CN110607302A - 检测花生四烯酸脂氧合酶aloxe3基因启动子突变的方法及其应用 - Google Patents

检测花生四烯酸脂氧合酶aloxe3基因启动子突变的方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种与难治性癫痫相关的ALOXE3基因启动子，所述启动子具有如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列以及该启动子的构建方法。还提供了一种检测与难治性癫痫相关的ALOXE3基因启动子突变的引物以及ALOXE3基因启动子的突变位点，其所述突变位点为‑50G>C。本发明所检测的难治性癫痫患者ALOXE3基因启动子突变位点，可应用于难治性癫痫的诊断，提升难治性癫痫患者的早期诊断率，对指导癫痫临床治疗具有重要的参考价值。

Description

检测花生四烯酸脂氧合酶ALOXE3基因启动子突变的方法及其 应用
技术领域
本发明属于人体基因工程技术领域，具体涉及一种检测花生四烯酸脂氧合酶ALOXE3基因启动子突变的方法，可应用于难治性癫痫等神经发育异常相关疾病发生发展的分子机理研究和临床诊断。
背景技术
癫痫是一类神经发育异常性神经系统疾病，其发病机制非常复杂，涉及到中枢神经系统中一系列生理、生化、免疫或遗传等方面的组织及细胞内环境变化。随着癫痫发病机制研究的不断深入及抗癫痫药物逐渐完善，临床上对癫痫发作的控制率有了明显的提升，但仍然有20％左右的癫痫患者不能达到理想的控制。因此，寻找和发现对控制癫痫发作有重要作用的关键基因，揭示其参与控制癫痫发作的分子机制，为癫痫的临床诊治提供新的作用靶点，有助于进一步提升控制癫痫发作的效率。
基于以上思路，本发明人采用高通量全转录组及蛋白免疫印迹分析了海人酸诱导的自发性癫痫发作小鼠形成过程不同阶段(12小时、10天及6周)基因表达图谱，发现处在癫痫发作潜伏期及自发性癫痫阶段小鼠海马组织中花生四烯酸脂氧合酶-3(Arachidonatelipoxygenase 3，ALOXE3)表达下调，提示ALOXE3表达上调很可能参与控制癫痫发作。ALOXE3属于脂氧合酶家族成员，其主要功能是作为氢过氧化物异构酶转化其他LOX与花生四烯酸(Arachidonic acid，AA)的初级代谢产物氢过氧化物为相应的环氧醇和酮衍生物，其中代谢途径产物Hepoxilin A3(HxA3)。已有研究证实LOX代谢通路在细胞信号和修饰膜结构中发挥重要作用。神经细胞中代谢产物AA在癫痫发作时上升，AA可作用于钾离子通道导致神经元兴奋性增高；而代谢途径产物HxA3可引起细胞膜超极化并增强抑制性突触后电位，从而降低神经元兴奋性，上述研究进一步提示：ALOXE3表达下调可能是引发癫痫发作的重要因素。
ALOXE3在脑组织中的功能研究尚未见报道。本发明人研究发现，ALOXE3在胚胎及新生小鼠脑组织低水平表达，而在出生后至成年脑组织表达不断增加，可能与神经发育及维持正常神经兴奋性密切相关，而出生后1天至7天小鼠与脑组织部分神经元由兴奋性向抑制性转变的关键时期，也是人类癫痫发作的敏感期。
综上所述，ALOXE3表达异常与神经发育过程兴奋性转变及癫痫发作密切相关。因此ALOXE3基因的表达调控区变异位点可作为癫痫的临床筛查的重要靶位点，提升癫痫的临床诊治率。
发明内容
本发明的第一个目的，是为了提供一种与难治性癫痫相关的ALOXE3基因启动子。
本发明的第二个目的，是为了提供一种与难治性癫痫相关的ALOXE3基因启动子的构建方法。
本发明的第三个目的，是为了提供一种检测与难治性癫痫相关的ALOXE3基因启动子突变的引物。
本发明的第四个目的，是为了提供ALOXE3基因启动子的突变位点。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案实现：
第一目的：一种与难治性癫痫相关的ALOXE3基因启动子，所述启动子具有如SEQID NO：1所示的核苷酸序列。
本发明的ALOXE3基因启动子序列通过以下方法获得：采用5′RACE法鉴定ALOXE3基因的转录起始点，首先以脑组织mRNA进行5′RACE实验，其所需要的引物包括如SEQ ID NO：2～5所示的核苷酸序列，然后对5′RACE的产物进行PCR扩增及克隆并测序，获得该基因的转录起始点与如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列(见附图1)。并且优选地，所述ALOXE3基因启动子能使荧光素酶报告基因在人神经胶质细胞瘤细胞U251中表达。
第二目的：一种与难治性癫痫相关的ALOXE3基因启动子的构建方法，包括以下步骤：
(1)根据ALOXE3基因启动子序列设计所需引物；
(2)以正常人外周血的DNA作为模板，进行PCR扩增；
(3)将扩增的PCR产物载入表达质粒中，构建ALOXE3基因启动子区报告基因表达质粒。
本发明采用双荧光素酶(荧火虫荧光素酶与海肾荧光素酶)报告系统用于鉴定所获得的DNA片段是否具有启动子活性。以正常人外周血DNA作为模板进行PCR扩增，获得启子区的DNA片段，所需要的引物包括SEQ ID NO：6～10所示的核苷酸序列(见表2)；所提供的ALOXE3基因启动子区的序列为“ALOXE3-F0.8、ALOXE3-F0.5、ALOXE3-F0.3、ALOXE3-F0.2”；然后将上述启动子片段亚克隆到荧光素酶报告基因表达质粒中构建成ALOXE3基因启动子区报告基因表达质粒；分别将构建的含有不同启动子片段的重组质粒、阳性和阴性对照质粒，以及内参质粒转染人源性HEK-293细胞和NT2细胞中，鉴定启动子活性。结果表明：本发明所获得的DNA序列均能表达荧光素酶，均具有启动子活性(附图2C)。
第三目的：一种检测与难治性癫痫相关的ALOXE3基因启动子突变的引物，所述引物包括如SEQ ID NO：11～12所示的核苷酸序列。
本发明以Dravet综合征患者及正常人外周血DNA作为模板进行PCR扩增，使用的PCR引物包括如SEQ ID NO：11～12所示的核苷酸序列，获得启子区的DNA片段，然后进行测序，比较患者及正常人启动子区等位基因频率差异，获得变异位点。本发明从62名Dravet综合征患者中鉴定出5个变异位点(见表5)，其中4个变异位点等位基因频率与正常人相比较无统计学差异，另外1个变异位点(-50G>C)出现在2名耐药癫痫患者中，而正常人无此变异位点(附图3)。
第四目的：ALOXE3基因启动子的突变位点，所述突变位点为-50G>C。
通过将-50G>C突变位点引入本发明的启动子报告质粒，采用荧光报告系统检测突变对启动子活性的影响，结果表明-50G>C突变是的报告基因表达下调(见附图4)。从62名Dravet综合征患者中检测出1个变异位点(-50G>C)出现在2名耐药癫痫患者中，与正常人相比较有统计学差异。生物信息学分析发现该位点所在的序列是核心转录因子TFII-I及GATA-1共同作用位点，-50G>C突变很可能影响到这两个转录因子与转录元件的结合，影响基因表达。因此，ALOXE3基因启动子突变位点-50G>C可以应用于难治性癫痫的诊断，如果患者携带-50G>C突变位点，可初步判断该患者很可能会发展为难治性癫痫发作，建议临床医生尽早采取合理的治疗措施。
本发明的有益效果：ALOXE3基因所编码的ALOXE3蛋白是花生四烯酸代谢途径的关键酶，而花生四烯酸代谢途径的底物、中间产物及终产物与神经网络兴奋性密切相关；部分难治性癫痫患者ALOXE3基因启动子突变导致ALOXE3表达下调，可能是其对现有抗癫痫药物造成耐受的重要原因，从而形成难治性癫痫。因此，本发明所检测的难治性癫痫患者ALOXE3基因启动子突变位点，通过构建突变启动子的双荧光素酶报告基因质粒分析其突变启动子对基因表达的影响，可应用于难治性癫痫的诊断，提升难治性癫痫患者的早期诊断率，对指导癫痫临床治疗具有重要的参考价值。
附图说明
图1为通过5′RACE法获得人脑胶质瘤U251细胞ALOXE3基因RT-PCR片段及测序后的序列示意图(A为RACE-PCR扩增产物电泳图，其中DNA ladder为DNA分子量标记；5′RACEproduct为5′RACE-PCR扩增产物；B为目标PCR片段测序的序列，其中序列中箭头所示位点为转录起始点，加框的ATG为翻译起始密码子)。
图2为ALOXE3基因启动子在人脑胶质瘤U251细胞指导报告基因表达(A为双荧光素酶报告基因质粒阳性(pGL4.13)、阴性对照(pGL4.13)及内参(pRL-TK)；B为ALOXE3基因启动子表达载体构建示意图；C为不同长度启动子片段在U251细胞的荧光素酶相对活性，与阴性对照pGL4.10相比较，*P<0.01,**P<0.001，n＝10；n.s.表示无统计差异)。
图3为-50G>C突变位点的家系分析及测序结果示意图(A为携带-50G>C突变位点的家系图谱；B为患者及家系成员的测序结果；其中箭头示突变碱基)。
图4为-50G>C突变位点下调ALOXE3基因启动子的活性示意图(A为突变质粒示意图；B为野生及-50G>C突变启动子报告质粒在HEK293及U251细胞中的活性比较分析，*P<0.01,n＝10)。
图5为难治性癫痫患者临床检测的技术路线示意图。
具体实施方式
为了更加简洁明了的展示本发明的技术方案、目的和优点，下面结合具体实施例及其附图对本发明做进一步的详细描述。
实施例1：鉴定ALOXE3基因的转录起始点
(1)实验材料：
①细胞株、菌株及质粒：人U251细胞，大肠杆菌DH5α；pUC19 Vector。
②主要试剂及试剂盒：HiPure Universal RNA Mini Kit总RNA提取试剂盒，RACE 5′/3′Kit试剂盒，质粒提取试剂盒。
③5′RACE实验所使用的引物(见表1)：
表1：5′RACE实验所使用的引物
(2)实验过程：
首先采用Magen公司生产的HiPure Universal RNA Mini Kit(货号：D4130-02)从人脑胶质瘤U251细胞中提取总RNA,该试剂盒能自动去除残存的DNA。采用5′RACE法获得ALOXE3基因5′非翻译区(5′UTR)全长序列，找到ALOXE3基因的转录起始点，操作过程参照Clontech公司生产的RACE 5′/3′Kit试剂盒(货号：634858)说明进行。大致过程如下：采用T4 RNA Ligase将5′RACE Adaptor连接到mRNA的5′端；用Oliog dT引物进逆转录合成cDNA第1链；然后使用5′RACE Adaptor上的外侧引物与ALOXE3基因特异性的外侧引物(ALO-P1)进行第一轮PCR反应，再用5′RACE Adaptor上的内侧引物与ALOXE3基因特异性的内侧引物(ALO-P2)进行第二轮RT-PCR反应，高特异性地扩增到ALOXE3基因cDNA 5′末端的全长序列的PCR片段(图1A)；然后将PCR片段回收后，通过基因重组克隆到pUC19质粒上，进行酶切分析与测序鉴定，根据序列上将序列5′RACE Adaptor内侧引物的位置确定转录起始点(如图1B)。
实施例2：ALOXE3基因启动子的制备及其活性鉴定
(1)实验材料：
①组织、细胞株、菌株及质粒：正常人外周血，U251细胞，大肠杆菌DH5α，克隆质粒pMD 19-T Simple Vector，荧光素酶报告基因活性测定相关质粒：pGL4.10 Vector、pGL4.13 Vector、pRL-TK Vector(附图2A)。
②主要试剂及试剂盒：外周血DNA提取试剂盒，质粒提取试剂盒，双荧素酶报告系统Reporter Assay System试剂盒。
③ALOXE3基因启动子片段重组质粒构建所采用的引物(见表2)：
表2：ALOXE3基因启动子片段重组质粒构建所采用的引物
④扩增获得的ALOXE3基因启动子片段(见表3)
表3：ALOXE3基因启动子片段
基因启动子片段名称 SEQ ID NO.
ALOXE3-F0.8 11
ALOXE3-F0.5 12
ALOXE3-F0.3 13
ALOXE3-F0.2 14
(2)操作过程：
首先将5′RACE-PCR产物获得的序列在NCBI BLAST程序进行对比，获得转录起始点及其上游1kb片段序列，并根据序列设计克隆ALOXE3不同长度的启动子片段所需的引物(见表2)。然后采DNA提取试剂盒抽提外周血DNA作为PCR模板，进行PCR扩增，PCR产物克隆到pMD19-T Simple Vector上构建重组质粒，通过测序鉴定所获得的启动子片段。再通过双酶切(Nhe I与Hind III)将不同长度的启动子片段亚克隆至荧光素酶报告质粒pGL4.10上，分别构建成一系列不同长度启动子报告基因重组粒pGL4-ALOXE3-F0.8、pGL4-ALOXE3-F0.5、pGL4-ALOXE3-F0.3及pGL4-ALOXE3-F0.2(附图2B)。将上述重组质粒，阳性对照质粒pGL4.13及阴性对照质粒pGL4.10分别与内参质粒pRL-TK共转染人U251细胞，转染24小时后收集细胞，采Promega公司生产的双荧光素酶报告基因试剂盒测定细胞中的荧光值，最后根据(荧火虫荧光素酶与海肾荧光素酶)相对荧光值分析启动子活性，具体操作过程参考试剂盒上的说明进行。分析结果表明：长为800bp的启动子片段在U251细胞中的活性最强(附图2C)。
实施例3：难治性癫痫患者ALOXE3基因启动子区突变位点的筛查
(1)实验材料：
①组织材料：正常人及难治性癫痫患者外周血。
②主要试剂及试剂盒：外周血DNA提取试剂盒，PCR扩增所需的相关试剂。
③ALOXE3基因启动子片段筛查所采用的引物(表4)：
表4：ALOXE3基因启动子片段筛查所采用的引物
引物名称 核苷酸序列 SEQ ID NO
启动子区上游 5′-GAGAGATCATAGGCCTGCATCCATCC-3′ 15
启动子区下游 5′-CCGGCAAACAGGGTCTGAATGC-3′ 16
(2)实验过程：
首先收集60名难治性癫痫患者及60名正常人的外周血，采用Transgen Biotech公司生产的外周血DNA抽提试剂盒(EasyPure Blood Genomic DNA Kit，货号：E121)抽提血细胞DNA；以DNA为模板进行PCR扩增，获得PCR产物，回收PCR产物进行测序，通过测序峰及序列比对分析获得变异位点；然后将变异位点在NCBI SNP数据库查询，鉴定是突变位点还是多态位位点。本发明从62名Dravet综合征患者中鉴定出5个变异位点(见表5)，其中4个变异位点等位基因频率与正常人相比较无统计学差异，另外1个变异位点(-50G>C)出现在2名耐药癫痫患者中，而正常人无此变异位点(附图3)。生物信息学分析发现该位点所在的序列是核心转录因子TFII-I及GATA-1共同作用位点，-50G>C突变很可能影响到这两个转录因子与转录元件的结合，影响基因表达。因此，-50G>C突变位点可用于Dravet综合征患者的筛查位点。
表5：难治性癫痫患者与正常人对比筛查出的突变位点
实施例4：ALOXE3基因启动子区突变位点-50G>的功能鉴定
(1)实验材料：
①细胞株及质粒：U251细胞及HEK-293细胞，大肠杆菌DH5α，克隆质粒pMD 19-TSimple Vector，荧光素酶报告基因活性测定相关质粒：pGL-4.10Vector、pGL-4.13Vector、pRL-TK Vector。
②主要试剂及试剂盒：定点诱变试剂盒，质粒提取试剂盒，双荧素酶报告系统Reporter Assay System试剂盒。
③ALOXE3基因启动子区-50G>C定点诱变所采用的引物(见表6)：
表6：ALOXE3基因启动子区-50G>C定点诱变所采用的引物
(2)操作过程：
首先采用Stratagene公司生产的定点诱变剂盒(QuikChange Multi Site-Directed Mutagenesis Kit，货号：210515)将野生型启动子报告基因质粒pGL4-ALOXE3-F0.8进行定点诱变，获得携带-50G>C突变位点的突变重组质粒pGL4-ALOXE3-F0.8-G50C，具体构建过程参考试剂盒说明进行。将野生型启动子报告基因质粒及突变质粒分别与内参质粒pRL-TK共转染U251细胞和HEK293细胞，根据(荧火虫荧光素酶与海肾荧光素酶)相对荧光值分析启动子活性，比较两组质粒的相对启动子活性。结果表明：在转染U251细胞和HEK293细胞中，-50G>C突变可降低报告基因表达(附图4)。
实施例5：ALOXE3基因启动子突变位点-50G>C在难治性癫痫诊断中的应用
具体实施过程如下(附图5)：
(1)采用含肝素(抗凝剂)的采血管收集癫痫患者的外周血2mL。
(2)采用外周血DNA提取试剂盒抽提外周血细胞的总DNA，具体操作过程参考试剂盒说明进行，采用分光光度计(OD260/OD280)分析总DNA样品的质量及浓度，将DNA样品稀释至200ng/μl。
(3)采用实施例3所设计的引物进行PCR扩增，PCR反应体如下：总DNA1μl，Ex-Taq酶0.5μl，启动子区上游引物(10μM)1μl，启动子区下游引物(10μM)1μl，10×Toptaq Buffer缓冲液5μl，dNTPs(2.5mM)4μl，补充无核酸酶的去离子水至总体系50μl。PCR扩增反应条件如下：首先采用94℃条件变性5分钟；然后按照以下参数进行32个循环：94℃30秒，58℃30秒，72℃30秒；最后72℃延伸5分钟。
(4)取5μl PCR扩增样品用琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物的大小(200bp左右)是否与预期相符。
(5)其余PCR扩增样品送至商业公司测序，测序引物为启动子区上游引物(见实施例3)，根据附图3所示的测序峰图确定患者是否携带突变位点。
(6)如果患者携带-50G>C突变位点，可初步判断该患者很可能会发展为难治性癫痫发作，建议临床医生尽早采取合理的治疗措施。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 广州医科大学附属第二医院
<120> 检测花生四烯酸脂氧合酶ALOXE3基因启动子突变的方法及其应用
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ggcgccggaa ccggccgcgc ggggccgctg cgggctatgg gcttctctga gaggttcctc 300
cccagtccct agtggcccag atcccggaca cctgggctcc cgcccaggat cctgcaggcc 360
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gcaaagacat gccgcccgaa cagggacttg aaccctggac cctcagatta aaagtctgat 420
gctctaccga ctgagctatc cgggctcttc acgagagctt tactttttgc ttataagagg 480
gttctctata ggaaaagcca ggcttgtaga accgacagag gattttatct gtgcagcata 540
gaatattttg gcacagattt ggaagcagcg ggtgaagctc gcctgctgct gattgagctt 600
tttctgcctc ccgttcttag agcccccgcc gaggctgcga cgcagggact gtaccatagt 660
agaggctgga acagtgcggc gccggaaccg gccgcgcggg gccgctgcgg gctatgggct 720
tctctgagag gttcctcccc agtccctagt ggcccagatc ccggacacct gggctcccgc 780
ccaggatcct gcaggcccag ggcggtcctg gagcggaaag a 821
<210> 12
<211> 482
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
tgcgaagtgc ggtacccaaa agcaaagaca tgccgcccga acagggactt gaaccctgga 60
ccctcagatt aaaagtctga tgctctaccg actgagctat ccgggctctt cacgagagct 120
ttactttttg cttataagag ggttctctat aggaaaagcc aggcttgtag aaccgacaga 180
ggattttatc tgtgcagcat agaatatttt ggcacagatt tggaagcagc gggtgaagct 240
cgcctgctgc tgattgagct ttttctgcct cccgttctta gagcccccgc cgaggctgcg 300
acgcagggac tgtaccatag tagaggctgg aacagtgcgg cgccggaacc ggccgcgcgg 360
ggccgctgcg ggctatgggc ttctctgaga ggttcctccc cagtccctag tggcccagat 420
cccggacacc tgggctcccg cccaggatcc tgcaggccca gggcggtcct ggagcggaaa 480
ga 482
<210> 13
<211> 331
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
ggaaaagcca ggcttgtaga accgacagag gattttatct gtgcagcata gaatattttg 60
gcacagattt ggaagcagcg ggtgaagctc gcctgctgct gattgagctt tttctgcctc 120
ccgttcttag agcccccgcc gaggctgcga cgcagggact gtaccatagt agaggctgga 180
acagtgcggc gccggaaccg gccgcgcggg gccgctgcgg gctatgggct tctctgagag 240
gttcctcccc agtccctagt ggcccagatc ccggacacct gggctcccgc ccaggatcct 300
gcaggcccag ggcggtcctg gagcggaaag a 331
<210> 14
<211> 229
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
ttgagctttt tctgcctccc gttcttagag cccccgccga ggctgcgacg cagggactgt 60
accatagtag aggctggaac agtgcggcgc cggaaccggc cgcgcggggc cgctgcgggc 120
tatgggcttc tctgagaggt tcctccccag tccctagtgg cccagatccc ggacacctgg 180
gctcccgccc aggatcctgc aggcccaggg cggtcctgga gcggaaaga 229
<210> 15
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
gagagatcat aggcctgcat ccatcc 26
<210> 16
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
ccggcaaaca gggtctgaat gc 22
<210> 17
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
ctagctagcg tattgccagc ttctaaatac acat 34
<210> 18
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
cccaagcttc tcattctctg ctctggagta gggc 34

Claims (10)

1.一种与难治性癫痫相关的ALOXE3基因启动子，其特征在于，所述启动子具有如SEQID NO：1所示的核苷酸序列。
2.如权利要求所述的ALOXE3基因启动子，其特征在于，利用5′RACE法进行PCR扩增ALOXE3基因启动子过程中，所使用的引物包括如SEQ ID NO：2～5所示的核苷酸序列。
3.如权利要求所述的ALOXE3基因启动子，其特征在于，所述ALOXE3基因启动子能使荧光素酶报告基因在人神经胶质细胞瘤细胞U251中表达。
4.一种与难治性癫痫相关的ALOXE3基因启动子的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)根据ALOXE3基因启动子序列设计所需引物；
(2)以正常人外周血的DNA作为模板，进行PCR扩增；
(3)将扩增的PCR产物载入表达质粒中，构建ALOXE3基因启动子区报告基因表达质粒。
5.如权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述步骤(1)中的引物包括SEQ ID NO：6～10所示的核苷酸序列。
6.如权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述步骤(3)中所述表达质粒含有荧光素酶报告基因。
7.一种检测与难治性癫痫相关的ALOXE3基因启动子突变的引物，所述引物包括如SEQID NO：11～12所示的核苷酸序列。
8.与难治性癫痫相关的ALOXE3基因启动子在ALOXE3基因变异位点的功能鉴定中的应用。
9.ALOXE3基因启动子的突变位点，其特征在于，所述突变位点为-50G>C。
10.如权利要求9所述的ALOXE3基因启动子突变位点，其特征在于，在难治性癫痫诊断中的应用。
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Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN101255424A (zh) * 2007-11-26 2008-09-03 广州医学院第二附属医院 与癫痫相关scn1a基因的启动子及其构建方法和临床应用
CN109844116A (zh) * 2016-07-05 2019-06-04 约翰霍普金斯大学 包括使用h1启动子对crispr指导rna的改进的组合物和方法

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