CN115948380A - 一种免疫细胞的处理方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及细胞的处理方法,具体涉及一种免疫细胞的处理方法。使用本发明所述处理方法处理免疫细胞,例如淋巴细胞,可以促进免疫细胞凋亡,调节免疫细胞分泌细胞因子的水平,且激发后的核黄素对不同亚型的免疫细胞(如T细胞、B细胞和NK细胞)的调节作用具有选择性,可以用于治疗免疫相关疾病。
Description
技术领域
本发明涉及细胞的处理方法,具体涉及一种免疫细胞的处理方法。
背景技术
核黄素光化学法作为一种新型的血液病原体灭活方法,可以灭活血浆、血小板以及全血中的病毒、细菌以及疟原虫,其效果在临床使用中也得到了验证。除了灭活血液成分中的病原体外,利用核黄素光化学法还可以灭活淋巴细胞。使其失活从而达到预防输血相关移植物抗宿主病(TA-GVHD)的目的。
但是,目前现有技术中的核黄素光化学法均为将待处理样本和核黄素混合后加入光照袋,或,将待处理样本和核黄素分别加入一个光照袋内混合后进行光照激发处理。
发明内容
本申请所述的处理方法先利用光照激发核黄素,然后再与待处理样本混合,避免了光照对待处理样本的直接影响,并且能够产生促进免疫细胞凋亡、调节免疫细胞分泌功能(例如IL-1β、IL-10和TNF-α细胞因子的分泌量)的效果,还发现本申请所述的处理方法对T细胞和B细胞的影响不同,说明激发后的核黄素对不同免疫细胞的作用有差异或者说不同免疫细胞对这种处理方法的耐受性有差异,这种差异作用特性有望用于治疗相应的免疫系统疾病。
进一步的,现有技术中处理血液采用血液与核黄素混合后光照的方式,可以杀灭细菌、病毒等,而本申请重点在于光照激发核黄素后对血液处理,且从实验结果可知,该条件下光照激发的核黄素可以调节免疫细胞,却不能杀灭细菌。
本发明的第一方面,提供了一种免疫细胞的处理方法,所述的处理方法包括将核黄素经光照激发后,与免疫细胞混合。
优选的,所述的光照激发包括使用可见光和/或不可见光。
优选的,所述的光照激发使用的光照的波长为190-480nm。
优选的,所述的可见光包括但不限于蓝光(400-480nm)。
优选的,所述的不可见光包括但不限于紫外光。
进一步优选的,所述的紫外光包括但不限于UVA(315-400nm)、UVB(280-315nm)和/或UVC(190-280nm)。
在本发明的一个具体实施方式中,所述的光照激发包括使用蓝光。
在本发明的一个具体实施方式中,所述的光照激发包括使用UVA。
在本发明的一个具体实施方式中,所述的光照激发包括使用UVB。
在本发明的一个具体实施方式中,所述的光照激发包括使用UVC。
在本发明的一个具体实施方式中,所述的光照激发包括使用UVA和UVB。
在本发明的一个具体实施方式中,所述的光照激发包括使用UVA和UVC。
在本发明的一个具体实施方式中,所述的光照激发包括使用UVB和UVC。
在本发明的一个具体实施方式中,所述的光照激发包括使用UVA、UVB和UVC。
在本发明的一个具体实施方式中,所述的光照激发包括使用蓝光、UVA。
在本发明的一个具体实施方式中,所述的光照激发包括使用蓝光、UVB。
在本发明的一个具体实施方式中,所述的光照激发包括使用蓝光、UVC。
在本发明的一个具体实施方式中,所述的光照激发包括使用蓝光、UVA、UVB。
在本发明的一个具体实施方式中,所述的光照激发包括使用蓝光、UVA、UVC。
在本发明的一个具体实施方式中,所述的光照激发包括使用蓝光、UVB、UVC。
在本发明的一个具体实施方式中,所述的光照激发包括使用蓝光、UVA、UVB和UVC。
优选的,将核黄素配置为0.01-8000μM中任一数值,优选为50-3200μM,进一步优选为50-1600μM中任一数值,例如0.01、1、10、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、1600、2000、2500、3000、3200、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500或8000μM的浓度后,进行光照激发。
优选的,所述的光照激发包括使用0.01-100J/cm2的光照强度进行激发,例如0.01、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100J/cm2。
根据具体实施方式的需要,随着核黄素浓度的提高,光照激发所需的光照强度也随之增加。每0.4μmol的核黄素需要0.01-100J/cm2的光照强度激发,例如0.01、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100J/cm2。
根据具体实施方式的需要,核黄素可以通过现有技术中任一方式进行稀释,例如生理盐水或血浆进行稀释。
优选的,所述的免疫细胞包括但不限于淋巴细胞、树突状细胞、单核/巨噬细胞、粒细胞、肥大细胞中的一种或两种以上的组合。
在本发明的一个具体实施方式中,所述的免疫细胞为淋巴细胞。
优选的,所述的处理方法包括将核黄素经光照激发后,与样本混合。
在本发明的一个具体实施方式中,所述的处理方法包括:将核黄素稀释后进行光照激发,然后与样本混合。
优选的,所述的样本包括但不限于全血、红细胞、血小板、血浆或免疫细胞悬液。
根据具体实施方式的需要,核黄素可以通过现有技术中任一方式进行稀释,例如使用生理盐水或血浆进行稀释。
在本发明的一个具体实施方式中,所述的处理方法包括将核黄素稀释至50-1600μM后经光照激发,处理1×106-1×108个免疫细胞。
优选的,所述的光照激发的剂量为0.1-50J/cm2,例如0.01、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、45、50J/cm2。
在本发明的一个具体实施方式中,所述的处理方法包括将核黄素稀释至50-1600μM后加入光照袋中,以0.1-50J/cm2(例如0.01、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、45、50J/cm2)的剂量进行光照激发,处理1×106-1×108个免疫细胞。
本发明的第二方面,提供了一种血液的处理方法。
优选的,所述的处理方法包括将核黄素经光照激发后,与血液混合。
优选的,对光照激发的限定同本发明第一方面。
优选的,所述的血液中包含免疫细胞。
优选的,所述的血液包括但不限于全血、红细胞、血小板或血浆。
根据具体实施方式的需要,所述的血液可以是体内的,也可以是体外的。
本发明的第三方面,提供了一种核黄素衍生物。
优选的,所述的核黄素衍生物为通过将核黄素进行光照激发后获得。
优选的,对光照激发的限定同本发明第一方面。
本发明的第四方面,提供了一种核黄素衍生物的制备方法。
优选的,所述的制备方法包括将核黄素进行光照激发。
优选的,对光照激发的限定同本发明第一方面。
本发明的第五方面,提供了一种药物,所述的药物包括经光照激发后的核黄素,和/或,上述第三方面所述的核黄素衍生物,和/或,上述第四方面所述的制备方法获得的核黄素衍生物。
优选的,对光照激发的限定同本发明第一方面。
优选的,所述的药物可以为人用药或兽用药。
本发明的第六方面,提供了一种药物的制备方法,所述的制备方法包括将核黄素进行光照激发。
优选的,对光照激发的限定同本发明第一方面。
优选的,所述的药物为第五方面所述的药物。
本发明的第七方面,提供了一种光照激发后的核黄素在调节免疫细胞功能中的应用。
优选的,所述的应用包括将核黄素经光照激发后,与免疫细胞混合。
优选的,对光照激发的限定同本发明第一方面。
优选的,所述的免疫细胞包括但不限于淋巴细胞、树突状细胞、单核/巨噬细胞、粒细胞、肥大细胞中的一种或两种以上的组合。
在本发明的一个具体实施方式中,所述的免疫细胞为淋巴细胞。
优选的,所述的免疫细胞功能包括但不限于分泌细胞因子的功能。
在本发明的一个具体实施方式中,所述的细胞因子包括IL-1β、IL-10、TNF-α。
本发明的第八方面,提供了一种光照激发后的核黄素在制备调节免疫细胞功能的产品中的应用。
优选的,对光照激发的限定同本发明第一方面。
优选的,所述的免疫细胞包括但不限于淋巴细胞、树突状细胞、单核/巨噬细胞、粒细胞、肥大细胞中的一种或两种以上的组合。
在本发明的一个具体实施方式中,所述的免疫细胞为淋巴细胞。
优选的,所述的免疫细胞功能包括但不限于分泌细胞因子的功能。
在本发明的一个具体实施方式中,所述的细胞因子包括IL-1β、IL-10、TNF-α。
本发明的第九方面,提供了一种调节血液中免疫细胞功能的方法。
优选的,所述的方法包括将核黄素经光照激发后,加入血液中。
优选的,对光照激发的限定同本发明第一方面。
优选的,所述的血液包括但不限于全血、红细胞、血小板或血浆。
根据具体实施方式的需要,所述的血液可以是体内的,也可以是体外的。
优选的,所述的免疫细胞包括但不限于淋巴细胞、树突状细胞、单核/巨噬细胞、粒细胞、肥大细胞中的一种或两种以上的组合。
在本发明的一个具体实施方式中,所述的免疫细胞为淋巴细胞。
优选的,所述的免疫细胞功能包括但不限于分泌细胞因子的功能。
在本发明的一个具体实施方式中,所述的细胞因子包括IL-1β、IL-10、TNF-α。
本发明的第十方面,提供了一种光照激发后的核黄素在制备调节血液中免疫细胞功能的产品中的应用。
优选的,对光照激发的限定同本发明第一方面。
优选的,所述的血液包括但不限于全血、红细胞、血小板或血浆。
根据具体实施方式的需要,所述的血液可以是体内的,也可以是体外的。
优选的,所述的免疫细胞包括但不限于淋巴细胞、树突状细胞、单核/巨噬细胞、粒细胞、肥大细胞中的一种或两种以上的组合。
在本发明的一个具体实施方式中,所述的免疫细胞为淋巴细胞。
优选的,所述的免疫细胞功能包括但不限于分泌细胞因子的功能。
在本发明的一个具体实施方式中,所述的细胞因子包括IL-1β、IL-10、TNF-α。
本发明的第十一方面,提供了一种调节样本中免疫细胞功能的方法。
优选的,所述的方法包括将核黄素经光照激发后,加入样本中。
优选的,对光照激发的限定同本发明第一方面。
优选的,所述的样本包括但不限于全血、红细胞、血小板、血浆或免疫细胞悬液。
优选的,所述的免疫细胞包括但不限于淋巴细胞、树突状细胞、单核/巨噬细胞、粒细胞、肥大细胞中的一种或两种以上的组合。
在本发明的一个具体实施方式中,所述的免疫细胞为淋巴细胞。
优选的,所述的免疫细胞功能包括但不限于分泌细胞因子的功能。
在本发明的一个具体实施方式中,所述的细胞因子包括IL-1β、IL-10、TNF-α。
本发明的第十二方面,提供了一种光照激发后的核黄素在制备调节样本中免疫细胞功能的产品中的应用。
优选的,对光照激发的限定同本发明第一方面。
优选的,所述的样本包括但不限于全血、红细胞、血小板、血浆或免疫细胞悬液。
优选的,所述的免疫细胞包括但不限于淋巴细胞、树突状细胞、单核/巨噬细胞、粒细胞、肥大细胞中的一种或两种以上的组合。
在本发明的一个具体实施方式中,所述的免疫细胞为淋巴细胞。
优选的,所述的免疫细胞功能包括但不限于分泌细胞因子的功能。
在本发明的一个具体实施方式中,所述的细胞因子包括IL-1β、IL-10、TNF-α。
本发明的第十三方面,提供了一种促进血液中免疫细胞凋亡或者灭活血液中免疫细胞的方法。
优选的,所述的方法包括将核黄素经光照激发后,加入血液中。
优选的,对光照激发的限定同本发明第一方面。
优选的,所述的血液包括但不限于全血、红细胞、血小板或血浆。
根据具体实施方式的需要,所述的血液可以是体内的,也可以是体外的。
优选的,所述的免疫细胞包括但不限于淋巴细胞、树突状细胞、单核/巨噬细胞、粒细胞、肥大细胞中的一种或两种以上的组合。
在本发明的一个具体实施方式中,所述的免疫细胞为淋巴细胞。
在本发明的一个具体实施方式中,所述的促进血液中免疫细胞凋亡或者灭活血液中免疫细胞为促进血液中淋巴细胞(T细胞和/或B细胞)凋亡,或者,灭活血液中的淋巴细胞(T细胞和/或B细胞)。且光照激发后的核黄素对T细胞和B细胞的影响不同,说明激发后的核黄素对不同免疫细胞有选择的作用。
本发明的第十四方面,提供了一种光照激发后的核黄素在制备促进血液中免疫细胞凋亡或者灭活血液中免疫细胞的产品中的应用。
优选的,对光照激发的限定同本发明第一方面。
优选的,所述的血液包括但不限于全血、红细胞、血小板或血浆。
根据具体实施方式的需要,所述的血液可以是体内的,也可以是体外的。
优选的,所述的免疫细胞包括但不限于淋巴细胞、树突状细胞、单核/巨噬细胞、粒细胞、肥大细胞中的一种或两种以上的组合。
在本发明的一个具体实施方式中,所述的免疫细胞为淋巴细胞。
在本发明的一个具体实施方式中,所述的促进血液中免疫细胞凋亡或者灭活血液中免疫细胞为促进血液中淋巴细胞(T细胞和/或B细胞)凋亡,或者,灭活血液中的淋巴细胞(T细胞和/或B细胞)。且光照激发后的核黄素对T细胞和B细胞的影响不同,说明激发后的核黄素对不同免疫细胞有选择的作用。
本发明的第十五方面,提供了一种促进样本中免疫细胞凋亡或者灭活样本中免疫细胞的方法。
优选的,所述的方法包括将核黄素经光照激发后,加入样本中。
优选的,对光照激发的限定同本发明第一方面。
优选的,所述的样本包括但不限于全血、红细胞、血小板、血浆或免疫细胞悬液。
在本发明的一个具体实施方式中,所述的样本为免疫细胞悬液。
优选的,所述的免疫细胞包括但不限于淋巴细胞、树突状细胞、单核/巨噬细胞、粒细胞、肥大细胞中的一种或两种以上的组合。
在本发明的一个具体实施方式中,所述的免疫细胞为淋巴细胞。
在本发明的一个具体实施方式中,所述的促进样本中免疫细胞凋亡或者灭活样本中免疫细胞为促进样本中淋巴细胞(T细胞和/或B细胞)凋亡,或者,灭活样本中的淋巴细胞(T细胞和/或B细胞)。且光照激发后的核黄素对T细胞和B细胞的影响不同,说明激发后的核黄素对不同免疫细胞有选择的作用。
本发明的第十六方面,提供了一种光照激发后的核黄素在制备促进样本中免疫细胞凋亡或者灭活样本中免疫细胞的产品中的应用。
优选的,对光照激发的限定同本发明第一方面。
优选的,所述的样本包括但不限于全血、红细胞、血小板、血浆或免疫细胞悬液。
在本发明的一个具体实施方式中,所述的样本为免疫细胞悬液。
优选的,所述的免疫细胞包括但不限于淋巴细胞、树突状细胞、单核/巨噬细胞、粒细胞、肥大细胞中的一种或两种以上的组合。
在本发明的一个具体实施方式中,所述的免疫细胞为淋巴细胞。
在本发明的一个具体实施方式中,所述的促进样本中免疫细胞凋亡或者灭活样本中免疫细胞为促进样本中淋巴细胞(T细胞和/或B细胞)凋亡,或者,灭活样本中的淋巴细胞(T细胞和/或B细胞)。且光照激发后的核黄素对T细胞和B细胞的影响不同,说明激发后的核黄素对不同免疫细胞有选择的作用。
本发明的第十七方面,提供了一种免疫相关疾病的治疗方法。
优选的,所述的治疗方法包括直接向个体施加光照激发后的核黄素,
或者,
所述的治疗方法包括将血液抽出后,经光照激发后的核黄素处理后再回输至个体。
或者,
所述的治疗方法包括将血液抽出后,利用仪器(包括但不限于血液细胞分离机)将免疫细胞分离出来重悬,将光照激发后的核黄素加入免疫细胞重悬液中处理后再将免疫细胞回输至个体。
所述的血液可以抽自健康个体或患者自身。
优选的,对光照激发的限定同本发明的第一方面。
优选的,所述的免疫相关疾病包括但不限于移植物抗宿主病、银屑病、过敏、哮喘、心肌炎、肾炎、肝炎、系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、硬皮病、甲状腺功能亢进、原发性血小板减少性紫癜、自身免疫性溶血性贫血、溃疡性结肠炎、自身免疫性肝病、糖尿病、疼痛或神经障碍中的一种或两种以上。
进一步优选的,所述的免疫相关疾病为自身免疫性疾病(如系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、干燥综合征等)、病毒感染性疾病(流感病毒感染)或者变态反应性疾病(骨髓移植、器官移植后等出现的排异反应)等。
本发明的第十八方面,提供了一种光照激发后的核黄素在制备治疗免疫相关疾病的产品中的应用。
优选的,对光照激发的限定同本发明的第一方面。
优选的,所述的免疫相关疾病包括但不限于移植物抗宿主病、银屑病、过敏、哮喘、心肌炎、肾炎、肝炎、系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、硬皮病、甲状腺功能亢进、原发性血小板减少性紫癜、自身免疫性溶血性贫血、溃疡性结肠炎、自身免疫性肝病、糖尿病、疼痛或神经障碍中的一种或两种以上。
进一步优选的,所述的免疫相关疾病为自身免疫性疾病(如系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、干燥综合征等)、病毒感染性疾病(流感病毒感染)或者变态反应性疾病(骨髓移植、器官移植后等出现的排异反应)等。
本发明所述的“个体”可以为人或非人动物,例如非人哺乳动物。
本发明术语“包括”或“包含”是开放式的描述,含有所描述的指定成分或步骤,以及不会实质上影响的其他指定成分或步骤。
本发明术语“和/或”包含该术语所连接的项目的所有组合,应视为各个组合已经单独地在本文列出。例如,“A和/或B”包含了“A”、“A和B”以及“B”。又例如,“A、B和/或C”包含了“A”、“B”、“C”、“A和B”、“A和C”、“B和C”以及“A和B和C”。
本发明所述的“治疗”表示在疾病已开始发展后减缓、中断、阻止、控制、停止、减轻、或逆转一种体征、症状、失调、病症、或疾病的进展或严重性,但不一定涉及所有疾病相关体征、症状、病症、或失调的完全消除。
附图说明
图1:核黄素浓度与细胞数量对PBMC凋亡率的影响;
图2:共培养体积对凋亡率的影响;
图3:激发后核黄素对PBMC分泌IL-1β、IL-10、TNF-α因子的影响。
图4:激发后的核黄素对细菌的灭活影响,其中,B为对照组,1、2、3、4、5、6分别对应①组、②组、③组、④组、⑤组和⑥组。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图,对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅是本发明的部分实施例,而不是全部。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
除非另有定义,本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的,不是旨在于限制本发明。
本发明中使用的核黄素:购自:江西制药有限责任公司;货号:Y1620014;
本发明中使用的光照袋:EVA透光血袋:购自:四川南格尔生物技术有限公司。
实施例中PBMC的分离方法:
1、用吸管将20ml健康人白膜血缓慢加入等体积淋巴细胞分离液中,500g,缓升缓降,离心20min;
2、吸取分离后的第二层白膜层,加入30mlPBS,1500rpm,离心5min;
3、倾去废液,加入2ml红细胞裂解液,轻柔吹打混匀,室温裂解5min后,1500rpm,离心5min;
4、倾去废液,加入2mlPBS,吹打混匀,1500rpm,离心5min;
5、重复步骤4;
6、倾去废液,加入2ml1640 RPMI培养基(含10%胎牛血清和1%双抗),吹打混匀,1500rpm,离心5min;
7、用移液枪吸去废液,重悬细胞至2ml;
8、吸取10μl细胞悬液至990μl PBS中,将细胞稀释100倍,计数。
实施例1:不同细胞数,不同核黄素浓度对PBMC的影响
本实施例取6人份白膜血提取PBMC。
1、将终浓度为200μM的核黄素1640 RPMI培养基溶液,吸取10ml加到光照袋中;
2、在UVA+UVB紫外光下以12J/cm2的剂量进行光照激发;
3、实验分为七组(其中,50μM是由激发后的200μM核黄素培养基稀释4倍得到):
对照组:不添加激发后的核黄素,只加入细胞数量为3×107的PBMC细胞悬液;
200μM激发后核黄素-PBMC细胞数3×107:向六孔板中加入200μM激发后的核黄素溶液,再加入的细胞数量为3×107的PBMC细胞悬液,混匀后放到二氧化碳培养箱中,培养10分钟;
200μM激发后核黄素-PBMC细胞数1×107:向六孔板中加入200μM激发后的核黄素溶液,再加入的细胞数量为1×107的PBMC细胞悬液,混匀后放到二氧化碳培养箱中,培养10分钟;
200μM激发后核黄素-PBMC细胞数5×106:向六孔板中加入200μM激发后的核黄素溶液,再加入的细胞数量为5×106的PBMC细胞悬液,混匀后放到二氧化碳培养箱中,培养10分钟;
50μM激发后核黄素-PBMC细胞数3×107:向六孔板中加入50μM激发后的核黄素溶液,再加入的细胞数量为3×107的PBMC细胞悬液,混匀后放到二氧化碳培养箱中,培养10分钟;
50μM激发后核黄素-PBMC细胞数1×107:向六孔板中加入50μM激发后的核黄素溶液,再加入的细胞数量为1×107的PBMC细胞悬液,混匀后放到二氧化碳培养箱中,培养10分钟;
50μM激发后核黄素-PBMC细胞数5×106:向六孔板中加入50μM激发后的核黄素溶液,再加入的细胞数量为5×106的PBMC细胞悬液,混匀后放到二氧化碳培养箱中,培养10分钟;
4、收集细胞培养液,1500rpm,离心5min,弃去含有核黄素的培养基溶液;
5、用1640 RPMI培养重悬PBMC,置于新的六孔板中继续培养24h,后检测凋亡。
实验结果表明光照激发后的核黄素对PBMC有影响,光照激发后的核黄素可以促进PBMC的凋亡,凋亡率随核黄素浓度增高而增高,且随细胞数的减少而增加。(参见表1、图1)。
表1
实施例2:激发后核黄素与PBMC共培养不同时间对PBMC的影响
本实施例取5人份白膜血提取PBMC。
1、将终浓度为200μM的核黄素1640 RPMI培养基溶液,吸取10ml加到光照袋中;
2、在UVA+UVB紫外光下以12J/cm2的剂量进行光照激发;
3、实验分为五组:
对照组,共培养10min,共培养30min,共培养60min,共培养24h;向六孔板中分别加入200μM激发后的核黄素溶液,再加入1×107的细胞悬液,混匀后放到二氧化碳培养箱中,根据不同组别共培养不同时间;其中,对照组为不添加激发后的核黄素,只加入细胞数量为1×107的PBMC细胞悬液;
4、收集细胞培养液,1500rpm,离心5min,弃去含有核黄素的培养基溶液;
5、用1640 RPMI培养重悬PBMC,置于新的六孔板中继续培养24h,后检测凋亡。
实验结果表明:激发后的核黄素与PBMC共培养时间不同对PBMC影响不大(参见表2),为实施操作的可行性,选择共培养10min进行后续实施例。
表2
实施例3:加入不同体积激发后核黄素对PBMC的影响
本实施例取3人份白膜血提取PBMC。
1、将终浓度为200μM的核黄素1640 RPMI培养基溶液,吸取10ml加到光照袋中;
2、在UVA+UVB紫外光下以12J/cm2的剂量进行光照激发;
3、实验分为三组:对照组,共培养体积2ml,共培养体积5ml;具体为向六孔板中分别加入200μM激发后的核黄素溶液,再加入3×107的细胞悬液,混匀后放到二氧化碳培养箱中,根据不同组别加入不同体积的激发后的核黄素,共培养10min;
4、收集细胞培养液,1500rpm,离心5min,弃去含有核黄素的培养基溶液;
5、用1640 RPMI培养重悬PBMC,置于新的六孔板中继续培养24h,后检测凋亡。
实验结果显示:光照激发后的核黄素可以促进PBMC的凋亡,凋亡率随加入核黄素的体积增加而增高(参见下表3和图2)。
表3
实施例4:激发后核黄素对PBMC分泌功能的影响
本实施例取9人份白膜血提取PBMC。
1、将终浓度为200μM的核黄素1640 RPMI培养基溶液,吸取10ml加到光照袋中;
2、在UVA+UVB紫外光下以12J/cm2的剂量进行光照激发;
3、实验分为2组:
对照组:不添加激发后的核黄素,只加入细胞数量为3×107的PBMC细胞悬液后放到二氧化碳培养箱中,共培养10min;
处理组:向六孔板中分别加入2ml的200μM激发后的核黄素溶液,再加入细胞数量为3×107的PBMC细胞悬液,混匀后放到二氧化碳培养箱中,共培养10min;
4、收集细胞培养液,1500rpm,离心5min,弃去含有核黄素的培养基溶液;
5、用1640 RPMI培养重悬PBMC,置于新的六孔板中继续培养24h,后收集培养上清,检测上清中细胞因子的分泌情况;
实验结果显示处理组的因子水平较对照组升高,说明激发后的核黄素对PBMC分泌功能有影响,提高了IL-1β、IL-10和TNF-α因子的分泌(参见表4、图3)。
表4
实施例5:激发后核黄素对PBMC亚型的影响
本实施例取3人份白膜血提取PBMC。
1、将终浓度为200μM的核黄素1640 RPMI培养基溶液,吸取10ml加到光照袋中;
2、在UVA+UVB紫外光下以12J/cm2的剂量进行光照激发;
3、实验分为2组:
对照组:不添加激发后的核黄素,只加入细胞数量为3×107的细胞悬液后放到二氧化碳培养箱中,共培养10min;
处理组:向六孔板中分别加入200μM激发后的核黄素溶液,再加入细胞数量为3×107的细胞悬液,混匀后放到二氧化碳培养箱中,共培养10min;
4、收集细胞培养液,1500rpm,离心5min,弃去含有核黄素的培养基溶液;
5、用1640 RPMI培养重悬PBMC,置于新的六孔板中继续培养24h,后检测T细胞和B细胞的凋亡。
实验结果显示:激发后的核黄素对PBMC有影响,且对T细胞和B细胞的影响不同,说明激发后的核黄素对不同免疫细胞有选择的作用(参见表5)。
表5
对照例:激发后核黄素灭活金黄色葡萄球菌
一、实验步骤
1、从-80℃冰箱中取出金黄色葡萄球菌冻存管,室温下快速复苏;
2、用无菌接种环伸入冻存管底部沾取适量菌液,在哥伦比亚琼脂平板上进行三区划线;
3、在37℃细菌培养箱中培养20-24h后挑取单菌落,在新的哥伦比亚琼脂平板上再次进行三区划线,培养20-24h完成二次传代;
4、挑取适量菌落加入无菌生理盐水,配成0.5麦氏浊度的菌悬液备用(含菌量约为1.5×108cfu/ml);
5、吸取10μl菌悬液至990μl生理盐水中,稀释100倍,此时菌悬液浓度为106cfu/ml。
二、实验分组
制备激发的核黄素,首先将核黄素配置为400μM,在UVA+UVB紫外光下以12J/cm2的剂量进行光照激发。分组如下:
对照组:只含有细菌和血浆,不进行任何处理;实验组除包含细菌和血浆外还具体包含:
①组:只进行UVA/UVB照射,但不加核黄素;
②组:先进行UVA/UVB照射后加入核黄素;
③组:先进行UVA/UVB照射后加入光照激发的核黄素;
④组:先加入核黄素后进行UVA/UVB照射;
⑤组:不进行照射,只加入核黄素;
⑥组:不进行照射,只加入光照激发的核黄素。
三、实验步骤及结果
1、吸取50μl 106cfu/ml菌悬液至5ml血浆中,使加入血袋进行处理的菌浓度为104cfu/ml;④组加入125μl 核黄素;
2、将组①②③④放入灭活仪器中进行12J/cm2光照处理;
3、向对照组、①、④中补5ml血浆;②、⑤中补5ml浓度为400μM的(核黄素+血浆);③、⑥中补5ml激发的核黄素。使核黄素终浓度为200μM,菌浓度为5×103cfu/ml。(④组核黄素终浓度被稀释为100μM,考虑到在照射过程中核黄素已经反应了,故核黄素浓度不再影响结果。)
4、将血袋放入37℃水浴锅孵育1h;
5、孵育结束后,将每组血样吸取100μl,平均涂布在平板四块区域(每块区域25μl),每组重复划3个平板;(每皿约500个细菌)
6、将平板放入37℃二氧化碳培养箱中培养20-24h,取出平板观察计数,每组平均菌落数如下:
①组:7;②组:8.3;③组:20;④组:21.3;对照组、⑤、⑥组菌落数>300。
结果如图4所示:其中,①组-④组间,各组的平均菌落数无明显差异,而没有进行紫外照射的⑤、⑥组与对照组相似,可以认为紫外照射对细菌有灭活作用,但激发后的核黄素对细菌没有灭活作用。
虽然,以上通过实施例对本发明进行了说明,但本领域技术人员应了解,在不偏离本发明精神和实质的前提下,对本发明所做的改进和变型,均应属于本发明的保护范围内。
Claims (10)
1.一种免疫细胞的处理方法,其特征在于,所述的处理方法包括将核黄素经光照激发后,与免疫细胞混合。
2.根据权利要求1所述的处理方法,其特征在于,所述的光照激发包括使用可见光和/或不可见光;
所述的可见光包括蓝光,
所述的不可见光包括紫外光。
3.根据权利要求1所述的处理方法,其特征在于,所述的光照激发使用的光照的波长为190-480nm。
4.根据权利要求1所述的处理方法,其特征在于,所述的免疫细胞包括淋巴细胞、树突状细胞、单核/巨噬细胞、粒细胞、肥大细胞中的一种或两种以上的组合。
5.根据权利要求1所述的处理方法,其特征在于,所述的处理方法包括将核黄素经光照激发后,与样本混合。
6.根据权利要求5所述的处理方法,其特征在于,所述的样本包括全血、红细胞、血小板、血浆或免疫细胞悬液。
7.一种光照激发后的核黄素在调节免疫细胞功能中的应用,其特征在于,所述的应用包括将核黄素经光照激发后,与免疫细胞混合。
8.一种调节血液中免疫细胞功能的方法,其特征在于,所述的方法包括将核黄素经光照激发后,加入血液中。
9.一种调节样本中免疫细胞功能的方法,其特征在于,所述的方法包括将核黄素经光照激发后,加入样本中。
10.一种光照激发后的核黄素在制备治疗免疫相关疾病的产品中的应用。
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