CN110628617A - 蛋生动物胚胎的可视化培养系统、培养方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种蛋生动物胚胎的可视化培养系统、培养方法及应用，包括：胚胎容纳腔、支撑装置及摇动装置，胚胎容纳腔用于容纳从种蛋中分离出来的内容物，内容物包含所述蛋生动物胚胎；支撑装置固定并支撑所述胚胎容纳腔；支撑装置置于所述摇动装置上，并随摇动装置的摇动使内容物在胚胎容纳腔内摇动；其中，胚胎容纳腔为半卵形的中空腔室，该中空腔室包括顶部和下部的腔壁，所述顶部和腔壁二者中至少一者采用透明材质，以可视化地观察所述蛋生动物胚胎的发育过程。该培养系统通过模拟蛋生动物胚胎的发育环境，可实时观察胚胎的发育过程，并能提高胚胎生存率和孵化率，可作为“工具”应用于教学和科研领域。

Description

蛋生动物胚胎的可视化培养系统、培养方法及应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种蛋生动物胚胎的可视化培养系统、培养方法及应用。
背景技术
卵生动物(Ovipara)是指用产卵方式繁殖的动物。大部分卵生动物的胚胎是在蛋壳中孵化的，例如：鸡、鸭等禽类、蛇、乌龟等。这些动物产下蛋后，经过孵化会变成动物。不同于哺乳动物，这类动物的胚胎一般在蛋壳中独立于母体发育，使得其在易于操作的同时可排除母体对胚胎发育的影响，对研究和观察胚胎发育提供了极大的便利，非常适用于进行胚胎发育学、药物筛选等研究，但是坚硬且不透明的蛋壳成为对于胚胎观察的最大阻碍。
需注意的是，前述背景技术部分公开的信息仅用于加强对本发明的背景理解，因此它可以包括不构成对本领域普通技术人员已知的现有技术的信息。
发明内容
本发明的一个主要目的在于克服上述现有技术的至少一种缺陷，提供一种蛋生动物胚胎的可视化培养系统、培养方法及应用，其中术语“蛋生动物”是指胚胎在蛋壳中孵化的卵生动物。该培养系统通过模拟蛋生动物胚胎的发育环境，可实时观察胚胎的发育过程，并在培养过程中可反复对胚胎进行施药等操作，同时还具有较高的胚胎存活率和孵化率，其在胚胎发育学、药物筛选、疾病研究等领域均具有重要价值和应用前景。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明提供一种蛋生动物胚胎的可视化培养系统，包括：胚胎容纳腔、支撑装置及摇动装置，胚胎容纳腔用于容纳从种蛋中分离出来的内容物，内容物包含蛋生动物胚胎；支撑装置固定并支撑胚胎容纳腔；支撑装置置于所述摇动装置上，并随摇动装置的摇动使内容物在胚胎容纳腔内摇动；其中，胚胎容纳腔为半卵形的中空腔室，该中空腔室包括顶部和下部的腔壁，所述顶部和腔壁二者中至少一者采用透明材质，以可视化地观察所述蛋生动物胚胎的发育过程。
根据本发明的一个实施方式，摇动装置包括：平台和至少两个支撑杆，平台用于放置支撑装置；至少两个支撑杆用于支撑平台，各支撑杆的顶部连接于平台；其中支撑杆中的至少一个为可升降的伸缩杆，以带动平台摇动。
根据本发明的一个实施方式，摇动装置还包括底座，各支撑杆的底部固定连接于底座。
根据本发明的一个实施方式，支撑杆包括至少一个固定杆。
根据本发明的一个实施方式，支撑杆包括至少三个伸缩杆，伸缩杆中的至少一个与其它伸缩杆的升降幅度不同。
根据本发明的一个实施方式，所述伸缩杆各自连接有用于驱动其自动伸缩的步进电机。
根据本发明的一个实施方式，透明材质为透明聚甲基戊烯膜。
根据本发明的一个实施方式，中空腔室的上部开设有多个第一通气孔。
根据本发明的一个实施方式，支撑装置为具有开口端和封闭端的透明容器，腔壁固定于开口端，且胚胎容纳腔的底部与封闭端之间具有间隔。
根据本发明的一个实施方式，采用透明的密封装置对支撑装置的开口端密封。
根据本发明的一个实施方式，支撑装置的侧壁开设有第二通气孔。
根据本发明的一个实施方式，腔壁为蛋壳，中空腔室的顶部采用透明材质密封。
根据本发明的一个实施方式，可视化培养系统还包括培养箱，用于容纳胚胎容纳腔、支撑装置和摇动装置，以进行蛋生动物胚胎的人工孵化。
本发明还提供一种蛋生动物胚胎的可视化培养方法，采用上述可视化培养系统，包括步骤如下：提供含有蛋生动物胚胎的种蛋；将种蛋的内容物转移至胚胎容纳腔的中空腔室，并调整胚胎位置向上；固定胚胎容纳腔于支撑装置；将支撑装置置于摇动装置的平台上，内容物随摇动装置摇动，以进行可视化培养。
根据本发明的一个实施方式，还包括：提供以薄膜材料为腔壁的第一胚胎容纳腔和以蛋壳作为腔壁的第二胚胎容纳腔；将种蛋的内容物转移至第一胚胎容纳腔进行一次培养4天～5天；将一次培养后的胚胎转移至第二胚胎容纳腔进行二次培养至胚胎孵化。
根据本发明的一个实施方式，可视化培养至所述胚胎的肺呼吸启动后，向可视化培养系统内通入氧气，通入氧气的流量为400mL/h～450mL/h。
根据本发明的一个实施方式，胚胎发育至孵化完成前1～2天时，将第二胚胎容纳腔转移至硬质半卵型容器中，并继续通入氧气培养。
根据本发明的一个实施方式，内容物转移前，种蛋预先培养48小时～50小时。
根据本发明的一个实施方式，内容物转移前，在中空腔室中加入钙添加剂。
根据本发明的一个实施方式，摇动装置摇动的角度范围为±10°～±30°，摇动频率为15分钟～60分钟/次。
根据本发明的一个实施方式，支撑装置中加入抑菌剂。
本发明还提供上述可视化培养系统在胚胎发育学、药物筛选、疾病研究中的应用。
本发明还提供上述可视化培养系统作为教学实验工具的应用。
本发明的有益效果在于：
本发明提供了一种蛋生动物胚胎的可视化培养系统及方法，通过对培养系统进行可视化设计，为研究和观察蛋生动物胚胎的发育提供了极大的便利。该培养系统还设置有摇动装置，可实现培养过程中对胚胎的自动摇动以及摇动角度的精确化，相比于手动转蛋操作，可降低污染概率，提高胚胎孵化率。采用该培养系统进行蛋生动物胚胎的培养，尤其是禽类胚胎的培养，可实时观察胚胎的发育过程，并在培养过程中可反复对胚胎进行施药等操作，而且还能够显著提高胚胎生存率和孵化率。
该可视化培养系统可应用于教学观摩以及科研领域，例如，生物发育学研究、药理研究、药物筛选、毒性物质检测、环境污染物质对胚胎生长发育的影响检测、人类疾病模型的建立、濒危动物保护、营养学研究、先天性疾病研究、心血管发育及疾病研究、器管形成及畸形研究等方面均具有重要价值和应用前景。
附图说明
为了让本发明实施例能更容易理解，以下配合所附附图作详细说明。应该注意，根据工业上的标准范例，各个部件未必按照比例绘制，且仅用于图示说明的目的。实际上，为了让讨论清晰易懂，各个部件的尺寸可以被任意放大或缩小。
图1示出了本发明提出的一示例性实施方式的蛋生动物胚胎的可视化培养系统；
图2A和图2B分别示出了图1所示的摇动装置不同摇动角度的结构示意图；
图3示出了图1所示的可视化培养系统的胚胎容纳腔的制作工艺流程；
图4示出了图1所示的可视化培养系统的支撑装置的制作工艺流程；
图5示出了本发明一示例性实施方式的蛋生动物胚胎的可视化培养系统的培养方法流程图；
图6示出了图5的可视化培养方法的示意图。
其中，附图标记如下：
100：胚胎容纳腔
101：中空腔室
200：密封盖
300：支撑装置
401：平台
404：固定杆
405：伸缩杆
406：电机
500：培养箱
102：腔壁
A：中空腔室的顶部
B：中空腔室的底部
A’：支撑装置的开口端
B’：支撑装置的封闭端
1021：保鲜膜
1022：卵型模具
1023：宽口容器
1024：第一通气孔
1025：打孔器
301：第二通气孔
3010：封闭件
3020：抑菌剂
具体实施方式
体现本发明特征与优点的典型实施例将在以下的说明中详细叙述。应理解的是本发明能够在不同的实施例上具有各种的变化，其皆不脱离本发明的范围，且其中的说明及附图在本质上是作说明之用，而非用以限制本发明。
在对本发明的不同示例性实施方式的以下描述中，参照附图进行，所述附图形成本发明的一部分，并且其中以示例方式显示了可实现本发明的多个方面的不同示例性结构、系统和步骤。应理解的是，可以使用部件、结构、示例性装置、系统和步骤的其他特定方案，并且可在不偏离本发明范围的情况下进行结构和功能性修改。而且，虽然本说明书中可使用术语“之上”、“之间”、“之内”等来描述本发明的不同示例性特征和元件，但是这些术语用于本文中仅出于方便，例如根据附图中所述的示例的方向。本说明书中的任何内容都不应理解为需要结构的特定三维方向才落入本发明的范围内。此外，需要说明的是，本发明中的术语“蛋生动物”是指胚胎在蛋壳中孵化的卵生动物。
实施方式一
参阅图1，其代表性地示出了本发明提出的一示例性实施方式的蛋生动物胚胎的可视化培养系统。本发明提出的蛋生动物胚胎的可视化培养系统是以应用于鸡胚胎为例进行说明的。本领域技术人员容易理解的是，为将本发明的相关设计应用于其他类型的禽类或其它蛋生动物，例如蛇等，而对下述的具体实施方式做出的多种改型、添加、替代、删除或其他变化，这些变化仍在本发明提出的蛋生动物胚胎的可视化培养系统的原理的范围内。
如图1所示，在本实施方式中，本发明提出的蛋生动物胚胎的可视化培养系统主要包括胚胎容纳腔100、支撑装置300及摇动装置，在一些实施例中，包含培养箱500，其中胚胎容纳腔100包括由腔壁102围成的中空腔室101，中空腔室呈半卵形，如图1所示，中空腔室的顶部A密封，中空腔室的底部B呈圆弧状；支撑装置300固定并支撑胚胎容纳腔100，以使顶部A朝上；支撑装置300置于摇动装置上，以使后续培养过程中，胚胎容纳腔100的内容物其可随摇动装置摇动，摇动装置置于培养箱500内。
摇动装置包括：平台和至少两个支撑杆，在一些实施例中，也可以包括一个底座。平台用于放置所述支撑装置；支撑杆用于支撑平台，各支撑杆的顶部铰接于所述平台，底部固定连接于底座；其中，支撑杆中的至少一个为可升降的伸缩杆，以带动平台摇动，进而使内容物随平台的摇动而在胚胎容纳腔中摇动。
图2A和图2B分别示出了图1所示的摇动装置不同摇动角度的结构示意图。结合图1和图2A-图2B所示，在一些实施例中，摇动装置包括：平台401及支撑杆：
支撑杆包括至少一个固定杆404、伸缩杆405，其中，平台401用于放置支撑装置300，平台401的形状可以为长方形或圆形等，本公开不限于此。
至少一个固定杆404铰接于平台401，固定杆404不可伸缩升降移动，当伸缩杆405只设置一个时，优选为设置两个以上的固定杆404，以使平台能够保持固定平稳；
伸缩杆405包括固定部4051和伸缩部4052，固定部4051具有空腔，伸缩部4052的一端可上下移动地位于空腔内，一般可通过步进电机406实现，另一端铰接于平台401；电机406连接于伸缩杆405，以驱动伸缩部4052在空腔内上下移动，实现伸缩杆的升降动作，以带动平台401摇动，进而带动其上的支撑装置300摇动，以使胚胎容纳腔100的内容物可在培养过程中摇动而有利于胚胎的孵化。
在一些实施例中，支撑杆还可以全部由伸缩杆405构成，例如，包括至少三个伸缩杆405，形成三角支撑或四角支撑等，在工作时，伸缩杆405中的至少一个与其它伸缩杆的升降幅度不同，以实现摇动装置在不同方向上的摇动，增加内容物摇动的均一性。
在一些实施例中，摇动装置摇动角度为±10°～±30°，摇动频率为15分钟～60分钟/次。现有技术中通常使用的是手动转蛋操作来使内容物在培养过程中摇动，然而，这种手动转蛋操作具有极大的不稳定性，且如果在培养箱内培养，需要经常打开培养箱进行操作。通过采用上述摇动装置使胚胎内容物摇动，避免了手动转蛋操作的不稳定性且提高了摇动角度的精确性，同时无须经常打开培养箱进行摇动培养系统，降低了污染的概率。此外，摇动角度过大会容易导致在转蛋过程中支撑装置滑倒，以致胚胎容纳腔内的胚胎血管破裂死亡，或者胚胎与密封盖黏连导致胚胎缓慢死亡。而本公开发现在上述±10°～±30°的摇动角度下可以有效避免这种情况发生，提高了胚胎的存活率。
为了使蛋生动物胚胎的发育过程可视化，上述的腔壁102和中空腔室的顶部A中至少一者需要采用透明材质，例如，腔壁102以及中空腔室的顶部密封材料可以都选用透明材质，以使得观察者可以全方位360度的观察胚胎发育的过程。培养箱的至少一处也应设有观察部(未图示)，例如，可以采用具有观察窗的培养箱，或者在培养箱内放置摄像头观测。但本发明不限于此。
在一些实施例中，上述的透明材质包括但不限于透明、对胚胎无毒且具有一定透气性的软性材料，例如聚甲基戊烯膜，但本公开不限于此。
以腔壁102为聚甲基戊烯膜(以下简称保鲜膜)为例。图3示出了图1所示的可视化培养系统的胚胎容纳腔的制作工艺流程。如图3所示，首先提供一约30cm×30cm的保鲜膜1021，以卵型模具1022将其拉伸成型，然后将拉伸定型后的保鲜膜1021转入宽口容器1023中。通过构造卵型腔壁，以更好的模拟鸡胚胎发育的物理环境，同时也可以在后续胚胎发育过程中，保持胚胎的位置能够稳定向上。在一些实施例中，可以在宽口容器的中央底部放入小块的棉花等缓冲物(未图示)，然后再将拉伸定型后的保鲜膜转入宽口容器中，这样可以起到缓冲作用，防止后续放入胚胎时发生滑动。在一些实施例中，还可以在该拉伸定型后的保鲜膜转入宽口容器后，在保鲜膜上加入钙添加剂，例如乳酸钙等，以补充无蛋壳孵化缺失的钙质。
在一些实施例中，还包括在中空腔室的上部开设多个第一通气孔1024，一般地，在距离支撑装置顶部5cm左右处的薄膜斜面上开孔，且孔位置不能低于胚胎的最高点，以保证胚胎发育过程中，能够得到足够的气体交换，避免胚胎缺氧。第一通气孔的数量为10～20个，例如可以为10个、12个、15个等，但不限于此，以能够保证胚胎正常发育设置即可。开设第一通气孔1024的方法可以采用打孔器1025，例如电烙铁等，但本发明不限于此。
在一些实施例中，支撑装置300为具有开口端A’和封闭端B’的透明容器，腔壁102固定于开口端A’，且胚胎容纳腔100的底部B与封闭端B’之间具有间隔，以使胚胎容纳腔100不接触支撑装置300的封闭端B’。其中，透明容器可以为透明塑料杯(例如，聚苯乙烯塑料杯、聚碳酸酯塑料杯等)、玻璃杯等，但本发明不限于此。
以支撑装置300为透明塑料杯为例，还包括在该支撑装置300上开设第二通气孔301。图4示出了图1所示的可视化培养系统的支撑装置的制作工艺流程。
如图4所示，首先提供一个支撑装置300，例如透明塑料杯，在一些实施例中，还可以对该透明塑料杯的下部开设第二通气孔301，第二通气孔301的位置一般在该支撑装置300的侧壁中间位置与底部之间，例如在该杯底的杯身底部约三分之一处，但本发明不限于此；第二通气孔301可以采用打火机、火焰喷枪等直接在杯身的上述特定位置处烧出，但本发明不限于此，根据支撑装置300的材质不同可以采用不同的方式打孔；第二通气孔的孔径约为1cm，但本发明不限于此。
在第二通气孔301开设完成后，可使用封闭件3010，例如脱脂棉等将该第二通气孔301封闭，然后向支撑装置300中加入抑菌剂3020，例如抗生素等备用。需注意的是，抑菌剂的量不超过该第二通气孔301的高度。
下面具体说明采用前述的可视化培养系统进行蛋生动物胚胎培养的过程：
图5示出了本发明一示例性实施方式的蛋生动物胚胎的可视化培养系统的培养方法流程图，图6示出了图5的可视化培养方法的示意图。结合图5和图6所示，本发明的蛋生动物胚胎的可视化培养方法包括步骤如下：提供含有蛋生动物胚胎的种蛋；将种蛋的内容物转移至胚胎容纳腔的中空腔室，并调整胚胎位置向上；固定胚胎容纳腔于支撑装置，并密封中空腔室的顶部；将支撑装置置于摇动装置的平台上，种蛋内容物随摇动装置摇动，并于培养箱内进行可视化培养。
具体地，如图6所示，首先提供一个已定型拉伸后并放入宽口容器1023中的保鲜膜1021，该保鲜膜1021上已加入了乳酸钙，然后提供一含有蛋生动物胚胎的种蛋X，并将该种蛋的内容物转移至该保鲜膜1021上。
其中，在一些实施例中，种蛋的内容物转移前，种蛋需要先进行预先孵化培养，一般地，在37.8℃～38℃，相对湿度为60％～70％，摇动装置的摇动角度为±45°，摇动频率为2小时一次的条件下，培养48小时～50小时。
例如，在本实施例中，该种蛋首先在38℃，相对湿度(RH)为60％的条件下，置于摇动装置上培养，其中摇动角度为±45°，摇动频率为1次/1～2小时，培养约48小时左右。需要说明的是，在胚胎移植到人工培养装置前，通常需要对胚胎进行一段时间的培养发育，一般认为55小时最为适宜，对转移后的胚胎影响最小。然而，本公开的培养装置及方法对于移植胚胎前的培养时间要求相对较广。具体地：
在一些实施例中，所述种蛋预先培养48小时～50小时后转移所述内容物。此时胚胎虽然培育时间较短，但由于本公开改进的培养装置和方法，使得胚胎仍能够按照要求很好的发育。
在一些实施例中，所述种蛋预先培养58～72小时后转移内容物至本公开的培养装置。本领域可知，种蛋预先培养时间越长，胚胎发育相对较完全，但相应地，转移难度也随之增大。尤其是培养装置如果设计的不好，胚胎很容易对新的培育环境不适应，造成死亡。而采用本公开的培养装置和方法，胚胎即使在预先培养相对较长的时间后，仍能实现很好的发育。这在某些应用方面是具有重要意义的，例如，可以相对延长营救时间的范围，使得在野外获得的破损种蛋更容易被获救。
在胚胎按照要求培养好以后，将培养好的种蛋的赤道部用铅笔划线(打开蛋壳受力均匀)，用手捏住眼科剪子(尺寸小适合操作)的尖部在蛋壳赤道部旋转钻出一个小口。需要注意的是，捏住剪子的部位在剪子尖部0.3厘米，以免留的太长会在打洞时伤害到胚胎。然后沿铅笔线左右剪开赤道部的1/3左右的长度，切口向下，此时胚胎在上方，打开蛋壳时对胚胎的损伤较少。用双手的拇指和食指抓住切口处的两侧蛋壳，两手向反方向，向外向上45度角匀速用力打开蛋壳，然后将种蛋内容物轻轻转移至前述的保鲜膜1021上。如图6所示，此时该种蛋内容物中的胚胎位置向上，蛋清没有损伤，以使胚胎更好的发育。如果胚胎的位置在底部或者损伤了蛋清，使胚胎歪向一侧会非常不利于后续胚胎的发育，如果操作时用力过猛会导致蛋黄破损胚胎流血死亡。
接着，将含有种蛋内容物的保鲜膜1021的四个角提起，向外翻转保鲜膜用胶套套在塑料杯的杯口处固定，留下2厘米左右的保鲜膜并剪掉多余保鲜膜，将保鲜膜四周拉开，避免产生褶皱和气泡。
采用打孔器1025，例如电烙铁，在保鲜膜1021上开设约10～12个小孔，用于胚胎气体交换。然后采用透明的密封装置对中空腔室的顶部密封，密封装置可以是透明的密封盖200。通过盖上密封盖200，完成胚胎容纳腔的固定和密封。其中，密封盖的材料可以是透明塑料或玻璃等，例如，聚苯乙烯塑料盖。
如图1所示，将密封好后的可视化培养系统置于培养箱500内，进行蛋生动物胚胎的可视化培养。其中，培养箱可采用本领域高精度的培养箱或孵化箱，且放置有摇动装置。
在一些实施例中，培养箱内的温度设定为37.8℃～38℃，相对湿度为60％～70％，摇动装置的摇动角度为±10°～±30°，摇动频率为15分钟～60分钟/次，胚胎在其中培养至21天可孵化。例如，在本实施例中，培养箱500内的温度保持在37.8℃～38℃之间，相对湿度为60％～70％，摇动角度为±30°，摇动频率为1小时/次，定时转蛋培养约19天。在约第17天左右时，也即胚胎发育至肺呼吸启动时，向封闭件3010插入输气管，另一端连接输氧装置，以通过第二通气孔301向塑料杯内供给氧气，供养的流量约为400mL/h～450mL/h，例如，可以为500mL/h，但本发明不限于此。大约20～21天开始，即可随时为出雏做准备。
在一些实施例中，胚胎发育至孵化完成前1～2天左右时，例如19～20天时，还可以将胚胎容纳腔转移至硬质半卵型容器中，并继续通入氧气培养。发明人经过大量实验发现，发育20天左右的胚胎经常容易不明原因的骤然死亡，影响生存率和出雏率。经仔细观察孵化后期的每一个细节，发现胚胎不知道自己处在无壳的状态，会用喙去啄壳，碰不到蛋壳(薄膜是软的)以致于动作越来越激烈，而浪费了太多的体力导致死亡。而在胚胎发育至孵化完成前1～2天左右时，例如19-20天，开始有啄壳动作的时候，将胚胎容纳腔从支撑装置上取下来，同时保持通着氧气，让其四肢能够触碰到一些硬的东西，例如硬质半卵型容器，使得胚胎蹬到以后，不去拼命蹬腿，从而可降低死亡率。经大量试验验证，上述这种操作可大大提高胚胎的生存率和出雏率，到第21天的生存率为90％以上。
通过采用上述培养系统和培养方法，可以实现全方位的观察鸡胚胎发育过程中的每一处细节，包括鸡胚心跳的出现，脑、眼、四肢的形成及发育，胚胎的逐渐成型，胚胎外围丰富血管网的扩张等等。此外，该方法除了培养鸡胚胎，还可以用于培养鹅，鸭，鸡，鹌鹑，中华鳖等，均具有相对稳定的出雏率。同时，还可对胚胎进行各种操作，施加药物，可用于药物筛选等的研究。
实施方式二
该实施方式与实施方式一的培养系统和培养方法设计大致相同，区别在于采用天然蛋壳作为胚胎容纳腔。以下将对该实施方式二的培养系统和培养方法与实施方式一的主要区别进行说明。
在本实施方式中，采用胚胎容纳腔为蛋壳，中空腔室的顶部采用蛋清将前述的薄膜材料与蛋壳密封。其中，作为胚胎容纳腔的蛋壳选用相对鸡蛋较大的鹅蛋或鸭蛋的蛋壳为宜。
以鸭蛋壳作为胚胎容纳腔为例，将其在38℃，RH 60％，转蛋角度为±45°，转蛋频率1次/1-2小时的条件下培养72小时左右。然后采用牙科钻或开蛋器将其打开。准备一清洗并孵化好的鸡种蛋，将该种蛋的内容物首先移到前述的宽口容器中的保鲜膜上，然后再将保鲜膜移入到鸭蛋壳内，剪开约四分之三的保鲜膜，将保鲜膜缓慢抽出。相比于将种蛋内容物直接置于鸭蛋壳，采用这种方式对于胚胎的转移更缓和，可有效避免胚胎在移植过程中因各种机械性损伤外界环境影响过大而死亡。
移植好胚胎后，向鸭蛋壳内滴加抗生素，并吸净气泡。然后使用蛋清或前述的薄膜材料进行封口，将封口后的鸭蛋壳放入前述的培养箱中培养孵化，大约第21天开始，即可随时为出雏做准备。
通过采用天然蛋壳作为胚胎容纳腔，可充分利用天然蛋壳自身的结构条件，例如透气性，以及蛋壳自身的钙质等培育胚胎，不需要补充乳酸钙、繁琐氧气供应装置和大量氧气；同时通过蛋壳上方的透明密封部位也可观察到胚胎的发育情况。此外，本实施方式的方法，由于只需要比破损种蛋的重量大20克以上的其他鸟蛋，满足温度、湿度、转蛋条件就可以实现胚胎的发育，更有利于野外破损蛋壳的挽救。采用该方法也可实时观察胚胎存活及发育，可反复对胚胎进行各种操作，施加药物等，同时出雏率也具有一定保障。经济效益高，生存率高(约90％)，孵化率为78％以上，适合进行胚胎发育、胚胎操作、免疫耐受、药物筛选以及环境污染物质检测鉴定等各种研究。
实施方式三
该实施方式与实施方式一、二的培养系统和培养方法设计大致相同，区别在于本实施方式的方法采用蛋壳胚胎容纳腔和薄膜胚胎容纳腔联用的方式实现胚胎的培养。具体地，包括：
提供以薄膜材料作为腔壁的第一胚胎容纳腔——即薄膜胚胎容纳腔以及以蛋壳为腔壁的第二胚胎容纳腔——即蛋壳胚胎容纳腔；
将种蛋的内容物按照实施方式一的方式首先转移至第一胚胎容纳腔进行一次培养4天～5天；需要注意的是，转移的时间不宜过早也不宜过晚，过早有可能错过胚胎发育现象较明显的部分，不利于科学研究发现；过晚转移，有可能胚胎的部分血管已与薄膜壁粘连，不利于胚胎的转移。因此，以胚胎培养4～5天为宜。
将一次培养后的胚胎按照实施方式二的方式转移至第二胚胎容纳腔进行二次培养至胚胎孵化。
发明人经大量实验发现，胚胎在蛋壳胚胎容纳腔的生存率与孵化率是相对较高的。因此，本发明采用这种蛋壳胚胎容纳腔和薄膜胚胎容纳腔联用的方式，首先将初期胚胎移植到薄膜胚胎容纳腔中，可全方位的观察胚胎发育过程中的血管生成、胚胎雏形形成等现象，更有利于教学实验和科学研究过程；当胚胎发育到一定程度后，再将胚胎转移到更适于孵化的蛋壳胚胎容纳腔进行培养，其中不需要补充乳酸钙、繁琐氧气供应装置和大量氧气，且进一步提高了胚胎的存活率及孵化率。经大量试验验证，采用这种联用培养的方式，大大提高了胚胎的生存率和孵化率。胚胎的生存率可达92％。
综上，本发明的蛋生动物胚胎的可视化培养系统为研究和观察蛋生动物胚胎的发育提供了极大的便利。采用该培养系统进行蛋生动物胚胎的培养，尤其是禽类胚胎的培养，可实时观察胚胎的发育过程，并在培养过程中可反复对胚胎进行施药等操作，并能够保证一定的出雏率。由于该培养系统还设置有摇动装置，可实现培养过程中对胚胎的自动摇动以及摇动角度的精确化，相比于手动转蛋操作，可降低污染概率，提高胚胎孵化率。
本发明提供一种蛋生动物胚胎的可视化培养系统，包括：胚胎容纳腔、支撑装置及摇动装置，胚胎容纳腔用于容纳从种蛋中分离出来的内容物，内容物包含蛋生动物胚胎；支撑装置固定并支撑胚胎容纳腔；支撑装置置于所述摇动装置上，并随摇动装置的摇动使内容物在胚胎容纳腔内摇动；其中，胚胎容纳腔为半卵形的中空腔室，该中空腔室包括顶部和下部的腔壁，所述顶部和腔壁二者中至少一者采用透明材质，以可视化地观察所述蛋生动物胚胎的发育过程。
在一些实施例中，摇动装置包括：平台和至少两个支撑杆，平台用于放置支撑装置；至少两个支撑杆用于支撑平台，各支撑杆的顶部连接于平台；其中支撑杆中的至少一个为可升降的伸缩杆，以带动平台摇动。摇动装置还包括底座，各支撑杆的底部固定连接于底座。支撑杆包括至少一个固定杆。支撑杆包括至少三个伸缩杆，伸缩杆中的至少一个与其它伸缩杆的升降幅度不同。所述伸缩杆各自连接有用于驱动其自动伸缩的步进电机。
在一些实施例中，透明材质为透明聚甲基戊烯膜。中空腔室的上部开设有多个第一通气孔。支撑装置为具有开口端和封闭端的透明容器，腔壁固定于开口端，且胚胎容纳腔的底部与封闭端之间具有间隔。采用透明的密封装置对支撑装置的开口端密封。支撑装置的侧壁开设有第二通气孔。在一些实施例中，腔壁为蛋壳，中空腔室的顶部采用透明材质密封。
在一些实施例中，可视化培养系统还包括培养箱，用于容纳胚胎容纳腔、支撑装置和摇动装置，以进行蛋生动物胚胎的人工孵化。
本发明还提供一种蛋生动物胚胎的可视化培养方法，采用上述可视化培养系统，包括步骤如下：提供含有蛋生动物胚胎的种蛋；将种蛋的内容物转移至胚胎容纳腔的中空腔室，并调整胚胎位置向上；固定胚胎容纳腔于支撑装置；将支撑装置置于摇动装置的平台上，内容物随摇动装置摇动，以进行可视化培养。
在一些实施例中，还包括：提供以薄膜材料为腔壁的第一胚胎容纳腔和以蛋壳作为腔壁的第二胚胎容纳腔；将种蛋的内容物转移至第一胚胎容纳腔进行一次培养4天～5天；将一次培养后的胚胎转移至第二胚胎容纳腔进行二次培养至胚胎孵化。可视化培养至所述胚胎的肺呼吸启动后，向可视化培养系统内通入氧气，通入氧气的流量为400mL/h～450mL/h。胚胎发育至孵化完成前1～2天时，将第二胚胎容纳腔转移至硬质半卵型容器中，并继续通入氧气培养。
在一些实施例中，内容物转移前，种蛋预先培养48小时～50小时。根据本发明的一个实施方式，内容物转移前，在中空腔室中加入钙添加剂。摇动装置摇动的角度范围为±10°～±30°，摇动频率为15分钟～60分钟/次。支撑装置中加入抑菌剂。
本发明还提供上述可视化培养系统在胚胎发育学、药物筛选、疾病研究中的应用。本发明还提供上述可视化培养系统作为教学实验工具的应用。
该可视化培养系统可应用于教学观摩以及科研领域，例如，鸡胚尿囊膜具有非常丰富的血管网络，且血管网络均具有非常旺盛的生长增殖能力。因此鸡胚尿囊膜通常被认为是非常良好的研究血管生长促进/抑制作用的生物模型。采用本发明的可视化培养系统可实时观察鸡胚发育的情况，通过在尿囊膜上覆盖滴加有影响血管增殖的滤纸片，经过若干天培养观察，统计滤纸片附近血管数量变化差异，进而研究药物对血管增值/抑制的影响。
本公开的可视化培养系统还可以用于鸡胚尿囊绒毛膜培养系统培养动物组织块的相关研究。鸡胚尿囊-绒毛膜(Chorioallantoic membrane，CAM)为鸡胚发育过程中形成的重要胚外膜系统，类似于人类胎盘结构。其具有丰富的血管网络，起到向鸡胚运送氧气、营养物质，并带走代谢废物的作用。由于鸡胚发育过程中，具有可供给生物生存的几乎所有营养物质及细胞因子，CAM培养系统通常被认为是供给组织培养的优秀平台。而采用本发明的可视化培养系统可以很好的观察各类组织在鸡胚中的发育过程。
除上述应用外，本发明的可视化培养系统及方法还可应用于生物发育学研究、药理研究、药物筛选、毒性物质检测、环境污染物质对胚胎生长发育的影响检测、人类疾病模型的建立、濒危动物保护、营养学研究、先天性疾病研究、心血管发育及疾病研究、器管形成及畸形研究等，具有重要价值和应用前景。
本领域技术人员应当注意的是，本发明所描述的实施方式仅仅是示范性的，可在本发明的范围内作出各种其他替换、改变和改进。因而，本发明不限于上述实施方式，而仅由权利要求限定。

Claims (10)

1.一种蛋生动物胚胎的可视化培养系统，其特征在于，包括：
胚胎容纳腔，用于容纳从种蛋中分离出来的内容物，所述内容物包含所述蛋生动物胚胎；
支撑装置，固定并支撑所述胚胎容纳腔；及
摇动装置，所述支撑装置放置在所述摇动装置上，并随所述摇动装置的摇动使所述内容物在所述胚胎容纳腔内摇动；
其中，所述胚胎容纳腔为半卵形的中空腔室，该中空腔室包括顶部和下部的腔壁，所述顶部和腔壁二者中至少一者采用透明材质，以可视化地观察所述蛋生动物胚胎的发育过程。
2.根据权利要求1所述的可视化培养系统，其特征在于，所述摇动装置包括：
平台，用于放置所述支撑装置；
至少两个支撑杆，用于支撑所述平台，所述支撑杆各自的顶部铰接于所述平台；
其中，所述支撑杆中的至少一个为可升降的伸缩杆，以带动所述平台摇动。
3.根据权利要求1所述的可视化培养系统，其特征在于，所述中空腔室的上部开设有多个第一通气孔。
4.根据权利要求1所述的可视化培养系统，其特征在于，所述支撑装置为具有开口端和封闭端的透明容器，所述腔壁固定于所述开口端，且所述胚胎容纳腔的底部与所述封闭端之间具有间隔。
5.根据权利要求4所述的可视化培养系统，其特征在于，采用透明的密封装置对所述支撑装置的开口端密封。
6.根据权利要求1所述的可视化培养系统，其特征在于，所述腔壁为蛋壳，所述中空腔室的顶部采用所述透明材质密封。
7.根据权利要求1～6中任一项所述的可视化培养系统，其特征在于，所述可视化培养系统还包括培养箱，用于容纳所述胚胎容纳腔、所述支撑装置和所述摇动装置，以进行所述蛋生动物胚胎的人工孵化。
8.一种蛋生动物胚胎的可视化培养方法，采用权利要求1～7中任一项所述的可视化培养系统，包括步骤如下：
提供含有蛋生动物胚胎的种蛋；
将所述种蛋的内容物转移至所述胚胎容纳腔的中空腔室，并调整所述胚胎位置向上；
固定所述胚胎容纳腔于所述支撑装置；
将所述支撑装置置于所述摇动装置的平台上，启动所述摇动装置，使所述内容物随所述摇动装置而摇动，以进行所述可视化培养。
9.根据权利要求8所述的可视化培养方法，其特征在于，还包括：
提供以薄膜材料为腔壁的第一胚胎容纳腔和以蛋壳作为腔壁的第二胚胎容纳腔；
将所述种蛋的内容物转移至所述第一胚胎容纳腔进行一次培养4天～5天；
将所述一次培养后的胚胎转移至所述第二胚胎容纳腔进行二次培养至胚胎孵化。
10.根据权利要求1～7中任一项所述的可视化培养系统在胚胎发育学、药物筛选、疾病研究中的应用。
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