CN110655563A - 一种浒苔中硝酸盐转运蛋白体及其编码基因 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种浒苔中的硝酸盐转运蛋白体，该硝酸盐转运蛋白体包含SEQ ID No.2、4、6所示的蛋白质中至少一个。其基因序列分别为SEQ ID No.1、3、5所示，均属于NRT硝酸盐转运蛋白家族。经验证，本发明提供的硝酸盐转运蛋白具有硝酸盐转运活性，可用于植物和藻类的育种。
Description
技术领域
本发明属于基因工程领域，具体涉及一种来源于浒苔的硝酸盐转运蛋白体。
背景技术
氮素是广泛存在于自然界的生物体必须元素，在生物体的生长代谢过程中起着不可或缺的作用，是构成生命体的众多核苷酸和蛋白质的重要成分。自然界的氮素以无机态为主，其中又以NO3-含量为最高，同时NO3-也是多数植物吸收氮素的主要形态。
植物吸收硝酸盐主要通过硝酸盐转运蛋白(Nitrate transporter，NRT)来完成。硝酸盐转运蛋白参与植物对硝态氮的主动吸收和体内运转，在植物根系吸收和体内分配中发挥重要作用。该蛋白属于膜转运蛋白MFS(major facilitator superfamily)家族，参与并介导高等植物对NO3-的吸收及其在不同组织、器官间的再度转运。硝酸盐转运蛋白广泛存在于动物、高等植物、藻类、细菌和真菌中。在高等植物中NRT基因家族分为NRT1和NRT2两个亚家族。当外界NO3-浓度高于1.0mmol/L时，NRT1家族发挥吸收转运作用；而低于1.0mmol/L时，NRT2家族发挥作用。
此外，NRT除具有硝态氮转运功能，还在植物信号感受、形态构成、发育调控及与环境相互作用中具有一定功能。对于NRT功能的研究，目前主要集中于拟南芥、水稻等模式植物。有研究将盐生杜氏藻中的NRT基因整合到苜蓿的基因组中得到阳性株对低浓度硝酸盐的吸收能力有所提高。也有研究表明含有盐生杜氏藻硝酸盐转运蛋白基因的大肠杆菌具有盐耐受性。但是对于硝酸盐蛋白基因对大型海生植物育种影响的研究较少。
浒苔(Enteromorpha prolifera)又称青苔，属于绿藻门，广泛分布于我国南北海区，是资源丰富的绿藻资源。浒苔的大规模爆发会引起海洋的绿潮现象，浒苔绿潮会在一定程度上对海水氮磷等营养要素的化学形态、分布和结构产生重要影响。
浒苔在形成绿潮的过程中，受多种生态因子影响，其中光照，温度，盐度，摄食动物等，都有可能引起浒苔的大量繁殖。在多种影响因子中，大量且迅速的营养盐输入会对绿潮的产生有极大的促进作用。浒苔对氮素的需求很高，添加Fe、Mn等微量元素可明显促进浒苔的生长与繁殖。研究浒苔在生长和消亡中氮素在藻体内外的迁移过程、其机理及其关键性酶蛋白，对于深入认知浒苔对氮的吸收代谢机制，预测浒苔爆发消亡后对近海生态环境的影响，以及包括浒苔在内的植物和藻类的育种，都具有非常重要的意义。
发明内容
本发明提供了3种硝酸盐转运蛋白及其组成的转运蛋白体，经验证，均具备较好的硝酸盐释放速率。
具体地，本发明提供了：
一种硝酸盐转运蛋白EpNRT1，其氨基酸序列为SEQ ID No.2所示；由SEQ ID No.1所示的核苷酸序列编码。
一种硝酸盐转运蛋白EpNRT2，其氨基酸序列如SEQ ID No.4所示；由SEQ ID No.3所示的核苷酸序列编码。
一种硝酸盐转运蛋白EpNRT3，其氨基酸序列如SEQ ID No.6所示；由SEQ ID No.5所示的核苷酸序列编码。
一种硝酸盐转运蛋白体，包含硝酸盐转运蛋白EpNRT1和硝酸盐转运蛋白EpNRT2。
一种硝酸盐转运蛋白体，包含硝酸盐转运蛋白EpNRT1和硝酸盐转运蛋白EpNRT3。
一种硝酸盐转运蛋白体，包含硝酸盐转运蛋白EpNRT2和硝酸盐转运蛋白EpNRT3。
一种硝酸盐转运蛋白体，包含硝酸盐转运蛋白EpNRT1、硝酸盐转运蛋白EpNRT2和硝酸盐转运蛋白EpNRT3。
本发明还提供了包含上述硝酸盐转运蛋白或蛋白体的基因工程细胞、细胞反应器或水生植物细胞以及包含上述硝酸盐转运蛋白基因的载体，基因工程细胞。
本发明还提供了上述硝酸盐转运蛋白及其编码基因在藻类和植物育种中的应用。
附图说明
图1为△ynt-Leu双突变多形汉逊酵母、野生型酵母和转EpNRT1、EpNRT2、EpNRT3、EpNRT1+EpNRT2、EpNRT1+EpNRT3、EpNRT2+EpNRT3、EpNRT1+EpNRT2+EpNRT3酵母单菌落在YNGL培养基过夜培养后OD600的吸光度。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，下述实施例不用于限制本发明，仅用于说明本发明。以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1基因或蛋白来源物种的测定。
1、基因挖掘：
浒苔总RNA的提取：
样品取自于2018年7月绿潮发生时漂浮于青岛近岸的浒苔，用于后续提取实验。取浒苔组织，置于液氮中研碎，加入盛有裂解液的1.5mL Eppendorf(EP)离心管中，充分振荡后，按照TIANGEN试剂盒的说明书抽提总RNA。用琼脂糖凝胶电泳鉴定总RNA质量。
NCBI比对：
从NCBI中分别下载已知的代表物种中的硝酸盐转运蛋白的CDS序列，并利用同源比对的方法，从浒苔基因组和转录组中调取相应转运蛋白的核苷酸序列。通过NCBI的ORFfinder模块分析序列的ORF，找到全长CDS；并利用NCBI的conserved domain模块分析其保守结构域。找到具有保守结构域的硝酸盐转运蛋白EpNRT1/2/3,其编码基因为Epnrt1/2/3。
以所提取的总RNA为模板，在PowerScript反转录酶的作用下合成cDNA；根据Epnrt1/2/3基因的序列设计基因特异性引物，通过PCR从总cDNA中扩Epnrt1/2/3基因，并测序。
通过上述步骤，获得了浒苔中该转运蛋白的转录蛋白的编码序列，即核苷酸序列，如SEQ ID No.1、3、5所示，其中，起始密码子为ATG，终止密码子分别为TAG和TGA，全长分别为1503bp、1500bp、954bp。并推导出其蛋白编码序列如SEQ ID No.2、4、6所示。
2、浒苔性能测定：生理数据
(1)实验材料及预处理
浒苔(Ulva prolifera)实验组样品取自于2018年7月绿潮发生时漂浮于青岛近岸的浒苔，选择藻体无“白化”，颜色为翠绿色的藻体，用海水冲洗，去除杂物，饥饿培养3d(叶静等，2006)。
预处理：实验前将洗净的藻体放入0.2％KI-I溶液中浸泡1min，再用过滤灭菌的人工海水漂洗3～4次，以去除原生动物和附生生物。
(2)材料培养
实验采用一次性培养。实验藻种于室内光照培养箱中用10L的玻璃瓶培养，称取浒苔20g，分别放入玻璃瓶中进行培养，同时设置3组平行样；温度：20℃；光照：6000lx(Zhu etal.,2016)；光照周期：12h/12h。培养所用海水为人工海水，用MilliQ水配置f/2培养基(Guillard and Ryther,1962)。人工海水中添NO3-为30.00μmol/L，PO4 3-为1.00μmol/L，不添加其他氮源。
(3)参数测定
根据研究目标，需对培养液、藻体细胞内不同形态氮不同分子量组分进行测定。在每次取样时，取出1g浒苔用滤纸吸干表面水分后烘干备用；同时取1L培养液，培养液用0.2μm的GTTP滤膜(Merck Millipore)过滤后用于营养盐浓度测定。用QuAAtro营养盐自动分析仪(Seal Analytical，Germany)测定水体中的NO2-、NO3-，检出限分别是0.01、0.06μmol，仪器精密度≤3％(Liu,et al.，2005)。浒苔体内的NO2-、NO3-的测定，取0.1g经65℃烘干至恒重的浒苔粉末，加入50mL MilliQ水溶解(Corzo and Niell,1992)，振荡10min后用0.2μm的GTTP滤膜过滤后，将滤液用营养盐自动分析仪测定其NO2-、NO3-浓度。
(4)实验结果
浒苔对水体硝酸盐的吸收速率：浓度计算方式为：物质含量/(时间*浒苔湿重))
细胞内硝酸盐浓度：(浓度计算方式为：物质含量/浒苔干重)
| 处理时间(h) | NO<sub>3</sub><sup>-</sup>浓度(μmol/g) | NO<sub>2</sub><sup>-</sup>浓度(μmol/g) |
| 6 | 24.9827±2.076 | 2.287±1.343 |
| 12 | 27.40635±3.285 | 8.05±2.03 |
| 24 | 46.96635714±1.964 | 2.781428571±1.423 |
| 72 | 52.5411±4.963 | 2.141±0.563 |
| 120 | 1.824136364±0.973 | 2.725454545±0.953 |
| 168 | 2.809428571±1.321 | 1.631428571±0.874 |
| 240 | 12.173375±0.8969 | 0.4425±0.043 |
| 336 | 2.2262±0.9321 | 3.1585±1.326 |
| 504 | 2.2685±1.976 | 2.6605±0.765 |
| 720 | 2.60625±1.207 | 6.19125±2.034 |
实施例2基因的克隆表达和蛋白纯化
采用大肠杆菌、pET载体系统、His-tag镍柱纯化系统对下述蛋白进行表达纯化，具体操作步骤参见相关菌株、试剂、试剂盒的操作手册：
1、硝酸盐转运蛋白EpNRT1，氨基酸序列如SEQ ID No.2所示；由SEQ ID No.1所示的核苷酸序列编码；
2、硝酸盐转运蛋白EpNRT2，其氨基酸序列如SEQ ID No.4所示；由SEQ ID No.3所示的核苷酸序列编码；
3、硝酸盐转运蛋白EpNRT3，其氨基酸序列如SEQ ID No.6所示；由SEQ ID No.5所示的核苷酸序列编码。
基因克隆表达与蛋白纯化为本领域常规步骤，故在此不做赘述。
通过对纯化蛋白进行SDS-PAGE发现条带位置均与通过氨基酸预测的蛋白大小一致。
实施例3性能测定
参考发明专利CN105481955A。
参考上述发明专利的方法对三种硝酸盐转运蛋白EpNRT1、2、3以及两两组合或3者组合进行功能鉴定。分别挑取△ynt-Leu双突变多形汉逊酵母、野生型酵母和转EpNRT1、EpNRT2、EpNRT3、EpNRT1+EpNRT2、EpNRT1+EpNRT3、EpNRT2+EpNRT3、EpNRT1+EpNRT2+EpNRT3酵母单菌落，接种到10mL YNGL培养基中，37℃、200r/min培养过夜，利用分光光度计测量OD600的吸光值。
结果如图1所示：△ynt-Leu双突变多形汉逊酵母在YNGL培养基中不能生长，而野生型酵母和转EpNRT1、EpNRT2、EpNRT3、EpNRT1+EpNRT2、EpNRT1+EpNRT3、EpNRT2+EpNRT3、EpNRT1+EpNRT2+EpNRT3酵母在YNGL培养基中可以生长，表明EpNRT1、EpNRT2、EpNRT3蛋白可以使△ynt-Leu双突变多形汉逊酵母在YNGL培养基中恢复生长，三个蛋白都具有硝酸盐转运的功能，并且存在功能互补。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国海洋大学
<120> 一种硝酸盐转运蛋白体及其编码基因
<130> 20191025
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1503
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
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Lys Ala Leu Asn Val Asn Leu Phe Ser Phe Ala Leu Pro His Met Arg
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Ala Phe His Leu Cys Trp Phe Gly Phe Phe Thr Ser Phe Val Ser Thr
35 40 45
Phe Ala Pro Ala Ala Met Ile Pro Val Ile Arg Glu Asp Leu Gly Leu
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Ser Lys Ala Asp Leu Gly Asn Ala Gly Ile Ala Ala Val Thr Gly Thr
65 70 75 80
Ile Ala Ala Arg Val Ala Met Gly Ala Val Cys Asp Trp Ile Gly Pro
85 90 95
Arg Leu Gly Met Ser Ser Val Leu Met Met Thr Ala Pro Cys Val Phe
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Gly Met Ala Leu Ala Asn Lys Ala Leu Asp Phe Thr Leu Leu Arg Phe
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Gly Ile Gly Phe Gly Leu Ser Thr Phe Val Ala Cys Gln Phe Trp Thr
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Ala Ser Met Phe Asn Val Lys Ile Val Gly Ile Ala Asn Ala Thr Thr
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Arg Trp Ala Met Phe Val Pro Ala Phe Met His Ile Ile Gly Gly Met
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Gly Val Leu Phe Phe Ser Asn Asp Leu Pro Asp Gly Asn Tyr Ala Leu
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Leu Lys Lys Ser Gly Gly Met Ser Lys Asp Ser Pro Leu Arg Val Phe
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Ile Thr Ala Cys Ser Asn Tyr Arg Met Trp Cys Leu Thr Ala Thr Tyr
245 250 255
Gly Phe Cys Phe Gly Val Glu Leu Thr Met Asn Asn Ile Ile Val Thr
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Gly Ser Leu Phe Gly Leu Met Asn Ile Phe Ala Arg Ser Val Gly Gly
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Leu Gly Ser Asp Leu Ala Gly Lys Arg Phe Gly Met Arg Gly Arg Leu
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Trp Ala Leu Trp Ser Met Gln Thr Phe Glu Gly Ala Leu Cys Ile Phe
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Gln Asp Thr Ser Tyr Glu Thr Tyr Thr Gly Leu Val Tyr Met Gly Ile
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Gly Ala Gly Gly Asn Ala Gly Ser Val Ile Thr Gln Ser Leu Phe Phe
385 390 395 400
Lys Asp Ser Ser Tyr Glu Thr Tyr Thr Gly Leu Val Tyr Met Gly Ile
405 410 415
Met Val Met Ala Met Thr Leu Leu Val Val Pro Ile Tyr Phe Pro Met
420 425 430
Trp Gly Gly Met Leu Cys Gly Pro Arg Glu Gly Val Val Glu Glu Asp
435 440 445
Tyr Tyr Leu Gly Glu Phe Ser Glu Glu Glu Arg Ala Ala Gly Leu Ala
450 455 460
Asp Ala Ala Met Lys Phe Ala Gln Glu Ser Lys Ser Gln Arg Gly Ala
465 470 475 480
Lys Gln Arg Met Pro Gly Asp Asp Ile Pro Ala Glu Thr Lys Pro Glu
485 490 495
Ser Ala Ala
<210> 5
<211> 954
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 5
atgaattcgt gcattcattt gccttcacgg tcgctggcgc cacgcgcgtg tagctcagcg 60
cgagcgggca cgcgatgggc atcagcacga gttgtccctc cagtgctcgg cttctccgca 120
ggcgaatcca tcagaggcac agcgagcgaa cgcagaaagt ctacatgtgc tgcagcagag 180
ctagcttcgc ctccagaatc cctggagaga gcagttgctg cgggcgagaa gaaggccaat 240
ctgccgccga cgaagatctt cctgctgggc atcctcgcgg gcgtgtacat cggcttcggc 300
gcgctgctca tgatgtgcgt cggtggcagc tgcaccggca tcgccgcgag cgaccccggc 360
ctcaaggcca tcatctcggg cctcttcggc ctccccttcg gcctcatcat ggtcctcatc 420
accggctccg agctgttcac gggcaacgcg gcgctcgtga ccgcggccgt cctcgagggc 480
cgcgccacgc tctcgcagct caccaagtcg tgggtcgtgt ccttcaccgg caacatcgtc 540
ggctcgattg ctctcgccgc tctcgccgtc tttgccggcc tgttcacgac caaccccgtc 600
gctgtcaaga ccgccgtcgc caagaccagc ctcccctggg gcgcggcgtt tgcgcgcggc 660
atcctgtgca actggctggt gtgcatggcg atctggatgg cgctgtgtga gaacacgctg 720
cctggcaagg cgacggctgt gctgttcccg atcccggcgt tcattgcgat cggcctggag 780
cactctgtgg ccaacatttt catcatctcg gccggcatcc tcgcgggcgc caaggtgtcg 840
tgggcagaca tgtggatcaa gaatctggtg cccgtgactc tcggtaacat cgtcgggggt 900
gccttctgcg tagggtttgc actgtggctg gtgcaccgca agaaggacgt gtga 954
<210> 6
<211> 317
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 6
Met Asn Ser Cys Ile His Leu Pro Ser Arg Ser Leu Ala Pro Arg Ala
1 5 10 15
Cys Ser Ser Ala Arg Ala Gly Thr Arg Trp Ala Ser Ala Arg Val Val
20 25 30
Pro Pro Val Leu Gly Phe Ser Ala Gly Glu Ser Ile Arg Gly Thr Ala
35 40 45
Ser Glu Arg Arg Lys Ser Thr Cys Ala Ala Ala Glu Leu Ala Ser Pro
50 55 60
Pro Glu Ser Leu Glu Arg Ala Val Ala Ala Gly Glu Lys Lys Ala Asn
65 70 75 80
Leu Pro Pro Thr Lys Ile Phe Leu Leu Gly Ile Leu Ala Gly Val Tyr
85 90 95
Ile Gly Phe Gly Ala Leu Leu Met Met Cys Val Gly Gly Ser Cys Thr
100 105 110
Gly Ile Ala Ala Ser Asp Pro Gly Leu Lys Ala Ile Ile Ser Gly Leu
115 120 125
Phe Gly Leu Pro Phe Gly Leu Ile Met Val Leu Ile Thr Gly Ser Glu
130 135 140
Leu Phe Thr Gly Asn Ala Ala Leu Val Thr Ala Ala Val Leu Glu Gly
145 150 155 160
Arg Ala Thr Leu Ser Gln Leu Thr Lys Ser Trp Val Val Ser Phe Thr
165 170 175
Gly Asn Ile Val Gly Ser Ile Ala Leu Ala Ala Leu Ala Val Phe Ala
180 185 190
Gly Leu Phe Thr Thr Asn Pro Val Ala Val Lys Thr Ala Val Ala Lys
195 200 205
Thr Ser Leu Pro Trp Gly Ala Ala Phe Ala Arg Gly Ile Leu Cys Asn
210 215 220
Trp Leu Val Cys Met Ala Ile Trp Met Ala Leu Cys Glu Asn Thr Leu
225 230 235 240
Pro Gly Lys Ala Thr Ala Val Leu Phe Pro Ile Pro Ala Phe Ile Ala
245 250 255
Ile Gly Leu Glu His Ser Val Ala Asn Ile Phe Ile Ile Ser Ala Gly
260 265 270
Ile Leu Ala Gly Ala Lys Val Ser Trp Ala Asp Met Trp Ile Lys Asn
275 280 285
Leu Val Pro Val Thr Leu Gly Asn Ile Val Gly Gly Ala Phe Cys Val
290 295 300
Gly Phe Ala Leu Trp Leu Val His Arg Lys Lys Asp Val
305 310 315
Claims (10)
1.一种浒苔中编码硝酸盐转运蛋白的基因，其特征在于，所述的基因包含SEQ IDNo.1、3、5中的任意一条或多条所示的核苷酸序列。
2.一种硝酸盐转运蛋白，其特征在于，所述的硝酸盐转运蛋白包含权利要求1所述的SEQ ID No.1、3、5中的任意一条或多条核苷酸序列编码的蛋白，所述的硝酸盐转运蛋白包含SEQ ID No.2、4、6中任意一条或多条所示的氨基酸序列。
3.一种浒苔中编码硝酸盐转运蛋白的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列为SEQID No.1所示。
4.一种由权利要求3所述基因编码的蛋白，其特征在于，所述蛋白的氨基酸序列为SEQID No.2所示，其具有硝酸盐转运蛋白活性。
5.一种浒苔中编码硝酸盐转运蛋白的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列为SEQID No.3所示。
6.一种由权利要求5所述基因编码的蛋白，其特征在于，所述蛋白的氨基酸序列为SEQID No.4所示，其具有硝酸盐转运蛋白活性。
7.一种浒苔中编码硝酸盐转运蛋白的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列为SEQID No.5所示。
8.一种由权利要求7所述基因编码的蛋白，其特征在于，所述蛋白的氨基酸序列为SEQID No.6所示，其具有硝酸盐转运蛋白活性。
9.包含权利要求2、4、6、8任意一项所述的蛋白的基因工程细胞、细胞反应器或水生植物细胞以及包含权利要求1、3、5、7任意一项所述的基因的载体、基因工程细胞。
10.权利要求1、3、5、7任意一项所述的基因以及权利要求2、4、6、8任意一项所述的蛋白在藻类和植物育种中的应用。
Priority Applications (1)
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Applications Claiming Priority (1)
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Citations (3)
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| CN1887903A (zh) * | 2006-07-19 | 2007-01-03 | 北京优利康生物农业技术有限公司 | 硅藻的硝酸盐转运蛋白及其编码基因与应用 |
| WO2009117853A1 (zh) * | 2008-03-27 | 2009-10-01 | 北京优利康生物农业技术有限公司 | 一种培育氮吸收能力提高的植物的方法 |
| CN105481955A (zh) * | 2015-12-10 | 2016-04-13 | 中国农业科学院生物技术研究所 | 速生水生植物硝酸盐转运蛋白GeNRT2.1及其编码基因与应用 |
-
2019
- 2019-11-01 CN CN201911061295.2A patent/CN110655563B/zh active Active
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Non-Patent Citations (2)
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|---|
| CAI ZHAOYAN等: "Progress on nitrate and oligopeptide transporters in plants", 《JOURNAL OF TROPICAL AND SUBTROPICAL BOTANY》 * |
| 张鹏燕等: "浒苔生长-衰亡过程中氮形态的迁移转化过程", 《中国环境科学》 * |
Also Published As
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|---|---|
| CN110655563B (zh) | 2021-03-19 |
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