因子的平滑肌细胞进行细胞爬片，并降温至20℃剥离得到的细胞片层。其爬片处理是在六孔板(或其他尺寸孔板上)加细胞悬液使细胞铺满整个孔底形成一个细胞片层；血管内皮生长因子和成纤维细胞生长因子的转染或人血小板生长因子的转染是内皮细胞或平滑肌细胞主动将生长因子吸收入胞内以促进相关基因表达使得细胞在成为细胞片层(组织)时胞间能及时建立联系的的过程，通常在37℃下转染24-72h可以获得较高的转染效率。

Claims (7)

1.一种复层螺旋尿道组织工程支架的制备方法，其特征在于，
步骤1 以热塑性可降解聚合物为打印原料，采用熔融沉积型3D打印机制备带有镂空花纹的矩形长条胚体，
步骤2 分别对矩形长条胚体进行螺旋卷曲后得到内径匹配并可同轴嵌套的成对胚体螺旋管，对胚体螺旋管进行热处理、嵌套后得到由内外层胚体螺旋管组成的双层支架，并用聚乳酸缝合线将双层支架一端缝合，
步骤3 在外层胚体螺旋管内壁上依序内衬培养时转染了血管内皮生长因子和成纤维细胞生长因子的内皮细胞片层、尿路上皮细胞片层以及培养时转染了人血小板生长因子的平滑肌细胞片层，并填充细胞外基质，再缝合双层支架的另一端，经凝血酶固定5～10分钟后即可得尿道组织工程支架；所述细胞外基质包括作为必要成分的纤维蛋白原、胶原蛋白和糖胺聚糖所构成的凝胶，且其体积百分比分别为60-80％的纤维蛋白原、10-20％的胶原蛋白和10-20％的糖胺聚糖，凝血酶固定的细胞外基质中的纤维蛋白原迅速纤维化形成纤维蛋白，并构成连通的空间网络结构。
2.根据权利要求1所述的复层螺旋尿道组织工程支架的制备方法，其特征在于，内外层胚体螺旋管的内径相差2.0-2.4mm，矩形长条胚体的厚度为0.1-0.5mm，缝合线采用线径0.2mm的聚乳酸丝并做进行灭菌处理。
3.根据权利要求1所述的复层螺旋尿道组织工程支架的制备方法，其特征在于，热塑性可降解聚合物为医用级别的聚乳酸、聚己内酯、聚羟基乙酸三种热塑性可降解聚合物的单体聚合物或共聚物及其混合物中的一种或几种。
4.根据权利要求1所述的复层螺旋尿道组织工程支架的制备方法，其特征在于，带有花纹的矩形长条胚体的表面覆盖率为20-40％，所谓表面覆盖率是指有聚合物填充的花纹面积占整个矩形面积的比例。
5.根据权利要求1所述的复层螺旋尿道组织工程支架的制备方法，其特征在于，对胚体螺旋管进行的热处理为退火处理，退火的温度为30-120℃，退火时间为5-20min。
6.根据权利要求1所述的复层螺旋尿道组织工程支架的制备方法，其特征在于，所述细胞外基质水凝胶至少还包括作为非必需成分的层粘连蛋白、纤维黏结蛋白、接触蛋白、抗黏附蛋白、肌腱生长蛋白、骨黏连蛋白、基底膜蛋白和粘多糖中的一种，且必要成分与非必需成分的体积百分比为3～4∶2～1。
7.根据权利要求1所述的复层螺旋尿道组织工程支架的制备方法，其特征在于，所述内皮细胞片层是利用温度敏感性培养皿于37℃下对转染了血管内皮生长因子和成纤维细胞生长因子的内皮细胞进行细胞爬片，并降温至20℃剥离得到的细胞片层；所述尿路上皮细胞片层是利用温度敏感性培养皿于37℃下对尿路上皮细胞进行细胞爬片，并降温至20℃剥离得到的细胞片层；所述平滑肌细胞片层是利用温度敏感性培养皿于37℃下对转染了人血小板生长因子的平滑肌细胞进行细胞爬片，并降温至20℃剥离得到的细胞片层。
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