CN110643531A - 一株对纤维素具有良好降解效果的致胜拉恩菌 - Google Patents

Abstract

一株对纤维素具有良好降解效果的致胜拉恩菌，属于微生物学技术领域，其特征在于：利用富集培养法，从黑龙江省大兴安岭地区漠河县采集的冻土中分离出菌株B3‑1，此菌株B3‑1可以在72天内将厚度为10厘米的秸秆充分降解。通过羧甲基纤维素钠平板直接分离出菌株B3‑1，并通过生理生化和16S rDNA鉴定，将菌株B3‑1被鉴定为致胜拉恩菌Rahnella victoriana，菌株保藏日期：2018年11月30日；保藏编号：CGMCC No.16847；降解实验表明，该菌株B3‑1具有良好的纤维素降解效果。

Description

一株对纤维素具有良好降解效果的致胜拉恩菌

技术领域

本发明涉及一株对纤维素具有良好降解效果的致胜拉恩菌，属于微生物学技术领域。

背景技术

纤维素是葡萄糖残基以β-1，4-糖苷键连接而形成的线性葡聚糖，广泛存在于植物中。玉米秸秆是世界上生物量巨大的农业废弃物，它富含纤维素成分，可以在许多领域发挥重要的作用。但是现有的利用状况造成了相当一部分的玉米秸秆被低价值使用和直接废弃，其后果是既浪费了资源，又污染了环境。纤维素是自然界中存在最广泛的一类碳水化合物，同时它也是地球上数量最大的可再生资源。目前，自然界中纤维素只有少部分得到了利用，绝大多数纤维素不仅被白白浪费，而且还造成环境污染。利用微生物分解转化纤维素类物质可以将其变为饲料、栽培基质、有机肥料、化工原料等。纤维素酶是纤维素降解过程中的重要酶类物质，包括3类可溶性细胞外的酶：1，4-β-内切葡聚糖酶， 1，4-β-外切葡聚糖酶和β-葡糖苷酶。许多微生物包括许多细菌、真菌和放线菌都有产纤维素酶的能力。但目前获得的菌株其纤维素酶活力普遍较低，即使酶活力很高的菌株在后续培养时也存在不稳定的现象，这些都是影响纤维素酶大量生产的因素。筛选高效纤维素酶活力的菌株仍然是人们努力的目标，通过对其纤维素降解能力和生物学特性测定，旨在获得能够高效、快速降解纤维素的优良菌种。本研究从黑龙江省大兴安岭地区漠河县采集的冻土中分离筛选出高效降解纤维素的致胜拉恩菌，并对其纤维素降解效果进行测定，以期对以后降解秸秆、秸秆还田等生物法降解秸秆提供理论基础。

目前，已有多种能够降解纤维素的菌株被国内外研究人员从不同土壤中筛选出，如： Acetobacter xylinus(Feth el Zahar Haichar，et al.2007.)等，虽然大多数菌株能够降解纤维素，但是，在通常情况下这些降解菌的降解效率都不是很高。

如何寻找到一株对纤维素具有明显降解效果的细菌成为急需解决的一大难题？所以，发明一株对纤维素具有良好降解效果的致胜拉恩菌，寻找到一种对纤维素高效降解的致胜拉恩菌是必要的。

发明内容

为了克服目前发现的降解菌对纤维素降解效率都不是很高的难题，本发明提供了一个一株对纤维素具有良好降解效果的致胜拉恩菌(保藏编号：CGMCC No.16847)。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一株对纤维素具有良好降解效果的致胜拉恩菌(保藏编号：CGMCC No.16847)，具体构建及验证过程如下：

本实验所用的土样采集自黑龙江省大兴安岭地区漠河县采集的冻土(0-15厘米)。将土壤样品过20目筛以去除石块和植物碎屑，然后装入封口袋中4℃保存。

试剂：3，5-二硝基水杨酸购自北京百奥莱科技有限公司，刚果红购自天津市河东区红岩试剂厂，其他常规试剂均为分析纯或更高纯度。

培养基：LB培养基：青岛高科园海博生物科技有限公司。羧甲基纤维素钠培养基(CMC)： CMC-Na 15.0g，NaCl 6.0g，酵母粉1.0g，(NH₄)₂SO₄ 2.0g，MgSO₄ 0.1g，KH₂PO₄ 0.1g，CaCl₂ 0.1g， K₂HPO₄ 0.5g，琼脂18g，蒸馏水1000mL，pH 7.0。灭菌条件：120℃高压灭菌20分钟。发酵培养基：酵母粉1.0％，NaCl 0.5％，蛋白胨1.0％，羧甲基纤维素钠1.0％，K₂HPO₄0.1％。

降解菌的富集、驯化与分离：称取5g土样加入到100mL以羧甲基纤维素钠为唯一碳源的CMC液体培养基中，置于摇床中，30℃，150r/min振荡培养7天。7天之后将培养液以10％接种到相同的液体培养基中，继续培养。3次富集培养之后，将菌液分别稀释至10^-3、10^-4、10^-5，划线培养于LB固体培养基中，5天之后挑取颜色、形态不相同的菌落进行纯化，并结合常规镜检方法进行分析，最终得到B3-1菌株。降解菌株的鉴定：(1)生理生化鉴定：将待测菌株接种于LB固体平板上，参照《微生物学实验》(赵斌，何绍江.2002.)和《Bergey′s Manualof Systematic Bacteriology(second edition)》(George MG，Julia AB，TimothyGL.2004.)进行鉴定。(2)16S rDNA鉴定：由于同一种、属间细菌的16S rDNA序列直接具有高度的保守性，所以 16S rDNA序列的同源性分析通常被用作细菌之间的系统分类。以各个菌株的总DNA为模板，采用PCR技术对降解群落中的纯培养菌株进行16S rDNA序列扩增，扩增引物采取通用引物： 27-F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492-R(5′-TACCTTGTTACGACTT-3′)(刘春光，杨峰山，卢星忠等.2010.)。PCR反应条件为：94℃ 5分钟；94℃ 1分钟，52℃ 1分钟，72℃ 2 分钟，30个循环；72℃ 10分钟，反应体系为25μL。将PCR纯化产物测序工作委托苏州金唯智公司完成，测序结果在Genbank数据库中进行BLAST同源性比较，通过16S rDNA分析，B3-1 被鉴定为Rahnella victoriana。

菌株B3-1降解效果测定：(1)水解圈直径与菌落直径比值的测定：将长出的菌落点接种到 CMC平板上在37℃条件下培养48小时，用1％的刚果红染色1小时，5％NaCl脱色1小时，观察并记录水解圈直径及菌落直径。(2)纤维素酶活力的测定：挑取单菌落于种子培养液中 37℃，170r/min振荡24小时，按照1％的接种量将降解纤维素细菌菌液接种到配置好的发酵培养液中于37℃，200r/min振荡培养36小时。摇培后取菌液2mL置于洁净的离心管中5000 r/min离心10分钟，用枪头轻轻地吸取上清液并转移到10mL的离心管中稀释10倍后作为纤维素酶的粗酶液，并用3，5-二硝基水杨酸法(DNS)在520nm处测定粗酶液的消光度。(3)降解纤维素细菌在室内模拟农田中降解效率的测定：选择一个透明缸，缸底部加入秸秆以及菌肥，上方覆盖厚度为10厘米的土样，经过72天后，将上层土倒出，露出秸秆层，取 15g未蘸土的秸秆，标为湿重(S)。打开加热台，在台上放上一张白纸，以免污染台面，将 15g重的秸秆铺在纸上。将加热台的温度设置为200℃，经观察，30分钟左右即可将15g秸秆烘干，将总重减去纸重即为干重(G)。在饭缸内将烘干的秸秆燃烧，称其总重量，燃烧后，将灰分倒掉，再测饭缸重量，总重量减去饭缸重量即为灰分重量(H)。干重减去灰分重量即为可燃有机物重量(K)，并按上述操作计算正常15g秸秆的可燃有机质含量，得一标准值(A)，最后计算秸秆分解率＝(A-K)/A。最终测定细菌降解纤维素的效率的平均值为86.37％。

本发明的有益效果为：本发明一株对纤维素具有良好降解效果的致胜拉恩菌，利用富集培养法，从黑龙江省大兴安岭地区漠河县采集的冻土中分离出菌株B3-1，此菌株B3-1可以在72天内将厚度为10厘米的秸秆充分降解。通过羧甲基纤维素钠平板直接分离出菌株B3-1，并通过生理生化和16S rDNA鉴定，将菌株B3-1被鉴定为Rahnella victoriana，降解实验表明，该菌株B3-1具有良好的纤维素降解效果。

菌株保藏信息：

菌种分类命名：Rahnella victoriana；

保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；

保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；

保藏日期：2018年11月30日；

保藏编号：CGMCC No.16847；

请求保藏人对其培养物指定的名称、株号或符号：B3-1；

该培养物的培养条件、检测存活条件(培养基成分、pH、温度等)：LB培养基；PH：7-9；温度：30℃；

该培养物由何处、何种基物分离得到：从黑龙江省大兴安岭地区漠河县采集的冻土中分离分离。

附图说明

下面结合附图对本发明进一步说明。

图1为一株对纤维素具有良好降解效果的致胜拉恩菌的16S rDNA测序结果图。

图2为一株对纤维素具有良好降解效果的致胜拉恩菌的菌株B3-1刚果红染色结果图。

图3为一株对纤维素具有良好降解效果的致胜拉恩菌的菌株B3-1基于16S rDNA序列构建的细菌邻位相接系统发育进化树。

具体实施方式

在本说明书的上下文中，除非特别指明否则本说明书所用的任何术语具有本领域技术人员在本领域中通常理解的含义，而未注明详细条件的实验方法是按照常规试验方法或按照供应商所建议的操作说明书进行的。

实施例一

1材料和方法

1.1实验仪器

TGL-16C高速离心机(上海安亭科学仪器厂)，FA2004电子天平(上海上平仪器有限公司)，P330-31超微量紫外分光光度计(Implen GmbH，Munich，Germany)，BOXUN立式压力蒸汽灭菌锅(上海博迅实业有限公司)，SW-CJ-IFD超净工作台(苏净集团苏州安泰空气技术有限公司)，微量移液器(Biotech)。

1.2材料

1.2.1供试土样

本实验所用的土样采集自黑龙江省大兴安岭地区漠河县采集的冻土(0-15厘米)。将土壤样品过20目筛以去除石块和植物碎屑，然后装入封口袋中4℃保存。

1.2.2试剂

3，5-二硝基水杨酸购自北京百奥莱科技有限公司，刚果红购自天津市河东区红岩试剂厂，其他常规试剂均为分析纯或更高纯度。

1.2.3培养基

LB培养基：青岛高科园海博生物科技有限公司。

羧甲基纤维素钠培养基(CMC)：CMC-Na 15.0g，NaCl 6.0g，酵母粉1.0g，(NH₄)₂SO₄2.0g，MgSO₄ 0.1g，KH₂PO₄ 0.1g，CaCl₂ 0.1g，K₂HPO₄ 0.5g，琼脂18g，蒸馏水1000mL，pH 7.0。

发酵培养基：酵母粉1.0％，NaCl 0.5％，蛋白胨1.0％，CMC-Na 1.0％，K₂HPO₄0.1％。

灭菌条件：120℃高压灭菌20分钟。

1.3降解菌的富集、驯化与分离

称取5g土样加入到100mL以羧甲基纤维素钠为唯一碳源的CMC液体培养基中，置于摇床中，30℃，150r/min振荡培养7天。7天之后将培养液以10％接种到相同的液体培养基中，继续培养。3次富集培养之后，将菌液分别稀释至10^-3、10^-4、10^-5，划线培养于LB固体培养基中，5天之后挑取颜色、形态不相同的菌落进行纯化。

1.4降解菌株的鉴定

1.4.1生理生化鉴定

将待测菌株接种于LB固体平板上，参照《微生物学实验》(赵斌，何绍江.2002.)和《Bergey′s Manual of Systematic Bacteriology(second edition)》(George MG，JuliaAB，Timothy GL.2004.) 进行鉴定。

1.4.2 16S rDNA鉴定

以各个菌株的总DNA为模板，采用PCR技术对降解群落中的纯培养菌株进行16SrDNA 序列扩增，扩增引物采取通用引物：27-F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492-R(5′-TACCTTGTTACGACTT-3′)(刘春光，杨峰山，卢星忠等.2010.)。PCR反应条件为：94℃5min：94℃ 1min，52℃ 1min，72℃ 2min，30个循环；72℃ 10min，反应体系为25μL。扩增的产物通过试剂盒(美国Axygen公司)回收，之后与pMD19-T载体(日本TaKaRa公司)连接，转化进大肠杆菌DH5α中，送到苏州金唯智公司进行测序，得到的结果通过Genbank进行同源性比对，从而确定到其分类地位。

1.5菌株B3-1降解效果测定

1.5.1水解圈直径与菌落直径比值的测定

将长出的菌落点种到CMC平板上在37℃条件下培养48小时，用1％的刚果红染色1小时，5％NaCl脱色1小时，观察并记录水解圈直径及菌落直径。

1.5.2纤维素酶活力的测定

挑取单菌落于种子培养液中37℃，170r/min振荡24小时，按照1％的接种量将降解纤维素细菌菌液接种到配置好的发酵培养液中于37℃，200r/min振荡培养36小时。摇培后取菌液2mL置于洁净的离心管中5000r/min离心10分钟，用枪头轻轻地吸取上清液并转移到10mL的离心管中稀释10倍后作为纤维素酶的粗酶液，并用3，5-二硝基水杨酸法(DNS)在520nm处测定粗酶液的消光度。

1.5.3降解纤维素细菌在室内模拟农田中降解效率的测定

选择一个透明缸，缸底部加入秸秆以及菌肥，上方覆盖厚度为10厘米的土样，经过72 天后，将上层土倒出，露出秸秆层，取15g未蘸土的秸秆，标为湿重(S)。打开加热台，在台上放上一张白纸，以免污染台面，将15g重的秸秆铺在纸上。将加热台的温度设置为200 ℃，经观察，30分钟左右即可将15g秸秆烘干，将总重减去纸重即为干重(G)。在饭缸内将烘干的秸秆燃烧，称其总重量，燃烧后，将灰分倒掉，再测饭缸重量，总重量减去饭缸重量即为灰分重量(H)。干重减去灰分重量即为可燃有机物重量(K)，并按上述操作计算正常15g秸秆的可燃有机质含量，得一标准值(A)，最后计算秸秆分解率＝(A-K)/A。最终测定细菌降解纤维素的效率的平均值为86.37％。

2结果和分析

2.1菌株B3-1的纯培养与分离

经过2个多月的纯化，观察到细菌能够在CMC平板长出来，挑取颜色、形态各不相同的菌落进行纯化，并结合常规镜检方法进行分析，最终得到B3-1菌株。

2.2生理生化实验鉴定

常规的细菌生理生化鉴定结果如表1所示。

表1：降解菌株B3-1的生理生化鉴定

2.3 16S rDNA基因序列分析

由于同一种、属间细菌的16S rDNA序列直接具有高度的保守性，所以16S rDNA序列的同源性分析通常被用作细菌之间的系统分类。通过16S rDNA分析，B3-1被鉴定为Rahnella victoriana。该菌株的16S rDNA序列的Blast结果和GenBank登录号如表2所示。

表2：B3-1菌株16S rDNA序列分类鉴定

2.4 B3-1菌株的纤维素酶降解特性

2.4.1水解圈直径与菌落直径比值的测定

将长出的菌落点种到CMC平板上在37℃条件下培养48小时，用1％的刚果红染色1小时，5％NaCl脱色1小时，观察并记录水解圈直径及菌落直径。

表3：B3-1菌株水解圈直径及菌落直径

2.4.2纤维素酶活力的测定

挑取单菌落于种子培养液中37℃，170r/min振荡24小时，按照1％的接种量将降解纤维素细菌菌液接种到配置好的发酵培养液中于37℃，200r/min振荡培养36小时。摇培后取菌液2mL置于洁净的离心管中5000r/min离心10分钟，用枪头轻轻地吸取上清液并转移到10mL的离心管中稀释10倍后作为纤维素酶的粗酶液，并用3，5-二硝基水杨酸法(DNS)在520nm处测定粗酶液的消光度。

表4：B3-1菌株纤维素酶活力

2.4.3降解纤维素细菌在室内模拟农田中降解效率的测定

选择一个透明缸，缸底部加入秸秆以及菌肥，上方覆盖厚度为10厘米的土样，经过72 天后，将上层土倒出，露出秸秆层，取15g未蘸土的秸秆，标为湿重(S)。打开加热台，在台上放上一张白纸，以免污染台面，将15g重的秸秆铺在纸上。将加热台的温度设置为200 ℃，经观察，30分钟左右即可将15g秸秆烘干，将总重减去纸重即为干重(G)。在饭缸内将烘干的秸秆燃烧，称其总重量，燃烧后，将灰分倒掉，再测饭缸重量，总重量减去饭缸重量即为灰分重量(H)。干重减去灰分重量即为可燃有机物重量(K)，并按上述操作计算正常15g秸秆的可燃有机质含量，得一标准值(A)，最后计算秸秆分解率＝(A-K)/A。最终测定细菌降解纤维素的效率的平均值为86.37％。

表5：B3-1菌株在室内模拟农田中降解效率

目前，已有多种降解纤维素的菌株被国内外研究人员从不同土壤中筛选出，虽然大多数菌株能够降解纤维素，但是，在通常情况下这些降解菌的降解效率都不是很高。本实验筛选出的降解纤维素菌株B3-1可以在72天内将纤维素充分降解，与降解纤维效果不好的菌株相比，具有明显的降解优势和实际价值。所以，降解纤维素菌株B3-1是一种重要的降解纤维素的菌株。本实验通过富集培养法，通过羧甲基纤维素钠培养基分离筛选出菌株B3-1，该菌株 B3-1可以在72天将秸秆充分降解。根据生理生化鉴定和16S rDNA序列分析，将菌株B3-1鉴定为Rahnella victoriana，保藏编号：CGMCC No.16847。

以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内，本发明要求保护范围由所附的权利要求书其等效物界定。

Claims (1)

1.一株对纤维素具有良好降解效果的致胜拉恩菌，一株对纤维素具有良好降解效果的致胜拉恩菌，利用富集培养法，从黑龙江省大兴安岭地区漠河县采集的冻土中分离出菌株B3-1，此菌株B3-1可以在72天内将厚度为10厘米的秸秆充分降解。通过羧甲基纤维素钠平板直接分离出菌株B3-1，并通过生理生化和16S rDNA鉴定，将菌株B3-1被鉴定为Rahnellavictoriana，降解实验表明，该菌株B3-1具有良好的纤维素降解效果；

菌株保藏信息：

菌种分类命名：致胜拉恩菌(Rahnella victoriana)；

保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；

保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；

保藏日期：2018年11月30日；

保藏编号：CGMCC No.16847。

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