CN110639038A - 利用核黄素光化学法灭活血液成分病原体的设备及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了利用核黄素光化学法灭活血液成分病原体的方法,利用核黄素光化学法灭活血液成分病原体的方法:包括以下步骤:步骤S1:将浓度为50μmol/L核黄素溶液添加到血液产品中得到新的血液;步骤S2:将血液制品转移到光照中,通过氮气循环系统清除血液成分中溶解的氧气,减少氧自由基的产生;步骤S3:将得到新的血液暴露在波峰为309nm‑313nm的窄谱紫外光下,激发核黄素发生电子转移,损伤血液成分中的DNA和RNA,达到灭活病原体和淋巴细胞的目的;利用核黄素光化学法灭活血液成分病原体的设备,包括光照前处理设备、光照设备和产品储存设备;解决了目前输血面临的传播病原体风险和白细胞污染风险的问题。
Description
技术领域
本发明涉及核黄素光化学法灭活血液成分病原体领域,特别是利用核黄素光化学法灭活血液成分病原体的设备及方法。
背景技术
随着血液病原体检测技术的发展,输血感染风险大大降低,但病原体检测窗口期依然存在、目前常规检测方法不能覆盖所有已知经血传播病原体,新发、再发经血传播病原体依旧威胁着输血安全,特别是血小板(PLT)常规储存在20-24℃条件下,细菌污染风险更高,持续稳定的血源性细菌污染成为了对血液供应机构威胁最大的因素。发展病原体灭活技术可以有效降低输血感染风险,目前具有发展前景的血液病原体灭活技术主要有补骨脂素和核黄素,均可用于血浆、血小板和红细胞病原体灭活。补骨脂素可能存在基因毒性,因此使用后需要去除。而核黄素(维生素B2)是人体必须的天然维生素,其分解产物本身广泛存在于人体血液和组织中,并且具有天然的光化学反应,使用后不需去除,被广泛应用于血液成分病原体灭活中。
发明内容
为解决现有技术中存在的问题,本发明提供了利用核黄素光化学法灭活血液成分病原体的设备及方法,解决了目前输血面临的传播病原体风险和白细胞污染风险的问题。
本发明提供了利用核黄素光化学法灭活血液成分病原体的方法,包括以下步骤:
步骤S1:将浓度为50μmol/L核黄素溶液添加到血液产品中得到新的血液;
步骤S2:将血液制品转移到光照袋中,通过氮气循环系统清除血液成分中溶解的氧气,减少氧自由基的产生;
步骤S3:将得到新的血液暴露在波峰为309-313nm的窄谱紫外光下,激发核黄素发生电子转移,损伤血液成分中的DNA和RNA,达到灭活病原体和淋巴细胞的目的;
步骤S4:将处理后的血液制品转移到常规血液保存袋中保存或直接用于临床输入。
优选地,核黄素光化学法灭活血液成分病原体的方法用于新鲜血浆、新鲜冰冻血浆、冰冻血浆、冷沉淀、单采血小板、手工血小板、分离红细胞和全血;
核黄素光化学法灭活血液成分病原体的方法处理血浆和血小板温度控制范围为20-24℃。
优选地,步骤S1采用309-313nm窄谱紫外光,用于集中具有良好病原体灭活效果的紫外光,提高病原体灭活效果,减少光照能量需求,和降低其他病原体灭活效果较差的紫外光对血液成分的损伤。
优选地,步骤S2包括以下子步骤:
S21:由于不同光照袋在相同光照条件下具有不同的透光率,相同光照袋在不同紫外灯光照条件下不同,为了具有良好的病原体灭活效果同时不会明显增加对血液成分质量的损伤,采用具有良好透光率、透气性较差,同时具有良好生物相容性的压延膜作为该病原体灭活技术的光照袋;
S22:将惰性气体通过氮气循环系统,调节气体流量和压强排除血液成分中游离和溶解的氧气;
S23:采用密封的方法隔离氧气。
优选地,步骤S3的病原体灭活效果与光照能量呈正相关,血液成分质量与光照能量呈负相关;
不同血液成分需要不同的光照能量,分离红细胞和全血的光照能量大于血小板和血浆;而光照时间与紫外灯功率相关,紫外灯功率越大,光照时间越短,平衡血液制品质量和病原体灭活效果后,血小板光照时间范围5-40min为最佳,光照能量0.4J/ml-3J/ml为最佳。
优选地,利用核黄素光化学法灭活血液成分病原体的设备,包括光照前处理设备、光照设备和产品储存设备;
光照前处理设备包括光照袋,核黄素保存袋、无菌接驳器和氮气循环系统,光照设备包括光照灭活仪器、扫码抢、条码打印机、结果打印机、天平、数据采集、储存和分析软件和设备;
产品储存设备为常规的血液成分储存设备。
本发明利用核黄素光化学法灭活血液成分病原体的设备及方法的有益效果如下:
本发明提高病原体灭活效果,降低病原体灭活处理对血液成分的损伤。
附图说明
图1为本发明利用核黄素光化学法灭活血液成分病原体的设备及方法的氮气循环系统图
图2为本发明利用核黄素光化学法灭活血液成分病原体的设备及方法的光照设备图
图3为本发明利用核黄素光化学法灭活血液成分病原体的设备及方法的核黄素浓度相同时不同波长紫外光光照不同时间大肠杆菌灭活量TCID50折线图(n=5)
图4为本发明利用核黄素光化学法灭活血液成分病原体的设备及方法的光照袋和核黄素保存袋图
图5为本发明利用核黄素光化学法灭活血液成分病原体的设备及方法的方法流程图
附图标记:1-血袋融合边缘、2-血袋挂扣、3-血袋储血室、4-血液引入口、5-核黄素引入口、6-氮气机、7-真空机、8-氮气输入管道、9-氮气吸出管、10-膜过滤器(阻止液体被抽出)、11-空气膜过滤器(阻止氮气中带有的细菌等污染物进入血袋)、12-光照袋空气出口、13-光照袋氮气入口、14-光照袋内氮气输入管、41-核黄素保存袋、42-核黄素保存袋挂扣、43-核黄素保存袋封边、44-核黄素溶液注入口盲端、45-核黄素溶液流出口,46-光照袋血液成分引入口和流出口、47-氮气接入口、48-氮气吸出口、49-光照袋。
具体实施例
下面对本发明的具体实施方式进行描述,以便于本技术领域的技术人员理解本发明,但应该清楚,本发明不限于具体实施方式的范围,对本技术领域的普通技术人员来讲,只要各种变化在所附的权利要求限定和确定的本发明的精神和范围内,这些变化是显而易见的,一切利用本发明构思的发明创造均在保护之列。
如图5所示,一种核黄素和紫外光灭活病原体的方法,主要操作步骤是核黄素溶液(浓度为50μmol/L)添加到血液产品中,然后暴露在窄谱(309nm-313nm)紫外光下,激发核黄素发生电子转移,损伤血液成分中的DNA和RNA,达到灭活病原体和淋巴细胞的目的,并通过氮气循环系统清除血液成分中溶解的氧气,减少氧自由基的产生,可以提高损伤病原体核酸的特异性,降低对血液成分的损伤,核黄素是人体必须的维生素,安全无毒性,使用后不需要去除,因此,核黄素和紫外光处理后的血液制品可以立即用于临床输注或常规保存。
核黄素和紫外光灭活病原体设备和耗材
核黄素和紫外光病原体灭活技术的设备包括光照前处理设备和耗材、光照设备、产品储存设备和耗材等,其中光照前处理部分包括光照袋,核黄素保存袋、无菌接驳器,氮气循环系统等;光照设备是该病原体灭活实验体系的核心,包括光照灭活仪器,扫码抢,条码打印机,结果打印机,天平,数据采集、储存和分析软件和设备等(如图1所示);产品储存设备是常规的血液成分储存设备,如4℃和-20℃/-40℃/-80℃冰箱,血小板保存箱等,血液保存袋与目前常规使用的保存袋相同。
本发明发现在相同的光照能量条件下(0.4J/ml-3J/ml),波峰为311nm的紫外光具有良好的病原体灭活效果,对血小板和血浆病无明显损伤,而波峰为254nm和365nm紫外光病原体灭活效果较差。
本发明的步骤S3采用309-313nm窄谱紫外光,集中具有良好病原体灭活效果的紫外光,提高病原体灭活效果,减少了光照能量需求;且降低了其他病原体灭活效果较差的紫外光对血液成分的损伤。
本发明发现病原体灭活效果与光照能量呈正相关,血液成分与光照能量呈负相关,不同血液成分需要不同的光照能量,分离红细胞和全血的光照能量大于血小板和血浆;而光照时间与紫外灯功率相关,紫外灯功率越大,光照时间越短,平衡血液制品质量和病原体灭活效果后,血小板光照时间范围5-40min为最佳,光照能量为0.4J/ml-3J/ml最佳。
本发明发现不同光照袋在相同光照条件下具有不同的透光率,相同光照袋在不同紫外灯光照条件下不同,我们采用了具有良好透光率、透气性较差和良好具有生物相容性的压延膜作为该病原体灭活技术的光照袋。具有良好的病原体灭活效果,同时不会明显增加对血液成分质量的损伤。
本发明发现核黄素光化学法病原体灭活条件中去除氧气可以提高病原体灭活的靶向性,可以提高损伤病原体核酸的特异性,降低对血液成分的损伤;本发明采用惰性气体排除空气,最后密封的方法隔离氧气。
本发明处理血浆和血小板温度控制范围为20-24℃。
本发明采用的核黄素病原体灭活方法可用于新鲜血浆、新鲜冰冻血浆、冰冻血浆、冷沉淀、单采血小板、手工血小板。
本发明中的设备包括以下几部分:
1.氮气循环系统
氮气循环系统包括氮气机(BDL-100L)、氮气输出管、空气过滤器和抽真空设备。
使用氮气循环系统的原理:核黄素光化学反应有两种,一种是无氧参与的Ⅰ型反应,Ⅰ型反应为通过质子、电子进行能量转化的反应,核黄素可以插入DNA的双螺旋中通过量子激发变为三线态并将能量转移至核酸,能量在DNA链条中转移至氧化还原电势最低的腺嘌呤A并破坏其结构;部分核黄素经过反应后可回到初始状态,相当于在反应中起催化剂的作用,该反应具有良好的病原体灭活效果,且减少对血液成分具有损伤作用的氧自由基产生量,减少对血液成分的损伤。而Ⅱ型反应为直接通过能量转移并有氧参与的反应,该反应对病原体的灭活特异性不佳,产生的大量氧自由基离子造成对蛋白质和细胞成分损伤。因此实际操作中需要去除血液成分中溶解的氧气。我们的解决方案是样本在光照前进行如下图1所示的处理。
如图1所示,1为血袋融合边缘,2为血袋挂扣,3为血袋储血处,4为血液引入口,5为核黄素引入口,6为氮气机,7为真空机,8为氮气输入管道,9为氮气输出管,10为膜过滤器(阻止液体被抽出),11为空气膜过滤器(阻止氮气中带有的细菌等污染物进入血袋),12为光照袋空气出口,13为光照袋氮气入口,14为光照袋内氮气输入管(使用后可抽出)。
使用说明:核黄素和血液成分通过无菌接驳机分别由核黄素引入口5和血液引入口4转移到光照袋中。氮气机1分离出空气中的氮气,纯度高达99.9%。氮气从输入管道8,经过滤11后进入光照袋氮气入口13,并通过光照袋内氮气输入管14不断流入光照袋内液面下,氮气从血液成分液面下向上自由溢出,并从光照袋内空气出口12由真空泵7吸出或自由排除,在氮气吸出管9和光照袋空气出口12之间有滤过膜,仅允许气体被吸出,血液成分则不能吸出。该循环过程可以去除大部分溶解在血液成分和血袋中的氧气。血袋挂扣2用于操作过程中固定光照血袋。
相关参数:
氮气纯度:99-99.99%(可调控)
氮气压力:0.1-0.6mpa(可调控)
氮气产量:0.5-0.9Nm3/h(可调控)
氮气流量:依据血袋大小调节
2.光照设备
光照设备如下图2所示,其主要特点是实现了自动化、智能化、人性化的操作流程和全面的信息管理和监控。
如图2所示,21为光照设备,22为扫码器,23为电称板,24为设备调试和控制软件,25为光照袋,26为载物台,27为条码打印机,28为光照设备信息采集和监控软件,29为结果打印机。
操作说明:先用扫码器22扫描装有血液成分的血袋条码,由电称板23称量血液成分重量,依据血液成分的密度,仪器软件24自动计算核黄素加入量和紫外光光照剂量,结果由条码打印机27自动打印,工作人员将条码信息贴到光照袋上,然后将血液成分转移到光照袋内,依据上述结果加入核黄素溶液;经过氮气循环系统如图2所示去除氧气光照袋中游离氧和溶解氧后,由扫码器22扫描光照血袋上述条码和血袋条码,并将光照袋25放置在载物台上26,点击仪器开始键24,光照设备21依据计算结果完成光照处理。光照处理过程的时间、时长、温度、光照波长、光照能量,血袋编码和核黄素溶液最终浓度由光照设备信息采集和监控软件28采集。
光照设备信息采集和监控软件28对仪器具有严格的监控和预警作用,监控软件实时监控仪器设备状况,包括仪器震荡频率、温度、光照时间和光照强度、设备周围辐射强度、湿度等,当仪器设备状况超出安全范围时会显示错误信息并报警。信息采集软件采集的信息将会自动传送到血液操作处理信息库里,便于信息的集中化管理和应用。
3.紫外光
如图3所示,依据目前已有研究,对病原体灭活效果最好的紫外光波峰为254nm、313nm和365nm。目前用于血液成分病原体灭活的紫外光多为宽谱紫外光。使用的光照能量为6.57J/ml,对血小板质量有较显著的影响。本专利中光照设备所采用的紫外光为具有特殊要求的窄谱紫外光,波长范围为309nm-313nm,波峰为311nm,主要用于灭活血浆和血小板中的病原体,降低了光照能量需求,增强了病原体灭活效果,且不增加对血液成分的损伤。
表1不同光谱和光照能量对病原体灭活效果的比较
表1展示了使用311nm窄谱紫外光降低了病原体灭活所需的光照能量。
表2 311nm紫外光对不同病原体的灭活效果
表2展示了311nm窄谱紫外光对多种病原体具有良好的灭活效果
表3 311nm紫外光和常规宽谱紫外光对血小板各参数影响的比较
表3展示了311nm窄谱紫外光不增加对血小板质量的损伤。
4.光照袋和核黄素袋的特点
不同光照袋在相同光照条件下具有不同的透光率,相同光照袋在不同紫外灯光照条件下不同,我们采用了具有良好透光率、透气性较差、同时具有良好生物相容性的压延膜作为该病原体灭活技术的光照袋。具有良好的病原体灭活效果,同时不会明显增加对血液成分质量的损伤。
通过核黄素保存袋、光照袋、血液成分保存袋联袋和无菌接驳器的应用,避免了操作中的病原体污染,节约了操作时间,减少血小板转移过程的丢失量
41为核黄素保存袋,42为核黄素保存袋挂扣,43为核黄素保存袋封边,44为核黄素溶液注入口盲端,45为核黄素溶液流出口,46为光照袋血液成分引入口和流出口,47为氮气接入口,48为氮气吸出口,49为光照袋。
如图4所示,光照袋由光照袋内腔49、氮气出口48(具有可以将氮气导入到血袋底部血液成分液面下的导气管,通气结束后可将其抽出),氮气入口47、核黄素和血液成分引入口45、46组成,其中血液成分引入口和流出口可经一个口进出46,也可以分开为两个独立的接口。光照袋上有挂扣如图4的42,便于固定血袋。光照袋使用生物相容性塑料制作而成,目前使用的主要是压延膜和吹塑膜制作而成。核黄素保存袋如图4所示,主要组成部分有核黄素溶液容纳腔41(总容量为50ml,实际容量为20-40ml),核黄素保存袋挂扣42便于固定血袋,注入核黄素溶液时产生的盲端44,核黄素溶液流出口45等组成,核黄素保存袋可直接与光照袋相连,也可以不相连。核黄素保存袋周边有密封边,保持袋内密封和无菌状态。
操作说明
制备好的核黄素由核黄素溶液注入口44引入,在袋中经过消毒灭菌后密封避光保存。核黄素溶液保存袋在制作过程中可与光照袋49通过将核黄素溶液流出口45和光照袋上的核黄素引入口连接,也可以单独制作保存,需要使用时用无菌接驳器连接。核黄素引入到光照袋后需将核黄素保存袋去除,防止核黄素保存袋影响血液成分接受的光照。核黄素保存袋挂扣便于核黄素转移时固定袋子。光照袋血液成分引入口和流出口是一个较长的盲端管子,最先通过无菌接驳器与装有血液成分的血袋连接,将血液转移到光照袋后热合密封,光照结束后再从该管通过无菌接驳器与血液成分保存袋连接,将血液成分转移到标准保存袋中保存或直接供临床使用。考虑到光照袋制作时与血液成分保存袋连接虽然使操作变得便捷、避免了操作中造成的污染,但考虑到与光照袋连接的血液成分保存袋可能会影响血液成分接受到的光照,因此实际操作中建议光照袋制作过程中不与保存袋连接。但光照袋与保存袋连接在本专利保护范围内。光照袋具体构造与描述如图4所示。
核黄素保存袋使用生物相容性塑料膜材料(PVC)制作而成,具有较差的透气性,外有避免光照射锡箔等避光材料包装。光照袋使用具有良好的生物相容性,透光性较好,透气性较差压延膜材料制作而成。
Claims (6)
1.利用核黄素光化学法灭活血液成分病原体的方法,其特征在于,包括以下步骤:
步骤S1:将浓度为50μmol/L核黄素溶液添加到血液产品中得到新的血液;
步骤S2:将血液制品转移到光照袋中,通过氮气循环系统清除血液成分中溶解的氧气,减少氧自由基的产生;
步骤S3:将得到新的血液暴露在波峰为309nm-313nm的窄谱紫外光下,激发核黄素发生电子转移,损伤血液成分中的DNA和RNA,达到灭活病原体和淋巴细胞的目的;
步骤S4:将处理后的血液制品转移到常规血液保存袋中保存或直接用于临床输入。
2.根据权利要求1所述的利用核黄素光化学法灭活血液成分病原体的方法,其特征在于,所述核黄素光化学法灭活血液成分病原体的方法用于新鲜血浆、新鲜冰冻血浆、冰冻血浆、冷沉淀、单采血小板、手工血小板、分离红细胞和全血;
所述核黄素光化学法灭活血液成分病原体的方法处理血浆和血小板的温度控制范围为20-24℃。
3.根据权利要求1所述的利用核黄素光化学法灭活血液成分病原体的方法,其特征在于,所述步骤S1采用309nm-313nm窄谱紫外光,用于集中具有良好病原体灭活效果的紫外光,提高病原体灭活的效果,减少了光照能量的需求,和降低了其他病原体灭活效果较差的紫外光对血液成分的损伤。
4.根据权利要求1所述的利用核黄素光化学法灭活血液成分病原体的方法,其特征在于,所述步骤S2包括以下子步骤:
S21:由于不同光照袋在相同光照条件下具有不同的透光率,相同光照袋在不同紫外灯光照条件下不同,为了具有良好的病原体灭活效果同时不会明显增加对血液成分质量的损伤,采用具有良好透光率、透气性较差,同时具有良好生物相容性的压延膜作为该病原体灭活技术的光照袋;
S22:将惰性气体通过氮气循环系统,调节气体流量和压强排除血液成分中游离和溶解的氧气;
S23:采用密封的方法隔离氧气。
5.根据权利要求1所述的利用核黄素光化学法灭活血液成分病原体的方法,其特征在于,所述步骤S3的病原体灭活效果与光照能量呈正相关,血液成分质量与光照能量呈负相关;
不同血液成分需要不同的光照能量,分离红细胞和全血的光照能量大于血小板和血浆;而光照时间与紫外灯功率相关,紫外灯功率越大,光照时间越短,平衡血液制品质量和病原体灭活效果后,血小板光照时间范围5-40min为最佳,光照能量范围0.4J/ml-3J/ml为最佳。
6.利用核黄素光化学法灭活血液成分病原体的设备,其特征在于,包括光照前处理设备、光照设备和产品储存设备;所述光照前处理设备包括光照袋,核黄素保存袋、无菌接驳器和氮气循环系统;所述光照设备包括光照灭活仪器、扫码抢、条码打印机、结果打印机、天平、数据采集、储存和分析软件和设备;所述产品储存设备为常规的血液成分储存设备。
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