CN110628700A - 一种用于筛选细胞培养条件的标准方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于筛选细胞培养条件的标准方法，包括如下步骤：1)配制不同浓度的培养基，包括用无血清DMEM稀释的羊水培养基以及加了不同血清浓度的羊水培养基；2)采用步骤1)中两种羊水培养基接种相同浓度的细胞，连续观察2天以上，用显微镜拍照以及文字描述细胞状态；3)采用量化的评分标准对步骤2)所得细胞状态加以评分统计，将细胞的生长状态进行量化，比较细胞在不同培养基中生长状态质量的差异；4)根据步骤3)所得差异，得出培养基浓度、细胞浓度以及培养时间三者之间的最佳配比，即得。该标准方法评估结果更加可靠，可以减少病毒分离失败、避免延误临床诊治；可以满足不同细胞、不同时间的需要，减少试剂的浪费。

Description

一种用于筛选细胞培养条件的标准方法
技术领域
本发明涉及细胞培养技术领域，尤其是一种用于筛选细胞培养条件的标准方法。
背景技术
目前病毒分离培养仍然是病毒诊断的金标准。病毒是严格的细胞内寄生，因此临床病毒的分离培养需要用到大量的细胞。细胞质量的优劣关乎病毒分离的成败，因此，如何保证用来分离病毒的细胞的质量至关重要，然而如何评价细胞的质量水平，目前临床上并没有一套系统的评分标准，都是依靠实验者依靠显微镜下肉眼观察的主观评判，而由于实验者经验水平不一致而引起的人工误差，主观评判的结果会有很大的偏差，可能会使用细胞质量较差的细胞进行病毒分离培养而导致病毒分离的失败而出现假阴性结果。
为了保持细胞长期在体外培养的生长与形态的稳定，需要对细胞进行频繁、繁琐的传代工作，同时耗费大量的试剂。细胞的质量关乎病毒分离培养的成败。细胞的质量如何与许多因素相关，包括培养所用的试剂以及操作技术水平不稳定导致的人工误差等。然而，对于如何对细胞的质量水平进行评估，以确定细胞能否用于病毒分离培养，临床上还缺乏一套系统的评分标准。
此外，由于临床工作中存在的众多不确定性因素，细胞传代的时间间隔并不是一成不变的，传代时间从一天到三天不等，由于细胞生长存在接触性抑制、培养基中的营养物质是有限的，而细胞生长的空间是固定的，若不同的传代时间都用同样的细胞浓度、相同的培养基显然是不能符合细胞的生长需要，导致细胞质量的降低，进而造成试剂的浪费，同时给实验者增加不必要的工作负担。
发明内容
基于上述问题，本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种用于筛选细胞培养条件的标准方法，其评估结果更加可靠，可以减少临床上由于实验人员操作水平及临床经验的偏差而导致细胞培养水平不一，以及对细胞状态的评判不准确导致的病毒分离失败、造成假阴性和延误临床诊治；采用本发明的标准方法可以得出培养基浓度、细胞浓度以及培养时间三者之间的最佳配比，使得临床的工作更加灵活，可以满足不同细胞、不同时间的需要，减少试剂的浪费。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：
一种用于筛选细胞培养条件的标准方法，包括如下步骤：
1)配制不同浓度的培养基，包括用无血清DMEM稀释的羊水培养基以及加了不同血清浓度的羊水培养基；
2)采用步骤1)中两种羊水培养基接种相同浓度的细胞，连续观察2天以上(优选3天以上)，用显微镜拍照以及文字描述细胞状态(此为传统的人工评判方法)；
3)采用量化的评分标准对步骤2)所得细胞状态加以评分统计，将细胞的生长状态进行量化(量化评分为本发明的发明点之一)，比较细胞在不同培养基中生长状态质量的差异；
4)根据步骤3)所得差异，得出培养基浓度、细胞浓度以及培养时间三者之间的最佳配比，即得。
在一些实施方案中，所述步骤2)中细胞为MDCK或HEp-2。需要说明的是，本发明的标准方法用于筛选细胞条件时，其中细胞包括但不限于MDCK或HEp-2，还可以是其它的动物细胞或植物细胞。
在一些实施方案中，所述步骤3)中评分标准包括死亡细胞百分比、细胞内核仁可见程度、胞间颗粒百分比和细胞边缘情况。需要说明的是，本发明中细胞生长至百分之几是指细胞在单个培养皿中生长的覆盖度；核仁可见程度是指在活细胞中核仁可见程度；胞间颗粒是指细胞由于衰老或死亡的过程中细胞质间出现的颗粒物，胞间颗粒百分比是指培养皿中细胞质出现颗粒物的细胞数占整个培养皿中细胞总数的百分比。
在一些实施方案中，所述死亡细胞百分比细分为10个等级，包括小于或等于5％、5～9％、10～19％、20～29％、30～39％、10～49％、50～59％、60～69％、70～89％和大于或等于90％；所述胞间颗粒百分比细分为5个等级，包括小于或等于5％、5～29％、30～59％、60～89％和大于或等于90％。
在一些实施方案中，所述细胞内核仁可见程度细分为5个等级，包括小于或等于9％、10～29％、30～59％、60～89％和大于或等于90％；所述细胞边缘情况细分为5个等级，包括清晰锐利、尚清晰锐利、稍圆钝、圆钝和不清。
在一些实施方案中，所述评分标准如说明书中表1所示。
在一些实施方案中，所述接种的细胞浓度为1～3×105个/mL。
在一些实施方案中，所述标准方法还包括对步骤3)中评分标准可信度的验证：通过测定细胞的吸光度，以羊水培养基组细胞的吸光度作为基线对照，其余组细胞吸光度值与羊水培养基组的吸光度相比，计算细胞的增殖活力，比较自建评分标准计算所得的结果与基于测定的吸光度结果所算得的细胞增殖活力的一致性。
在一些实施方案中，本发明采用CCK8测定细胞的吸光度。
作为本发明的另一个方面，本发明提供一种培养细胞的方法，其中，当细胞为MDCK时，铺板浓度为3×105个/mL，若铺板第二天需用细胞，则用羊水培养基培养MDCK，若铺板第三天使用细胞，则用含4％血清的羊水培养基培养MDCK，效果最佳；
当细胞为HEp-2时，铺板浓度为1×105个/mL，若铺板第二天需用细胞，则用无血清DMEM稀释过的羊水培养基培养HEp-2，若铺板第三天使用细胞，则用含4％血清的羊水培养基培养HEp-2，效果最佳。
综上所述，本发明的有益效果为：
相较于传统的人工评判方法而言，本发明通过建立一套系统的评分标准，细化细胞质量的评估方法，从多个方面来评估细胞质量，使得评估结果更加可靠；
本发明采用相对客观的评分标准，可以减少临床上由于实验人员操作水平及临床经验的偏差而导致细胞培养水平不一，对细胞状态的评判不准确导致的病毒分离失败，造成假阴性，延误临床诊治；
采用本发明自建的评分标准可以得出培养基浓度、细胞浓度以及培养时间三者之间的最佳配比，使得临床的工作更加灵活，可以满足不同细胞、不同时间的需要，减少试剂的浪费。与类似于采用CCK8来判断细胞状态诸类方法相比较，本发明方法不需要额外加入类似的试剂，更加经济，节约成本。
附图说明
图1为培养MDCK细胞第一天的显微镜照片；
图2为培养MDCK细胞第二天的显微镜照片；
图3为培养MDCK细胞第三天的显微镜照片；
图4为不同培养基对MDCK细胞生长的影响评分结果图，其中，每一天从左向右柱状图采用的培养基浓度与图4右侧从上至下的培养基浓度相对应；
图5为不同培养基影响MDCK细胞的生长状态比值结果图，其中，每一天从左向右柱状图采用的培养基浓度与图5右侧从上至下的培养基浓度相对应；
图6为培养HEp-2细胞第一天的显微镜照片；
图7为培养HEp-2细胞第二天的显微镜照片；
图8为培养HEp-2细胞第三天的显微镜照片；
图9为不同培养基对HEp-2生长的影响评分结果图，其中，每一天从左向右柱状图采用的培养基浓度与图9右侧从上至下的培养基浓度相对应；
图10为不同培养基影响HEp-2细胞的生长状态比值结果图，其中，每一天从左向右柱状图采用的培养基浓度与图10右侧从上至下的培养基浓度相对应；
图11为HEp-2细胞活力检测结果图。
具体实施方式
为了实现系统化评估细胞质量，减少人工误差及节约试剂，本发明建立了一套病毒室细胞培养的评分标准体系，从多个方面对细胞质量进行评估，为病毒分离培养提供合格的细胞。
在一些实施例中，本发明建立一套系统的细胞培养评分标准，从四个角度对细胞的质量进行评估，分别是显微镜下死细胞百分比、细胞内核仁可见程度、胞间颗粒百分比、细胞边缘情况；其中，细胞培养评分标准如下表1所示。
表1细胞培养评分标准
在一些实施例中，本发明采用上述细胞培养评分标准，筛选出培养基浓度、细胞浓度以及培养时间三者之间的最佳配比，具体包括步骤：
1)配制不同浓度的培养基，包括用无血清DMEM稀释的羊水培养基以及加了不同血清浓度的羊水培养基，接种相同浓度的细胞，分别是MDCK和HEp-2，连续观察3天，显微镜拍照及用文字加以描述，此为传统的人工判别细胞生长状态结果，进而通过上述评分标准加以评分统计，将细胞的生长状态进行量化，此为本发明中的标准方法，比较细胞在不同培养基中生长状态质量的差异；同时得出培养基浓度、细胞浓度以及培养时间三者之间的最佳配比；
2)进一步通过CCK8测定HEp-2细胞的吸光度，以羊水培养基组细胞的吸光度作为基线对照，其余组细胞吸光度值与羊水培养基组的吸光度相比，计算细胞的增殖活力，比较自建评分标准计算所得的结果与基于CCK8测定的结果所算得的细胞增殖活力的一致性，以验证自建评分标准的可信度。
为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。如无特别说明，本发明中的试剂浓度均为质量浓度。如无特别说明，本发明中的材料、细胞和试剂均可以从市场上或其它公开渠道获得。
实施例1用自建的系统评分标准(参见表1)对不同浓度培养基对MDCK(犬肾上皮传代细胞)的生长状况进行量化评分，并筛选培养基浓度、细胞浓度以及培养时间三者之间的最佳配比
一、细胞培养操作：
1、准备好高压过的无菌PBS、胰酶消化液、羊水培养基、无血清DMEM和胎牛血清FBS；
2、用5ml的离心管配制系列不同浓度的培养基，包括：
1)羊水培养基为第①组：2ml羊水培养基，此为阴性对照组；
2)羊水培养基稀释10％为第②组：1.8ml羊水培养基+0.2ml无血清DMEM；
3)羊水培养基稀释20％为第③组：1.6ml羊水培养基+0.4ml无血清DMEM；
4)羊水培养基稀释30％为第④组：1.4ml羊水培养基+0.6ml无血清DMEM；
5)羊水培养基稀释50％为第⑤组：1.0ml羊水培养基+1.0ml无血清DMEM；
6)羊水培养基+1％血清为第⑥组：1.98ml羊水培养基+0.02ml血清；
7)羊水培养基+2％血清为第⑦组：1.96ml羊水培养基+0.04ml血清；
8)羊水培养基+4％血清为第⑧组：1.92ml羊水培养基+0.08ml血清；
9)羊水培养基+5％血清为第⑨组：1.90ml羊水培养基+0.1ml血清；
10)羊水培养基+10％血清为第⑩组：1.8ml羊水培养基+0.2ml血清；
11)羊水培养基+15％血清为第组：1.7ml羊水培养基+0.3ml血清；
12)羊水培养基+20％血清为第组：1.6ml羊水培养基+0.4ml血清；
13)羊水培养基+30％血清为第组：1.4ml羊水培养基+0.6ml血清；
3、用胰酶消化液对长至单层的细胞进行消化，消化时间5-6分钟，调整接种浓度为3×105个/mL，接种至6孔细胞培养板。
4、将上述6孔细胞培养板置于37℃，5％CO2孵育箱中培养，每24小时记录一次。
二、实验结果：
(一)传统人工判别细胞生长状态结果：
第一天：如图1所示。
①-⑤组：细胞长至95％，贴壁均匀生长，5-10％死细胞，可见核仁，细胞边缘清晰、胞浆颗粒物少；
⑥-⑨组：细胞长至98％，贴壁均匀生长，5-10％死细胞，可见核仁，细胞边缘清晰、胞浆颗粒物少；
组：细胞长至95％，贴壁均匀生长，5％死细胞，可见核仁，细胞边缘清晰、胞浆颗粒物少。
第二天：如图2所示。
1)①组：细胞长至98％，贴壁均匀生长，10-12％死细胞，核仁较前模糊，颗粒少，细胞边缘稍圆钝。
2)②-⑤组：细胞长至98％，贴壁均匀生长，死细胞分别为10％-12％、20％-30％、40％-50％、50％，核仁较前模糊，颗粒少，细胞边缘圆钝、胞浆颗粒少。
3)⑥组：30％死细胞，细胞间出现大量空泡，细胞边缘圆钝，核仁模糊，可见颗粒。
4)⑦组：25％死细胞，细胞间部分空泡，细胞稍圆钝，核仁模糊，可见颗粒。
5)⑧-⑨组：20％死细胞，无空泡，细胞边缘尚清，部分可见核仁，可见颗粒。
6)组：细胞长至98％，贴壁均匀生长，6％-8％死细胞，可见核仁，细胞边缘尚清晰，有棱角，胞浆颗粒少。
第三天：如图3所示。
1)①组：细胞长至85％，贴壁生长，40-50％死细胞，细胞间出现大空隙，核仁模糊，颗粒多，细胞边缘圆钝。
2)②-⑤组：细胞长至90％，贴壁生长，死细胞分别为40％-50％、50％-60％、60％-70％、60％-70％，细胞间出现空隙，核仁模糊，颗粒多，细胞边缘圆钝。
3)⑥-⑦组：60-70％死细胞，细胞大量脱落，细胞边缘圆钝，核仁模糊，大量颗粒。
4)⑧组：50％死细胞，细胞边缘尚清，核仁稍模糊，胞浆可见颗粒。
5)⑨组：45％死细胞，细胞边缘尚清，核仁稍模糊，胞浆可见颗粒。
6)⑩组细胞：贴壁95％，10％死细胞，核仁模糊，颗粒多，细胞边缘圆钝。
7)组细胞：贴壁95％，20％死细胞，可见结晶，核仁模糊，颗粒非常多，细胞边界不清。
8)组细胞：贴壁95％，30％-40％死细胞，死细胞扎堆，核仁模糊，颗粒多，细胞呈长条状。
9)组细胞长至95％，贴壁均匀生长，30％-40％死细胞，死细胞扎堆，核仁模糊，颗粒多，细胞稍钝。
(二)用自建的评分标准量化结果(参见表2和图4)：
表2采用本发明的评分标准量化后的结果
(三)以羊水培养基组作为对照组，将MDCK在羊水培养基中的生长状态视为标准生长状态，其余组培养基作为实验组，比较MDCK在不同稀释浓度及加了不同血清浓度的羊水培养基中的生长状态，以每组得分/羊水培养基组得分×100％来表示，其结果如下表3和图5所示：
表3 MDCK的生长状态
三、实验结论：
1)基于本次实验的设定，在综合考虑试剂成本及目前处理细胞的频率，当MDCK铺板浓度为3×105时，若铺板第二天即用细胞，则用羊水培养基即可，若铺板第三天使用细胞，则用含4％血清的羊水培养基最佳。
2)相较于传统人工判别细胞生长状态方法的模糊、不确定性，自建细胞培养评分标准将细胞的生长状态进行了量化评分，使得判断的结果更加地客观准确，尤其是初次进行细胞培养，不确定需要使用何种浓度的培养基适合细胞多长时间的生长时，相较于传统人工的判别方法，此量化评分标准更加地具有可操作性。
四、实验结果讨论：
1)传统人工判别细胞生长状态的方法结果相对主观，与实验者的经验水平有较大关系，由于实验者经验水平不均一，导致主观判断的结果也参差不齐，这对病毒培养的结果影响显著，甚至导致病毒分离培养的失败，而造成假阴性结果，延误治疗。
2)通过本发明自建的细胞生长状态评分标准，从四个维度来综合分析细胞生长状态，其结果相对于传统人工判别细胞生长状态的结果更加的客观，能够减少由于实验者主观因素引起的偏差；且更加具有可操作性。
实例2用自建的系统评分标准对不同浓度培养对HEp-2的生长状况进行量化评分，并通过CCK8测定HEp-2的吸光度，计算细胞增殖活力佐以验证自建评分标准的可靠性
一、细胞培养操作：
1、准备好高压过的无菌PBS、胰酶消化液、羊水培养基、无血清DMEM和胎牛血清FBS；
2、用10ml的离心管配制系列不同浓度的培养基，包括：
1)羊水培养基为第①组：5ml羊水培养基，此为阴性对照组；
2)羊水培养基稀释10％为第②组：4.5ml羊水培养基+0.5ml无血清DMEM；
3)羊水培养基稀释20％为第③组：4ml羊水培养基+1ml无血清DMEM；
4)羊水培养基稀释30％为第④组：3.5ml羊水培养基+1.5ml无血清DMEM；
5)羊水培养基稀释50％为第⑤组：2.5ml羊水培养基+2.5ml无血清DMEM；
6)羊水培养基+1％血清为第⑥组：4.95ml羊水培养基+0.05ml血清；
7)羊水培养基+2％血清为第⑦组：4.9ml羊水培养基+0.1ml血清；
8)羊水培养基+4％血清为第⑧组：4.8ml羊水培养基+0.2ml血清；
9)羊水培养基+5％血清为第⑨组：4.75ml羊水培养基+0.25ml血清；
10)羊水培养基+10％血清为第⑩组：4.5ml羊水培养基+0.5ml血清；
11)羊水培养基+15％血清为第组：4.25ml羊水培养基+0.75ml血清；
12)羊水培养基+20％血清为第组：4ml羊水培养基+1ml血清；
13)羊水培养基+30％血清为第组：3.5ml羊水培养基+1.5ml血清；
3、用胰酶消化液对长至单层的细胞进行消化，消化时间3-4分钟，调整接种浓度为1×105个/mL，接种至6孔细胞培养板以及96孔板中。
4、将上述6孔细胞培养板以及96孔细胞培养板置于37℃，5％CO2孵育箱中培养，每24小时拍照记录6孔板一次，同时向96孔板中加入CCK8试剂，孵育2h后测定细胞的吸光度。
记录细胞生长状态：
连续观察记录三天，拍照及文字描述，然后用上述评分标准加以评分统计。
二、实验结果
(一)传统人工判别细胞生长状态结果：
第一天：如图6所示。
①-⑤组：细胞生长至70-75％，4-5％死细胞，核仁可见程度90-95％，胞间颗粒＜5％，细胞边缘清晰锐利。
⑥组：细胞生长至75-80％，6-7％死细胞，核仁可见程度90-95％，胞间颗粒＜5％，细胞边缘尚清晰锐利。
⑦组：细胞生长至75-80％，6-7％死细胞，核仁可见程度90-95％，胞间颗粒＜5％，细胞边缘清晰锐利。
⑧组：细胞生长至80-85％，10-12％死细胞，核仁可见程度80-89％，胞间颗粒10-15％，细胞边缘尚清晰锐利。
⑨组：细胞生长至80-85％，6-7％死细胞，核仁可见程度80-89％，胞间颗粒10-15％，细胞边缘尚清晰锐利。
⑩组：细胞生长至80％，3-4％死细胞，核仁可见程度70-80％，胞间颗粒15-20％，细胞边缘清晰锐利。
组：细胞生长至60-65％，10-12％死细胞，核仁可见程度80-89％，胞间颗粒15-20％，细胞边缘尚清晰锐利。
组：细胞生长至50-55％，6-7％死细胞，核仁可见程度70-79％，胞间颗粒30-35％，细胞边缘尚清晰锐利。
第二天：如图7所示。
①-③组：细胞生长至85-90％，5-6％死细胞，核仁可见程度90-95％，胞间颗粒＜5％，细胞边缘尚清晰锐利。
④-⑤组：细胞生长至85-90％，7-9％死细胞，核仁可见程度90-95％，胞间颗粒＜5％，细胞边缘尚清晰锐利。
⑥-⑨组：细胞生长至85-90％，10-12％死细胞，核仁可见程度80-85％，胞间颗粒15-20％，细胞边缘稍圆钝。
⑩组：细胞生长至98％，10-12％死细胞，核仁可见程度80-85％，胞间颗粒15-20％，细胞边缘稍圆钝。
组：细胞生长至99％，10-15％死细胞，核仁可见程度75-80％，胞间颗粒15-20％，细胞边缘尚清晰锐利。
组：细胞生长至97-98％，10-12％死细胞，核仁可见程度75-80％，胞间颗粒15-20％，细胞边缘尚清晰锐利。
组：细胞生长至90-95％，8-9％死细胞，核仁可见程度75-80％，胞间颗粒25-30％，细胞边缘圆钝。
组：细胞生长至95％，7-9％死细胞，核仁清晰程度90-95％，胞间颗粒＜5％，细胞边缘尚清晰锐利。
第三天：如图8所示。
①组：细胞生长至100％，30-35％死细胞，核仁可见程度65-70％，胞间颗粒15-20％，细胞边缘稍圆钝。
②-③组：细胞生长至100％，25-30％死细胞，核仁可见程度80-85％，胞间颗粒10-15％，细胞边缘尚清晰锐利。
④组：细胞生长至100％，35-40％死细胞，核仁可见程度65-70％，胞间颗粒15-20％，细胞边缘稍圆钝。
⑤组：细胞生长至100％，20-25％死细胞，核仁可见程度80-85％，胞间颗粒15-20％，细胞边缘尚清晰锐利。
⑥-⑦组：细胞生长至100％，15-20％死细胞，核仁可见程度75-80％，胞间颗粒15-20％，细胞边缘稍圆钝。
⑧组：细胞生长至100％，15-20％死细胞，核仁可见程度80-85％，胞间颗粒15-20％，细胞边缘尚清晰锐利。
⑨组：细胞生长至100％，15-20％死细胞，核仁可见程度80-85％，胞间颗粒15-20％，细胞边缘稍圆钝。
⑩组：细胞生长至100％，15-20％死细胞，核仁可见程度75-80％，胞间颗粒15-20％，细胞边缘稍圆钝。
组：细胞生长至100％，20-25％死细胞，核仁清晰程度75-80％，胞间颗粒15-20％，细胞边缘尚清晰锐利。
组：细胞生长至100％，25-30％死细胞，核仁清晰程度75-80％，胞间颗粒25-30％，细胞边缘尚清晰锐利。
组：细胞生长至100％，10-15％死细胞，核仁可见程度75-80％，胞间颗粒25-30％，细胞边缘稍圆钝。
组：细胞生长至100％，5-9％死细胞，核仁清晰程度90-95％，胞间颗粒＜5％，细胞边缘尚清晰锐利。
(二)用自建的评分标准评分结果如下表4和图9所示：
表4细胞状态评分结果
(三)以羊水培养基组作为对照组，将HEp-2在羊水培养基中的生长状态视为标准生长状态，其余组培养基作为实验组，比较HEp-2在不同稀释浓度及加了不同血清浓度的培养基中的生长状态，以每组得分/羊水培养基组得分×100％来表示，其结果如下表5和图10所示：
表5 HEp-2的生长状态
(四)CCK8测量HEp-2细胞活力验证自建评分标准的可信度
通过CCK8测定96孔板中HEp-2细胞在不同培养基的吸光度，以羊水培养基组细胞的吸光度作为基线对照，其余组细胞吸光度值与羊水培养基组的吸光度相比，计算细胞的增殖活力，结果如下表6和图11所示：
以羊水培养基组作为阴性对照，计算HEp-2的细胞活力，以增殖率来表示。
细胞增殖率＝(实验组-空白组)/(正常组-空白组)×100％，其中，
实验组：不同浓度的培养基+细胞+CCK8，
正常组：羊水培养基原液组+细胞+CCK8，
空白组：不同浓度培养基+CCK8(无细胞)。
表6 CCK8测定HEp-2细胞活力结果
将自建评分标准得出的结果(参见表6)与CCK8测定的结果(参见图11)进行比较，以羊水培养基作为标准对照，自建评分标准的结果中，每组分别与羊水培养基进行比较，再与CCK8测定所得的细胞活力相比较，比较自建评分标准计算所得的结果与CCK8测定的结果的一致性，以验证自建评分标准的可信度。
实验结论：
1)基于本次实验的设定，在综合考虑试剂成本及目前处理细胞的频率，当HEp-2铺板浓度为1×105时，若铺板第二天即用细胞，用无血清DMEM稀释过的羊水培养基更适合HEp-2生长，若铺板第三天使用细胞，则用含4％血清的羊水培养基最佳。
2)由上述结果可知，自建评分标准与CCK8的结果基本一致，基本符合细胞生长的状态描述。相较于传统人工判别细胞生长状态方法的模糊、不确定性，自建细胞培养评分标准将细胞的生长状态进行了量化评分，使得判断的结果更加地客观准确，自建评分标准可行。
四、实验结果讨论：
1)通过CCK8测定细胞活力的结果来验证自建评分标准的结果，可知(除了极个别结果不太吻合外，可能是铺板时细胞浓度不够均一等的影响)本发明的自建评分标准可行；
2)传统人工判别细胞生长状态的方法结果相对主观，与实验者的经验水平有较大关系，由于实验者经验水平不均一，导致主观判断的结果也参差不齐，这对病毒培养的结果影响显著，甚至导致病毒分离培养的失败，而造成假阴性结果，导致误诊漏诊，延误治疗；
3)通过本发明自建的细胞生长状态评分标准，从四个维度来综合分析细胞生长状态，其结果相对于传统人工判别细胞生长状态的结果更加的客观、准确，能够减少由于实验者主观因素引起的偏差；并且通过CCK8测定细胞活力的结果来验证自建评分标准的可信度，进一步证实本发明的自建评分标准的可行性；
4)本发明通过建立一套系统的评分标准，从四个维度来评价细胞的生长状态，尤其是初次进行细胞培养，可以摸索出适合相应实验室需要的培养条件，从而减少细胞、试剂等方面的浪费，相较于传统人工的判别方法，此量化评分标准更加地具有可操作性；与类似于采用CCK8来判断细胞状态诸类方法相比较，本发明方法不需要额外加入此类试剂，更加经济。
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (10)

1.一种用于筛选细胞培养条件的标准方法，包括如下步骤：
1)配制不同浓度的培养基，包括用无血清DMEM稀释的羊水培养基以及加了不同血清浓度的羊水培养基；
2)采用步骤1)中两种羊水培养基接种相同浓度的细胞，连续观察2天以上，用显微镜拍照以及文字描述细胞状态；
3)采用量化的评分标准对步骤2)所得细胞状态加以评分统计，将细胞的生长状态进行量化，比较细胞在不同培养基中生长状态质量的差异；
4)根据步骤3)所得差异，得出培养基浓度、细胞浓度以及培养时间三者之间的最佳配比，即得。
2.权利要求1的标准方法，其中，所述步骤2)中细胞为MDCK或HEp-2。
3.权利要求1的标准方法，其中，所述步骤3)中评分标准包括死亡细胞百分比、细胞内核仁可见程度、胞间颗粒百分比和细胞边缘情况。
4.权利要求3的标准方法，其中，所述死亡细胞百分比细分为10个等级，包括小于或等于5％、5～9％、10～19％、20～29％、30～39％、10～49％、50～59％、60～69％、70～89％和大于或等于90％；所述胞间颗粒百分比细分为5个等级，包括小于或等于5％、5～29％、30～59％、60～89％和大于或等于90％。
5.权利要求1的标准方法，其中，所述细胞内核仁可见程度细分为5个等级，包括小于或等于9％、10～29％、30～59％、60～89％和大于或等于90％；所述细胞边缘情况细分为5个等级，包括清晰锐利、尚清晰锐利、稍圆钝、圆钝和不清。
6.权利要求1或3的标准方法，其中，所述评分标准如说明书中表1所示。
7.权利要求1的标准方法，其中，所述接种的细胞浓度为1～3×105个/mL。
8.权利要求1的标准方法，其还包括对步骤3)中评分标准可信度的验证：通过测定细胞的吸光度，以羊水培养基组细胞的吸光度作为基线对照，其余组细胞吸光度值与羊水培养基组的吸光度相比，计算细胞的增殖活力，比较自建评分标准计算所得的结果与基于测定的吸光度所算得的细胞增值活力结果的一致性。
9.权利要求8的标准方法，其中采用CCK8测定细胞的吸光度。
10.一种培养细胞的方法，其中，当细胞为MDCK时，铺板浓度为3×105个/mL，若铺板第二天需用细胞，则用羊水培养基培养MDCK，若铺板第三天使用细胞，则用含4％血清的羊水培养基培养MDCK；
当细胞为HEp-2时，铺板浓度为1×105个/mL，若铺板第二天需用细胞，则用无血清DMEM稀释过的羊水培养基培养HEp-2，若铺板第三天使用细胞，则用含4％血清的羊水培养基培养HEp-2。
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