CN110658274A - 一种卡瓦胡椒药材中有效成分定量检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种卡瓦胡椒药材中有效成分定性与定量检测方法，具体包括配制对照品溶液、测定各对照品相对校正因子、配制样品溶液、进行样品测定、计算成分含量；本发明公开的方法可以快速地检测其中的有效成分及含量，并且使用的对照品少，能够简化检测过程、提高检测效率、降低检测成本。
Description
技术领域
本发明涉及药材中有效成分检测技术领域，更具体的说是涉及一种卡瓦胡椒药材中有效成分定性与定量检测方法。
背景技术
卡瓦胡椒是来自于胡椒科胡椒属植物Piper methysticum Forst的根和根茎，主要生长于南太平洋斐济和瓦努阿图等国，其中具有多种天然活性物质，能够作用于大脑情感中枢发挥其生理效应，放松心身，当地人用其酿造卡瓦酒，已具有2000多年的历史，饮用卡瓦酒能减轻压力、缓解焦虑、纠正抑郁，促进睡眠。现代药理学研究表明，卡瓦胡椒具有局部麻醉、抗焦虑、镇静催眠、肌肉松弛、抗炎抗菌、缓解更年期症状、治疗抑郁症、惊厥、哮喘等作用，目前广泛用于食品补充剂。
卡瓦胡椒主要有效成分包括卡瓦内酯类，具体包括麻醉椒苦素、二氢麻醉椒苦素、醉椒素、麻醉椒素、二氢醉椒素、去甲氧基醉椒素等，还包括3种查尔酮类化合物，具体为卡瓦胡椒素A、黄卡瓦胡椒素B和卡瓦胡椒素C。现有技术中多采用HPLC测定卡瓦胡椒提取物中6种卡瓦内酯类成分含量，但是采用HPLC需要对多组对照品测量，基于卡瓦胡椒对照品稀缺，所以造成现有测定方法成本高且不易推广应用。
因此，为解决上述问题提供一种新的卡瓦胡椒药材中有效成分定性与定量检测方法是本领域技术人员亟需解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种卡瓦胡椒药材中有效成分定性与定量检测方法，可以快速地检测其中的有效成分及含量，并且使用的对照品少，能够简化检测过程、提高检测效率、降低检测成本。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种卡瓦胡椒药材中有效成分定量检测方法，具体包括如下步骤：
S1配制对照品溶液
分别称取对照品，对照品包括麻醉椒苦素、二氢麻醉椒苦素、醉椒素、二氢醉椒素、麻醉椒素、去甲氧基醉椒素、卡瓦胡椒素A和黄卡瓦胡椒素B；分别向对照品加入溶剂制成对照品贮备液；
S2各对照品相对校正因子的测定
向对照品贮备液中加入溶剂稀释得对照品稀释液，分别测定对照品稀释液吸光度值，由吸光度值分别计算对照品的百分吸收系数；并根据结果在所述对照品中选取一参照物，分别计算对照品的百分吸收系数和参照物的百分吸收系数的比值得到相对校正因子；
S3样品溶液的配制
取待测样品制备样品溶液；
S4液相色谱检测
分别将样品溶液和对照品贮备液进行液相色谱检测，分别得到包括参照物在内的各对照品和样品色谱峰的保留时间，分别计算各对照品色谱峰保留时间与参照物色谱峰保留时间的比值得到对照品的相对保留时间，由对照品相对保留时间确定样品溶液检测色谱峰中各成分的归属，同时读取样品溶液检测结果中各待测成分色谱峰的峰面积以及参照物色谱峰的峰面积；
S5成分含量的计算
由相对校正因子、样品溶液中各待测成分色谱峰峰面积、参照物贮备液的浓度和样品溶液中参照物色谱峰的峰面积分别计算样品中麻醉椒苦素、二氢麻醉椒苦素、醉椒素、二氢醉椒素、麻醉椒素、去甲氧基醉椒素、卡瓦胡椒素A、黄卡瓦胡椒素B的含量。
优选的，步骤S1和步骤S2中所述溶剂相同，包括甲醇、乙醇或水中的至少一种。
优选的，步骤S1中加入溶剂分别制成浓度约为0.1-1mg/ml的对照品贮备液。
优选的，步骤S2中吸光度值检测的波长与步骤S4中液相色谱检测的波长相同，为232nm。
优选的，步骤S2中分别将各对照品稀释液加入至比色皿中，置于紫分光光度计中，测定各对照品稀释液在232nm处的吸光度值为0.3-0.8。
优选的，步骤S2中对照品的百分吸收系数根据朗伯比耳定律计算得到，具体的计算公式为：
A＝ECL，
所述A为各对照品贮备液的吸光度值，所述C为各对照品贮备液的浓度，所述L为测定的液膜厚度；
所述相对校正因子的计算公式是：
fs/x＝Es/Ex，
所述fs/x是各成分相对校正因子，Es为参照物的百分吸收系数，Ex为待测成分的百分吸收系数。
优选的，步骤S3具体为：取待测样品精密称量，加入10-50倍量的溶剂经过回流、超声或冷浸处理，过滤得到澄清的样品溶液，所述溶剂包括甲醇、乙醇或水中的至少一种。
优选的，步骤S4中所述液相色谱检测的色谱条件是：填料为C18的色谱柱，色谱柱内径为2.1mm，且长度为100mm，填料粒径为1.7μm，洗脱条件为洗脱液A-洗脱液B-洗脱液C，梯度洗脱：0～5min洗脱液A为70～75％，洗脱液B为10％，洗脱液C为20～15％；5～11min洗脱液A为75～65％，洗脱液B为10％，洗脱液C为15～25％；11～15min洗脱液A65～45％，洗脱液B为10％，洗脱液C为25～45％；15～18min洗脱液A为45～70％，洗脱液B为10％，洗脱液C为45～20％；流速为0.2ml/min；进样量：1μl；柱温：35℃；检测波长232nm；所述洗脱液A为浓度为0.1％乙酸水溶液，所述洗脱液B为乙腈，所述洗脱液C为异丙醇。
优选的，步骤S4中相对保留时间的精算公式为
r＝rx/rs
式中rx和rs分别为待测成分的保留时间和参照物的保留时间。
优选的，步骤S4还包括液相色谱系统适应性试验，所述液相色谱系统适应性试验的检测条件与所述液相色谱检测的色谱条件相同。
优选的，步骤S4还包括液相色谱系统适应性试验步骤，进行液相色谱检测的色谱条件是：填料为C18的色谱柱，色谱柱内径为2.1mm，且长度为100mm，填料粒径为1.7μm，洗脱条件为洗脱液A-洗脱液B-洗脱液C，梯度洗脱：0～5min洗脱液A为70～75％，洗脱液B为10％，洗脱液C为20～15％；5～11min洗脱液A为75～65％，洗脱液B为10％，洗脱液C为15～25％；11～15min洗脱液A为65～45％，洗脱液B为10％，洗脱液C为25～45％；15～18min洗脱液A为45～70％，洗脱液B为10％，洗脱液C为45～20％；流速为0.2ml/min；进样量：1μl；柱温：35℃；检测波长232nm；所述洗脱液A为浓度为0.1％乙酸水溶液，所述洗脱液B为乙腈，所述洗脱液C为异丙醇。
优选的，步骤S5中采用的计算公式为
所述Wx为待测成分的含量，所述Cx为样品溶液中待测成分的浓度，所述V为样品溶液的体积，所述m为样品的称样量，所述Ax为各待测成分的色谱峰峰面积，所述Cs为参照物贮备液的浓度，所述fs/x是相对校正因子，所述As为样品溶液中参照物色谱峰的峰面积。
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种卡瓦胡椒药材中有效成分定性与定量检测方法，具有如下有益效果：
(1)本发明通过吸光度值计算得到百分吸收系数，选取参照物，并通过百分吸收系数计算得到相对校正因子；
(2)通过建立相对校正因子，可以在测定卡瓦胡椒成分含量过程中，根据参照物的测量结果，即可同时测定麻醉椒苦素、二氢麻醉椒苦素、醉椒素、二氢醉椒素、麻醉椒素、去甲氧基醉椒素、卡瓦胡椒素A、黄卡瓦胡椒素B这8种成分的含量；
(3)并且使含量测定结果与药物分析常用的外标法无显著性差异，方法简便，准确度高，且大大节省实验成本。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
附图1为麻醉椒苦素紫外扫描图；
附图2为二氢麻醉椒苦素紫外扫描图；
附图3为醉椒素紫外扫描图；
附图4为二氢醉椒素紫外扫描图；
附图5为麻醉椒素紫外扫描图；
附图6为去甲氧基醉椒素紫外扫描图；
附图7为卡瓦胡椒素A紫外扫描图；
附图8为黄卡瓦胡椒素B紫外扫描图；
附图9为麻醉椒苦素对照品溶液HPLC色谱图；
附图10为二氢麻醉椒苦素对照品溶液HPLC色谱图；
附图11为醉椒素对照品溶液HPLC色谱图；
附图12为二氢醉椒素对照品溶液HPLC色谱图；
附图13为麻醉椒素对照品溶液HPLC色谱图；
附图14为去甲氧基醉椒素对照品溶液HPLC色谱图；
附图15为卡瓦胡椒素A对照品溶液HPLC色谱图；
附图16为黄卡瓦胡椒素B对照品溶液HPLC色谱图；
附图17为卡瓦胡椒样品溶液的HPLC色谱图。
在图中1-麻醉椒苦素；2-二氢麻醉椒苦素；3-醉椒素；4-二氢醉椒素；5-麻醉椒素；6-去甲氧基醉椒素；7-卡瓦胡椒素A；8-黄卡瓦胡椒素B
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明实施例公开了一种卡瓦胡椒药材中有效成分定量检测方法，具体包括如下步骤：
S1配制对照品溶液
分别称取对照品，加入溶剂分别制成对照品贮备液，对照品包括麻醉椒苦素、二氢麻醉椒苦素、醉椒素、二氢醉椒素、麻醉椒素、去甲氧基醉椒素、卡瓦胡椒素A和黄卡瓦胡椒素B；溶剂包括甲醇、乙醇或水中的至少一种；
S2各对照品相对校正因子的测定
将对照品贮备液加入上述溶剂稀释得对照品稀释液，测定对照品稀释液的吸光度值，由吸光度值分别计算得到对照品的百分吸收系数；在对照品中选取参照物，分别计算对照品的百分吸收系数和参照物的百分吸收系数的比值得到相对校正因子；溶剂包括甲醇、乙醇或水中的至少一种；
对照品的百分吸收系数根据朗伯比耳定律计算，具体的计算公式为A＝ECL
A为各对照品贮备液的吸光度值，C为各对照品贮备液的浓度(g/ml)，L为测定的液膜厚度；
相对校正因子的计算公式是
fs/x＝Es/Ex，
fs/x是各成分相对校正因子，Es为参照物的百分吸收系数，Ex为待测成分的百分吸收系数
S3样品溶液的配制
取待测样品精密称量，加入溶剂经过回流、超声或冷浸处理，过滤得到澄清的样品溶液，溶剂包括甲醇、乙醇或水中的至少一种；
S4样品测定
S41液相色谱系统适应性试验
进行液相色谱检测的色谱条件是：填料为C18的色谱柱，色谱柱内径为2.1mm，且长度为100mm，填料粒径为1.7μm，洗脱条件为洗脱液A-洗脱液B-洗脱液C，梯度洗脱：0～5min洗脱液A为70～75％，洗脱液B为10％，洗脱液C为20～15％；5～11min洗脱液A为75～65％，洗脱液B为10％，洗脱液C为15～25％；11～15min洗脱液A为65～45％，洗脱液B为10％，洗脱液C为25～45％；15～18min洗脱液A为45～70％，洗脱液B为10％，洗脱液C为45～20％；流速为0.2ml/min；进样量：1μl；柱温：35℃；检测波长232nm；所述洗脱液A为浓度为0.1％乙酸水溶液，所述洗脱液B为乙腈，所述洗脱液C为异丙醇。
S42分别将样品溶液和对照品贮备液进行液相色谱检测；得到参照物色谱峰的保留时间，分别计算各对照品色谱峰保留时间与参照物色谱峰保留时间的比值得到对照品的相对保留时间，由对照品相对保留时间确定样品溶液检测色谱峰中各成分的归属，同时读取样品溶液检测结果中各待测成分色谱峰的峰面积以及参照物色谱峰的峰面积；
液相色谱检测的色谱条件是：填料为C18的色谱柱，色谱柱内径为2.1mm，且长度为100mm，填料粒径为1.7μm，洗脱条件为洗脱液A-洗脱液B-洗脱液C，梯度洗脱：0～5min洗脱液A为70～75％，洗脱液B为10％，洗脱液C为20～15％；5～11min洗脱液A为75～65％，洗脱液B为10％，洗脱液C为15～25％；11～15min洗脱液A 65～45％，洗脱液B为10％，洗脱液C25～45％；15～18min洗脱液A为45～70％，洗脱液B为10％，洗脱液C为45～20％；流速为0.2ml/min；进样量：1μl；柱温：35℃；检测波长232nm；所述洗脱液A为浓度为0.1％乙酸水溶液，所述洗脱液B为乙腈，所述洗脱液C为异丙醇。
其中，相对保留时间的计算公式为
r＝rx/rs
式中rx和rs分别为待测成分的保留时间和参照物的保留时间。
S5成分含量的计算
由相对校正因子、样品溶液中各待测成分色谱峰峰面积、参照物贮备液的浓度和样品溶液中参照物色谱峰的峰面积分别计算样品中麻醉椒苦素、二氢麻醉椒苦素、醉椒素、二氢醉椒素、麻醉椒素、去甲氧基醉椒素、卡瓦胡椒素A、黄卡瓦胡椒素B的含量；
采用的计算公式为
Wx为待测成分的含量，Cx为样品溶液中待测成分的浓度，V为样品溶液的体积，m为样品的称样量，Ax为各待测成分的色谱峰峰面积，Cs为参照物贮备液的浓度，fs/x是相对校正因子，As为样品溶液中参照物色谱峰的峰面积。
为了进一步的优化技术方案，步骤S2中吸光度值的检测波长和步骤S4中液相色谱检测的检测波长相同。
实施例1
本发明实施例公开了一种卡瓦胡椒药材中有效成分定量检测方法，具体包括如下步骤：
S1对照品溶液的制备
分别取麻醉椒苦素、二氢麻醉椒苦素、醉椒素、二氢醉椒素、麻醉椒素、去甲氧基醉椒素、卡瓦胡椒素A、黄卡瓦胡椒素B对照品，精密称定，加入甲醇，分别制成麻醉椒苦素对照品贮备液、二氢麻醉椒苦素对照品贮备液、醉椒素对照品贮备液、二氢醉椒素对照品贮备液、麻醉椒素对照品贮备液、去甲氧基醉椒素对照品贮备液、卡瓦胡椒素A对照品贮备液和黄卡瓦胡椒素B对照品贮备液，即得到8种浓度均为1mg/ml的对照品贮备液。
S2各对照品相对校正因子测定
将得到的8种对照品贮备液，加入甲醇稀释后，测定8种对照品在波长232nm处的吸光度值，具体的8种对照品贮备液稀释适宜浓度后紫外全波长扫描图如附图1～附图8所示；由吸光度值分别计算得到8种对照品的百分吸收系数，具体的计算公式为A＝ECL，
其中A为各对照品贮备液的吸光度值，C为各对照品贮备液的浓度(g/ml)，L为测定的液膜厚度，且液膜厚度为1cm。
选取二氢醉椒素为参照物，8种对照品的百分吸收系数与参照物的百分吸收系数的比值即为8种对照品的相对校正因子，其中相对校正因子是根据公式为：
fs/x＝Es/Ex，
式中fs/x是各成分相对校正因子，Es为参照物的百分吸收系数，Ex为待测成分的百分吸收系数。
计算得到的麻醉椒苦素、二氢麻醉椒苦素、醉椒素、麻醉椒素、去甲氧基醉椒素、卡瓦胡椒素A、黄卡瓦胡椒素B与二氢醉椒素的相对校正因子如下表1所示。
表1以二氢醉椒素为参照物的各成分相对校正因子(n＝6)
由上述表1可知，麻醉椒苦素的相对校正因子f二氢醉椒素/麻醉椒苦素是0.5919，二氢麻醉椒苦素的相对校正因子f二氢醉椒素/二氢麻醉椒苦素是0.6416，醉椒素的相对校正因子f二氢醉椒素/醉椒素是0.5013，麻醉椒素的相对校正因子f二氢醉椒素/麻醉椒素是0.7819，去甲氧基醉椒素的相对校正因子f二氢醉椒素/去甲氧基醉椒素是0.8171，卡瓦胡椒素A的相对校正因子f二氢醉椒素/卡瓦胡椒素A是1.3685，黄卡瓦胡椒素B的相对校正因子二氢醉椒素/黄卡瓦胡椒素B是1.4242，二氢醉椒素的相对校正因子f二氢醉椒素/二氢醉椒素是1。
S3样品溶液的制备
取卡瓦胡椒或含有卡瓦胡椒物品中的至少一种为样品，精密称定0.01g样品后，向样品中加入10ml甲醇，超声提取30min，冷却后加甲醇补足减失的重量，滤过，得到澄清的样品溶液。
S4液相色谱检测
S41液相色谱系统适应性试验
进行液相色谱检测的色谱条件是：色谱柱为C18填料，色谱柱内径为2.1mm，且长度为100mm，填料粒径为1.7μm，洗脱条件为洗脱液A-洗脱液B-洗脱液C，梯度洗脱：0～5min洗脱液A为70～75％，洗脱液B为10％，洗脱液C为20～15％；5～11min洗脱液A为75～65％，洗脱液B为10％，洗脱液C为15～25％；11～15min洗脱液A 65～45％，洗脱液B为10％，洗脱液C25～45％；15～18min洗脱液A 45～70％，洗脱液B为10％，洗脱液C 45～20％；流速为0.2ml/min；进样量：1μl；柱温：35℃；检测波长232nm；所述洗脱液A为浓度为0.1％乙酸水溶液，所述洗脱液B为乙腈，所述洗脱液C为异丙醇。
S42样品测定
将得到的样品溶液和8种对照品贮备液，分别进行液相色谱检测，进行液相色谱检测时的检测波长和各对照品相对校正因子测定步骤中测定吸光度值时的波长是一致的，进行液相色谱检测的色谱条件是：填料为C18的色谱柱，色谱柱内径为2.1mm，且长度为100mm，填料粒径为1.7μm，洗脱条件为洗脱液A-洗脱液B-洗脱液C，梯度洗脱：0～5min洗脱液A为70～75％，洗脱液B为10％，洗脱液C为20～15％；5～11min洗脱液A为75～65％，洗脱液B为10％，洗脱液C为15～25％；11～15min洗脱液A 65～45％，洗脱液B为10％，洗脱液C 25～45％；15～18min洗脱液A 45～70％，洗脱液B为10％，洗脱液C 45～20％；流速为0.2ml/min；进样量：1μl；柱温：35℃；检测波长232nm；所述洗脱液A为浓度为0.1％乙酸水溶液，所述洗脱液B为乙腈，所述洗脱液C为异丙醇。8种对照品溶液和样品溶液的HPLC见附图9～附图17所示
以参照物二氢醉椒素色谱峰的保留时间为参照物保留时间，计算除参照物以外的7种对照品色谱峰的保留时间与参照物二氢醉椒素色谱峰的保留时间的比值，具体是根据公式r＝rx/rs计算，式中rx和rs分别为待测成分的保留时间和参照物的保留时间，得到的除参照物二氢醉椒素以外的7种对照品的相对保留时间，从而确定样品溶液色谱峰中麻醉椒苦素、二氢麻醉椒苦素、醉椒素、麻醉椒素、去甲氧基醉椒素、卡瓦胡椒素A、黄卡瓦胡椒素B与二氢醉椒素这8种成分的色谱峰，进而得到样品溶液中8种成分的色谱峰的峰面积，其中各成分与二氢醉椒素参照峰的相对保留时间如下表2所示。
表2以二氢醉椒素为参照物的各成分相对保留时间(n＝6)
如上述表2可知，麻醉椒苦素色谱峰与二氢醉椒素色谱峰保留时间的比值是0.5553，二氢麻醉椒苦素色谱峰与二氢醉椒素色谱峰保留时间的比值是0.5982，醉椒素色谱峰与二氢醉椒素色谱峰保留时间的比值是0.8544，麻醉椒素色谱峰与二氢醉椒素色谱峰保留时间的比值是1.2992，去甲氧基醉椒素色谱峰与二氢醉椒素色谱峰保留时间的比值是1.4297，卡瓦胡椒素A色谱峰与二氢醉椒素色谱峰保留时间的比值是2.1659，黄卡瓦胡椒素B色谱峰与二氢醉椒素色谱峰保留时间的比值是2.2424，二氢醉椒素色谱峰与二氢醉椒素色谱峰保留时间的比值是1。在后续的卡瓦胡椒药材中以上8种成分含量测定时，根据色谱峰保留时间的比值，即可确定各色谱峰是何种成分。
S5待测成分含量的计算
由相对校正因子、样品溶液色谱峰中色谱峰的峰面积、参照物贮备液的浓度和参照物贮备液的峰面积分别计算样品中麻醉椒苦素、二氢麻醉椒苦素、醉椒素、二氢醉椒素、麻醉椒素、去甲氧基醉椒素、卡瓦胡椒素A、黄卡瓦胡椒素B的含量；
采用的计算公式为
Wx为待测成分的含量，Cx为样品溶液中待测成分的浓度，V为样品溶液的体积，m为样品的称样量，Ax为各待测成分的色谱峰峰面积，Cs为参照物贮备液的浓度，fs/x是相对校正因子，As为参照物色谱峰的峰面积。
采用本发明实施例1公开的方法对不同的样品进行检测，得到的结果如下表3所示。
表3外标法和本法同时测定卡瓦胡椒药材中8种成分含量(mg·g-1)(n＝4)
有上述表3中的数据可以明显得知，用本方法测定各卡瓦胡椒药材中8种成分的含量与药物分析常用的外标法所得结果相比较，没有显著性差异，即结果接近，说明本方法所得结果可靠。
本发明提供的卡瓦提取物中8种有效成分快速定性与定量检测方法，是根据各成分的百分吸收系数与参照物相比计算得到的相对校正因子；相对校正因子一经建立，在后续的卡瓦药材中有效成分的含量测定时，只需1种对照品，即可同时测定麻醉椒苦素、二氢麻醉椒苦素、醉椒素、二氢醉椒素、麻醉椒素、去甲氧基醉椒素、卡瓦胡椒素A、黄卡瓦胡椒素B等8种成分的含量，含量测定结果与药物分析常用的外标法无显著性差异，方法简便，准确度高，且大大节省实验成本。
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。对于实施例公开的装置而言，由于其与实施例公开的方法相对应，所以描述的比较简单，相关之处参见方法部分说明即可。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
Claims (10)
1.一种卡瓦胡椒药材中有效成分定量检测方法，其特征在于，具体包括如下步骤：
S1 配制对照品溶液
分别称取对照品，对照品包括麻醉椒苦素、二氢麻醉椒苦素、醉椒素、二氢醉椒素、麻醉椒素、去甲氧基醉椒素、卡瓦胡椒素A和黄卡瓦胡椒素B；分别向对照品加入溶剂制成对照品贮备液；
S2 各对照品相对校正因子的测定
向对照品贮备液中加入溶剂稀释得对照品稀释液，分别测定对照品稀释液吸光度值，由吸光度值分别计算对照品的百分吸收系数；并根据结果在所述对照品中选取一参照物，分别计算对照品的百分吸收系数和参照物的百分吸收系数的比值得到相对校正因子；
S3 样品溶液的配制
取待测样品制备样品溶液；
S4 液相色谱检测
分别将样品溶液和对照品贮备液进行液相色谱检测，分别得到包括参照物在内的各对照品和样品色谱峰的保留时间，分别计算各对照品色谱峰保留时间与参照物色谱峰保留时间的比值得到对照品的相对保留时间，由对照品相对保留时间确定样品溶液检测色谱峰中各成分的归属，同时读取样品溶液检测结果中各待测成分色谱峰的峰面积以及参照物色谱峰的峰面积；
S5 成分含量的计算
由相对校正因子、样品溶液中各待测成分色谱峰峰面积、参照物贮备液的浓度和样品溶液中参照物色谱峰的峰面积分别计算样品中麻醉椒苦素、二氢麻醉椒苦素、醉椒素、二氢醉椒素、麻醉椒素、去甲氧基醉椒素、卡瓦胡椒素A、黄卡瓦胡椒素B的含量。
2.根据权利要求1所述的一种卡瓦胡椒药材中有效成分定量检测方法，其特征在于，步骤S1和步骤S2中所述溶剂相同，包括甲醇、乙醇或水中的至少一种。
3.根据权利要求2所述的一种卡瓦胡椒药材中有效成分定量检测方法，其特征在于，步骤S1中加入溶剂分别制成浓度约为0.1-1mg/ml的对照品贮备液。
4.根据权利要求1所述的一种卡瓦胡椒药材中有效成分定量检测方法，其特征在于，步骤S2中吸光度值检测的波长与步骤S4中液相色谱检测的波长相同，为232nm。
5.根据权利要求4所述的一种卡瓦胡椒药材中有效成分定量检测方法，其特征在于，步骤S2中分别将各对照品稀释液加入至比色皿中，置于紫分光光度计中，测定各对照品稀释液在232nm处的吸光度值为0.3-0.8。
优选的，步骤S2中对照品的百分吸收系数根据朗伯比耳定律计算得到，具体的计算公式为：
A＝ECL，
所述A为各对照品贮备液的吸光度值，所述C为各对照品贮备液的浓度，所述L为测定的液膜厚度；
所述相对校正因子的计算公式是：
fs/x＝Es/Ex，
所述fs/x是各成分相对校正因子，Es为参照物的百分吸收系数，Ex为待测成分的百分吸收系数。
6.根据权利要求1所述的一种卡瓦胡椒药材中有效成分定量检测方法，其特征在于，步骤S3具体为：取待测样品精密称量，加入10-50倍量的溶剂经过回流、超声或冷浸处理，过滤得到澄清的样品溶液，所述溶剂包括甲醇、乙醇或水中的至少一种。
7.根据权利要求1或4所述的一种卡瓦胡椒药材中有效成分定量检测方法，其特征在于，步骤S4中所述液相色谱检测的色谱条件是：填料为C18的色谱柱，色谱柱内径为2.1mm，且长度为100mm，填料粒径为1.7μm，洗脱条件为洗脱液A-洗脱液B-洗脱液C，梯度洗脱：0～5min洗脱液A为70～75％，洗脱液B为10％，洗脱液C为20～15％；5～11min洗脱液A为75～65％，洗脱液B为10％，洗脱液C为15～25％；11～15min洗脱液A为65～45％，洗脱液B为10％，洗脱液C为25～45％；15～18min洗脱液A为45～70％，洗脱液B为10％，洗脱液C为45～20％；流速为0.2ml/min；进样量：1μl；柱温：35℃；检测波长232nm；所述洗脱液A为浓度为0.1％乙酸水溶液，所述洗脱液B为乙腈，所述洗脱液C为异丙醇。
8.根据权利要求7所述的一种卡瓦胡椒药材中有效成分定量检测方法，其特征在于，步骤S4中相对保留时间的精算公式为
r＝rx/rs
式中rx和rs分别为待测成分的保留时间和参照物的保留时间。
9.根据权利要求8所述的一种卡瓦胡椒药材中有效成分定量检测方法，其特征在于，步骤S4还包括液相色谱系统适应性试验，所述液相色谱系统适应性试验的检测条件与所述液相色谱检测的色谱条件相同。
10.根据权利要求1所述的一种卡瓦胡椒药材中有效成分定量检测方法，其特征在于，步骤S5中采用的计算公式为
所述Wx为待测成分的含量，所述Cx为样品溶液中待测成分的浓度，所述V为样品溶液的体积，所述m为样品的称样量，所述Ax为各待测成分的色谱峰峰面积，所述Cs为参照物贮备液的浓度，所述fs/x是相对校正因子，所述As为样品溶液中参照物色谱峰的峰面积。
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