CN110638885A - 胆木提取物在制备炎症因子抑制剂中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于医药领域,公开了胆木提取物的新应用,尤其是胆木提取物在制备炎症因子抑制剂中的应用。实验表明,胆木提取物对LPS刺激细胞产生的NO以及促炎介质TNF‑α、PGD2、IL‑10的分泌均具有明显抑制作用,对炎症具有明显疗效。
Description
技术领域
本发明属于医药领域,具体涉及胆木提取物在制备炎症因子抑制剂中的应用。
背景技术
炎症,即为平时人们所说的“发炎”,是机体对于刺激的一种防御反应,表现为红、肿、热、痛和功能障碍。炎症,可以是感染引起的感染性炎症,也可以不是由于感染引起的非感染性炎症。通常情况下,炎症是有益的,是人体的自动的防御反应,但是有的时候,炎症也是有害的,例如对人体自身组织的攻击、发生在透明组织的炎症等等。但是在有些情况下,炎症又是潜在有害的。炎症反应是一些疾病的发病基础,如严重的超敏反应炎症过于剧烈时可以威胁病人的生命。
抗炎药是用于治疗组织受到损伤后所发生的反应炎症的药物。抗炎药有两大类:一类是甾体抗炎药,另一类是非甾体抗炎药,即医疗实践中所指的解热镇痛抗炎药如阿司匹林等。甾体类抗炎症药物副作用大,不能长期使用,而非甾体类药物则,对胃肠道刺激大,已引起过敏,且肝功能不全者,肾功能不全者,严重高血压和充血性心力衰竭患者,血细胞减少者,妊娠和哺乳期妇女禁用。
我国传统中草药在人们防病治病中起着毋庸置疑的作用,从传统中草药中挖掘活性成分是自主知识产权新药研发的重要手段和科技前沿,符合国际药物研发趋势,具有广阔的应用前景。
目前市场上具有抗炎作用的中草药种类很多,抗炎效果也不理想。因此,开发具有低毒性且疗效显著的抗炎症中药类药物,对人类社会具有显著的社会和经济效益前景。
发明内容
有鉴于此,本发明的目的在于针对现有技术中存在的问题,提供了胆木提取物在制备炎症因子抑制剂中的应用,胆木木质部提取物对炎症具有显著疗效,且安全性高,无毒副作用。
胆木,又名乌檀,Nauclea officinalis Pierre.ex Pitard,为茜草科Rubiaceae植物。分布于广东、广西和海南。具有清热解毒,消肿止痛之功效。常用于感冒发热,支气管炎,肺炎,急性扁桃体炎,咽喉炎,乳腺炎,胆囊炎,肠炎,菌痢,尿路感染,下肢溃疡,脚癣感染,烧伤感染,疖肿,湿疹。
在一个具体实施例中,本发明通过MTT法测定胆木提取物对LPS刺激细胞产生的NO的抑制作用,然后采用ELISA检测TNF-α、PGD2和IL-10含量。结果显示,胆木提取物对LPS刺激细胞产生的NO以及促炎介质TNF-α、PGD2、IL-10的分泌均具有明显抑制作用,可用于炎症治疗,因此,本发明提供了胆木提取物在制备炎症因子抑制剂中的应用。
进一步的,本发明提供了胆木提取物在制备抗炎症药物中的应用。
本发明提供的上述应用中,所述炎症为与NO、TNF-α和PGD2中的一种或几种相关的炎症。
在一些具体实施方案中,所述胆木提取物的浓度为0.16~100μg/mL,优选为0.25~1μg/mL,给药剂量为1g/kg~2g/kg。
本发明中,所述胆木提取物为胆木木质部的提取物。
进一步的,所述胆木提取物的制备方法为:取胆木木质部粉碎,加水提取,提取液浓缩至粘稠状,调节pH至9,冷却后加入二氯甲烷萃取;萃取液浓缩后调节pH至中性,浓缩至干燥粉末,得胆木提取物。
进一步,所述提取的方式为沸腾煎煮,提取的次数为3次,每次提取的时间为30min;所述萃取的次数为3次。
进一步的,所述有机溶剂为氯仿、二氯甲烷或乙酸乙酯。
在一些实施例中,所述胆木提取物的提取方法为:胆木木质部10Kg粉碎后,加1-1.5倍质量的水,沸腾煮30分钟,过滤,重复提取两次,混合滤液,浓缩至粘稠状后约5升,缓慢加入1M NaOH水溶液,边加边搅拌,调节pH至9,待冷却后,加入二氯甲烷萃取,萃取三次,合并萃取液浓缩后,用0.1M HCl调节pH至中性,浓缩成干燥固体粉末,得胆木提取物。
本发明提取方法获得的胆木提取物主要成分为胆木木质部的生物碱组分。经试验验证,该胆木提取物对LPS刺激细胞产生的NO以及促炎介质TNF-α、PGD2、IL-10的分泌均具有明显抑制作用,对炎症具有显著疗效。
本领域技术人员可将所述有效剂量的胆木提取物直接或间接加入制备不同剂型时所需的药学上可接受的各种常用辅料,以常规药物制剂方法,制成常用制剂。
其中,药学上可接受的辅料为崩解剂、润滑剂、黏合剂和分散剂中的一种或多种。在一些具体实施中,药学上可接受的辅料为羧甲淀粉钠、蔗糖粉、蜂蜜和芝麻油中的一种或多种。
药物的剂型为片剂、颗粒剂、胶囊剂、散剂、丸剂或口服液。
本发明提供了胆木提取物的新应用,尤其是胆木提取物在制备炎症因子抑制剂中的应用。实验表明,胆木提取物对LPS刺激细胞产生的NO以及促炎介质TNF-α、PGD2、IL-10的分泌均具有明显抑制作用,对炎症具有显著疗效。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案,下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1示胆木提取物的提取流程图;
图2示胆木提取物对LPS处理后的RAW264.7细胞形态的影响(×200),其中2-A示空白对照组,2-B示LPS对照组,2-C示胆木提取物处理组。
具体实施方式
本发明公开了胆木提取物在制备炎症因子抑制剂中的应用。本领域技术人员可以借鉴本文内容,适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是,所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的,它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及产品已经通过较佳实施例进行了描述,相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法进行改动或适当变更与组合,来实现和应用本发明技术。
为了进一步理解本发明,下面将结合本发明实施例,对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
如无特殊说明,本发明实施例中所涉及的试剂均为市售产品,均可以通过商业渠道购买获得。
实施例1:胆木提取物的制备方法
取胆木木质部10Kg粉碎后,加水淹没(加水量约为原料重量的1-1.5倍),沸腾煮30分钟,过滤,重复提取两次,混合滤液,浓缩至粘稠状后约5升,缓慢加入1M NaOH水溶液,边加边搅拌,调节pH至9,待冷却后,加入二氯甲烷萃取,萃取三次,合并萃取液浓缩后,用0.1MHCl调节pH至中性,后继续浓缩成干燥固体粉末,得胆木提取物。
实施例2:胶囊剂的制备
按下述重量称取各原料(单位:g):实施例1胆木提取物60g。
取实施例1胆木提取物60g,加入乙醇100mL,过滤,加入羧甲淀粉钠,充分混匀,喷雾干燥制成颗粒,装入1号胶囊,即得胶囊剂。
实施例3:片剂的制备
按下述重量称取各原料(单位:g):实施例1胆木提取物60g。
取实施例1胆木提取物60g加入乙醇100mL,过滤,加入羧甲淀粉钠,充分混匀,喷雾干燥制成颗粒,送至压片机压片即得。
实施例4:丸剂的制备
按下述重量称取各原料(单位:g):实施例1胆木提取物60g。
取实施例1胆木提取物60g加入乙醇100mL,过滤,加入羧甲淀粉钠,充分混匀,喷雾干燥制成颗粒,接着加入纯芝麻油或者蜂蜜混匀,送至离心造丸机制成丸剂。
实施例5:胆木提取物抗炎症活性试验
1、RAW264.7细胞复苏
从液氮罐中取出一管冻存的RAW264.7细胞,迅速放入37℃水中,快速摇晃使之迅速溶解,加入4mLDMEM完全培养液,吹打成单细胞悬液,转入25cm2细胞培养瓶内于37℃,5%CO2细胞培养箱中培养,次日更换新鲜完全培养基继续培养。
2、RAW264.7细胞的传代
细胞长满至培养瓶底的80%时,即可进行传代。倾去培养基,PBS洗涤2遍,加入0.5mL0.25%胰酶,轻轻摇晃,使液体充分浸润培养瓶内细胞,倒掉多余液体,将培养瓶放置于培养箱中,3min后取出。此时显微镜下观察细胞,细胞蜷缩成团。立即加入8mL DMEM完全培养液,吹打为单细胞悬液,然后将细胞悬液分装至两个新的25cm2细胞培养瓶,于37℃,5%CO2细胞培养箱中培养。
3细胞存活率
为了抗炎实验细胞活力在一个水平,本实验采用MTT法确定适合的药物浓度。RAW264.7细胞培养至对数生长期,0.25%胰酶消化,细胞悬液接种至96孔板,每孔100μL,细胞浓度在105个/孔,37℃,5%CO2细胞培养箱中培养至贴壁。弃去上清液,加试验100μL(每孔终浓度为0.16、0.8、4、20、100μg/mL),培养2h后,除空白孔外,其余各孔加LPS(每孔终浓度1μg mL-1),24h后加MTT10μL,作用4h,弃去上清,加150μLDMSO,570nm处检测OD值。
以下所有实验结果用means±SEM表示,数据用SPSS软件进行one-way ANOVA分析,P<0.05具有显著性差异。
结果发现,在20μg/mL胆木提取物下细胞活性为70-110%,1μg/mL胆木提取物下细胞活性稳定在100-110%,通过分析标准曲线确定胆木提取物的适宜浓度为0.25~1μg/mL。
4对LPS诱导的NO水平影响
为了更好的评价药物的抗炎作用,本实施例选择0.25~1μg/mL的剂量范围进行试验。
体外培养RAW264.7细胞到对数生长期,胰酶消化调节细胞浓度3~5×106个·mL-1加入到6孔板中,培养12h后细胞贴壁。分别加入1、0.5、0.25μg/mL实施例1胆木提取物,2h后除空白组其他各孔加1μg/mL的LPS,24h后收集培养上清液。上清液离心10min去除颗粒和聚合物,Griess试剂检测NO分泌。严格按照说明书的操作进行,540nm检测OD值。结果见图2和表1。
540nm测OD值,以OD值为Y,浓度为X轴做标准曲线,y=0.0246x+0.1154,R=0.9965,在0.76~48.75μM范围内,线性关系良好。计算样品亚硝酸盐的含量(NO含量)。
5.ELISA检测TNF-α含量
体外培养RAW264.7细胞到对数生长期,胰酶消化调节细胞浓度3~5×106个·mL-1加入到6孔板中,培养12h后细胞贴壁,分别加入1、0.5、0.25μg·mL-1的实施例1胆木提取物,2h后除空白组其他各孔加1μg·mL-1的LPS,24h后收集培养上清液。上清液离心10min去除颗粒和聚合物,检测炎症介质分泌。细胞消化后用PBS混悬,反复冻融,裂解细胞,检测炎症介质表达。严格按照说明书的操作进行,试验结果判定必须以酶标仪读数为准。
450nm测O.D值,以OD值为Y,浓度为X轴做标准曲线,y=0.0024x+0.1953,R=0.9654,在12.5~200pg/mL范围内,线性关系良好。计算样品中The mouse TNFα的含量,结果采用SPSS。
6 ELISA检测PGD2含量
RAW264.7细胞长期以来被用来研究各种刺激下PG合成与产生的炎症模型。LPS刺激RAW264.7细胞产生的COX主要产物是PGD2,还有少量的PGE2。有文献报道200ng/ml的LPS刺激RAW264.7细胞6h后PGD2产生达到高峰。
体外培养RAW264.7细胞到对数生长期,胰酶消化调节细胞浓度3~5×106个·mL-1加入到6孔板中,培养12h后细胞贴壁,饥饿过夜,分别加入1、0.5、0.25μg·mL-1的实施例1胆木提取物,2h后除空白组其他各孔加1μg·mL-1的LPS,6h后收集培养上清液。上清液离心10min去除颗粒和聚合物,检测炎症介质分泌。
450nm测O.D值,以OD值为Y,浓度为X轴做标准曲线,y=0.0116x+0.2103,R=0.9864,在12.5~200pg/mL范围内,线性关系良好。计算样品中PGD2的含量。
7.ELISA检测IL-10含量
体外培养RAW264.7细胞到对数生长期,胰酶消化调节细胞浓度3~5×106个·mL-1加入到6孔板中,培养12h后细胞贴壁,饥饿过夜,分别加入1、0.5、0.25μg·mL-1的实施例1胆木提取物,2h后除空白组其他各孔加1μg/mL的LPS,24h后收集培养上清液。上清液离心10min去除颗粒和聚合物,检测炎症介质分泌。
450nm测O.D值,以OD值为Y,浓度为X轴做标准曲线,y=0.0011x+0.2533,R=0.9630,在20~640pg/mL范围内,线性关系良好,计算样品中IL-10的含量。
TNF-α、PGD2和IL-10的含量见表1。
8.结果分析
由图2可知,空白组(未加LPS处理)形态完整,背景纯净,颗粒物质较少,细胞大小相对均匀,折光性良好;LPS组背景较多颗粒,细胞内有空泡,体积变大,折光性差;给药组细胞形态与LPS组相比,颗粒更多,死细胞多,细胞形态不完整。给药组细胞形态与空白组比较无差异。胆木提取物和LPS处理细胞24h后,细胞形态较差,细胞体积膨大,较多颗粒状物质出现;给药组组明显可见细胞形态差异。在对LPS刺激细胞产生NO的影响,结果可知,植物提取物组分对NO的产生有明显的抑制作用。这与镜下观察结果相符。
表1植物提取物组分抗炎症活性
由表1结果可知,胆木提取物能够明显抑制促炎介质TNF-α、PGD2和IL-10的分泌。
实施例6:毒性研究试验
1、急性毒性研究
取昆明种小鼠,按1g/kg灌胃给予本发明实施例2胶囊,1天连续给药4次,每次间隔6h,然后给予正常饮食,对各个器官进行病理性检查,未发现脏器病变。
2、长期毒性研究
取昆明种小鼠,按中、大剂量组(1g/kg,2g/kg)灌胃给予本发明药物(实施例2所制备的植物提取物组分胶囊内粉末),每天1次,连续给药14天后,测定小鼠体重、心功能、肝功能、肾功能、心电图等指标,给药组分别与对照组比较,未见明显异常。病理学检查心、肝、肾、脾、肺、胃、十二指肠、大肠、小肠、肾上腺和生殖器等脏器,给药组分别与对照组比较,均未见明显中毒性改变。以上结果表明本发明胆木提取物安全无毒,可用于临床。
实施例7:临床试验
1、试验对象资料
85例患者:年龄5-30岁;男性42例,女性43例;病程1天-2天;主要表现是体表炎症时最为显著,常表现为红、肿、热、痛和功能障碍,符合局部炎症临床诊断。
2、治疗方法与疗效评价标准:本发明实施例2的胶囊,口服,用量为300mg/日,每晚睡前一次服完,共两个疗程。
3、疗效标准:检测体表炎症症状红、肿、热、痛和功能障碍消去。
有效:第二天和第三天体表炎症症状红、肿、热、痛和功能障碍消去。
部分有效:第二天和第三天体表炎症症状红、肿、热、痛和功能障碍部分缓解。
无效:第二天和第三天大便体表炎症症状红、肿、热、痛和功能障碍未消去或继续发展。
4、临床结果
一、临床主要症状体征改善情况85例患者中,未住院。
二、各种检查结果85例患者中,80例服药后均体表炎症症状红、肿、热、痛和功能障碍消去,表现有效,4例服药后,体表炎症症状红、肿、热、痛和功能障碍部分缓解,表现为部分有效,1例未见缓解。
三、临床结果总结85例经临床确诊体表炎症患者,结果如下:
1、对85例体表炎症临床治疗综合观察,结果表明,本发明胶囊对体表炎症治疗具有明确的疗效。
2、毒副作用观察结果:所治疗的85例患者,没有一例患者出现任何不良反应,说明本发明药物对人体是安全的。
上述临床观察结果表明,本发明胆木提取物用于治疗体表炎症感染疗效显著,无毒副作用,无药物依赖性。
以上仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.胆木提取物在制备炎症因子抑制剂中的应用。
2.胆木提取物在制备抗炎症药物中的应用。
3.根据权利要求1或2所述的应用,其特征在于,所述炎症为与NO、TNF-α和PGD2中的一种或几种相关的炎症。
4.根据权利要求1-3任意一项所述的应用,所述胆木提取物为胆木木质部的提取物。
5.根据权利要求1或2所述的应用,所述胆木提取物的提取方法为:取胆木木质部粉碎,加水提取,提取液浓缩至粘稠状,调节pH至9,冷却后加入有机溶剂萃取;萃取液浓缩后调节pH至中性,浓缩至干燥粉末,获得所述胆木提取物。
6.根据权利要求1或2所述的应用,所述提取的方式为沸腾煎煮,提取的次数为3次,每次提取的时间为30min;所述萃取的次数为3次。
7.根据权利要求1或2所述的应用,其特征在于,所述药物为含有效剂量的胆木提取物和药学上可接受的辅料。
8.根据权利要求7所述的应用,其特征在于,所述药学上可接受的辅料为崩解剂、润滑剂、黏合剂和分散剂中的一种或多种。
9.根据权利要求7所述的应用,其特征在于,所述药学上可接受的辅料为羧甲淀粉钠、蔗糖粉、蜂蜜和芝麻油中的一种或多种。
10.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述药物的剂型为片剂、颗粒剂、胶囊剂、散剂、丸剂或口服液。
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20200103 |
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