CN110592037B - 一种用于催化制备非天然氨基酸的苯丙氨酸脱氢酶及其应用 - Google Patents

一种用于催化制备非天然氨基酸的苯丙氨酸脱氢酶及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于催化制备非天然氨基酸的苯丙氨酸脱氢酶及其应用，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1、2、3或4所示。本发明通过对获得自海洋菌株Bacillus nanhaiensis(CGMCC NO.8969)的苯丙氨酸脱氢酶进行C末端区域改造，获得的变体氨基酸脱氢酶可催化系列非天然氨基酸底物，提高其催化具有大疏水基团的非天然氨基酸的能力，扩展底物谱。

Description

一种用于催化制备非天然氨基酸的苯丙氨酸脱氢酶及其应用
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种用于催化制备非天然氨基酸的苯丙氨酸脱氢酶及其应用。
背景技术
手性氨基酸，包括天然氨基酸和非天然氨基酸，是合成手性药物、手性农药和手性食品添加剂等精细化学品的关键中间体。例如，D-苯甘氨酸是β-内酰胺类半合成抗生素的重要中间体，作为氨苄青霉素、匹夫氨苄等的重要侧链，市场前景广阔。L-苯基丁氨酸(L-Homophenylalanine)，即(S)-2-氨基-4-苯基丁酸是一种非天然的手性α-氨基酸，该氨基酸是20种全球已上市的抗高血压药物血管紧张素抑制剂普利类药物，例如贝那普利、西拉普利、赖若普利、依那普利、地那普利及卡托普利等用于治疗高血压和各种心血管疾病的血管紧张素转换酶抑制剂普利类药物合成的共同手性中间体，作为常见的结构单元起着中心药效基团的作用。年需求量约1000吨且逐年递增。制备大位阻非天然氨基酸主要通过化学合成法和酶催化法。化学合成法存在诸多不足，反应过程复杂；反应条件苛刻；生成成本高；环境污染严重等。酶催化法具有高立体选择性，生产过程简单，反应安全等优势。
氨基酸脱氢酶催化可逆的氨基酸氧化脱氨和酮酸的不对称还原胺化反应。通过对氨基酸脱氢酶的分子改造，可拓展其催化功能用于生物合成系列非天然氨基酸。具有大位阻疏水侧链的手性非天然氨基酸是生物催化合成的技术难点。研究表明发现突变之后的氨基酸脱氢酶底物结合口袋发生了重塑，不仅可以容纳这些大位阻底物，同时拉近了底物与辅酶之间的催化距离，使其获得对大位阻底物的催化活性。但是，对具有大位阻芳香基团侧链和环烷基侧链的底物酮，目前无论是通过基因改造获得的基因工程氨基酸脱氢酶还是筛选获得的天然氨基酸脱氢酶催化活性均较低。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术缺陷，提供一种用于催化制备非天然氨基酸的苯丙氨酸脱氢酶及其应用。
本发明的技术方案如下：
一种用于催化制备非天然氨基酸的苯丙氨酸脱氢酶，其氨基酸序列如SEQ IDNO.1、2、3或4所示，其原始序列来源于海洋菌株Bacillus nanhaiensis(CGMCC NO.8969)的苯丙氨酸脱氢酶。
在本发明的一个优选实施方案中，其催化体系包括：将底物和NAD+溶解于pH＝9-11的甘氨酸-氢氧化钠缓冲溶液中，接着加入10-30％的助溶剂，使得底物的浓度为10～500mM，然后加入权利要求1所述的苯丙氨酸脱氢酶的酶液至该苯丙氨酸脱氢酶浓度为20-200U/L，于10-70℃并搅拌条件下进行反应10-100h。
进一步优选的，其催化体系包括：将底物、甘油和NAD+溶解于pH＝9-11的甘氨酸-氢氧化钠缓冲溶液中，接着加入10-30％的助溶剂，使得甘油的浓度为0.5-3M，NADH浓度为0.2-20mM，底物的浓度为10～500mM，然后加入所述苯丙氨酸脱氢酶的酶液和甘油脱氢酶的酶液至该苯丙氨酸脱氢酶和该甘油脱氢酶的浓度分别为20-200U/L和50-150U/L，于10-70℃并搅拌条件下进行反应10-100h。
更进一步优选的，所述助溶剂为十二烷基硫酸钠、吐温-80、吐温-60、司盘-80、司盘-60、甲醇、乙醇、异丙醇、正丁醇、四氢呋喃、二甲基亚砜、乙酸乙酯、甲基叔丁基醚、乙醚、甲苯、二氧六环、石油醚、正戊烷、环戊烷、正己烷、环己烷和正庚烷中的至少一种。
再进一步优选的，所述甘油脱氢酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.05所示，其来源于Klebsiella pneumoniae。
进一步优选的，其催化体系包括：将甲酸钠和NAD+溶解于pH＝9-11的甘氨酸-氢氧化钠缓冲溶液中，接着加入10-30％的助溶剂，使得甲酸钠的浓度为20-500mM，NADH浓度为0.2-20mM，底物的浓度为10～500mM，然后加入所述苯丙氨酸脱氢酶的酶液和甲酸脱氢酶的酶液至该苯丙氨酸脱氢酶和该甲酸脱氢酶的浓度分别为20-200U/L和50-150U/L，于10-70℃并搅拌条件下进行反应10-100h。
更进一步优选的，所述助溶剂为十二烷基硫酸钠、吐温-80、吐温-60、司盘-80、司盘-60、甲醇、乙醇、异丙醇、正丁醇、四氢呋喃、二甲基亚砜、乙酸乙酯、甲基叔丁基醚、乙醚、甲苯、二氧六环、石油醚、正戊烷、环戊烷、正己烷、环己烷和正庚烷中的至少一种。
再进一步优选的，所述甲酸脱氢酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.06所示，其来源于Candida boidinii。
本发明的有益效果是：
1、本发明通过对获得自海洋菌株Bacillus nanhaiensis(CGMCC NO.8969)的苯丙氨酸脱氢酶进行C末端区域改造，获得的变体氨基酸脱氢酶可催化系列非天然氨基酸底物，提高其催化具有大疏水基团的非天然氨基酸的能力，扩展底物谱。
2、本发明通过构建多种多酶耦联体系，实现辅酶的循环再生，有利于其在制药领域中的应用。
3、本发明操作方便，具有产品光学纯度高、收率高等优点，设备简单，在生物催化制备非天然氨基酸领域具有较好的工业应用前景。
附图说明
图1为本发明实施例1至4中所得的用于催化制备非天然氨基酸的苯丙氨酸脱氢酶的电泳图，其中，M，DNA分子量标准品；1，SEQ ID NO.1片段；2，SEQ ID NO.2片段；3，SEQ IDNO.3片段；4，SEQ ID NO.4片段。
图2本发明实施例1至4中的用于催化制备非天然氨基酸的苯丙氨酸脱氢酶的SDS-PAGE图，其中，M，蛋白分子量标准；1，SEQ ID NO.1蛋白；2，SEQ ID NO.2蛋白；3，SEQ IDNO.3蛋白；4，SEQ ID NO.4蛋白。
图3为本发明实施例5和6的反应原理图，其中R1为C2-10的烷基、芳香基或羟基，R可任选被取代基取代一次或多次，R2为H或者酯基。
具体实施方式
以下通过具体实施方式结合附图对本发明的技术方案进行进一步的说明和描述。
实施例1：氨基酸脱氢酶突变体基因的构建：
(1)为了提高来源于Bacillus nanhaiensis(CGMCC NO.8969)的氨基酸脱氢酶的催化活性，构建C-末端减少4个氨基酸的突变体其氨基酸序列为SEQ ID NO.1，具体步骤如下：采用PCR法构建5’端和3’端分别带有NdeI和Xhol酶切位点的苯丙氨酸脱氢酶基因，PCR合成过程由上海生工生物工程技术服务有限公司完成。如图1所示，PCR扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定后，胶回收PheDH基因片段，用NdeI和XhoI酶切酶进行双酶切，回收酶切产物，与同样双酶切的pET-28a质粒(带有His-tag标签)进行连接，连接好的质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)，得到pET28a-PheDH质粒。将上述质粒转化至E.coli BL21(DE3)，得到可表达带His-tag标签的苯丙氨酸脱氢酶的重组表达菌株E.coli BL21(DE3)/pET28a。
(2)粗酶液的制备：重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET28a的培养：以1％的接种量，将菌种接入200mL LB培养基中。LB培养基的组成为10.0g/L胰蛋白胨，5.0g/L酵母浸膏，10g/LNaCl。培养条件为：起始pH 7.0，装液量体积分数为10％，培养温度37℃，摇床转速200rpm，培养时间6小时。加入诱导剂IPTG，使其终浓度为10mg/mL，继续在25℃、200rpm条件下培养12小时。
培养结束获得的发酵液，在冷冻离心机中离心(4℃，8000rpm，15min)获得细胞，弃上清液，沉淀用磷酸缓冲液(pH＝7～7.4)重悬，充分洗涤后离心，重复操作3次，用磷酸缓冲液(pH 7～7.4)配制成浓度为50～150g/L的细胞悬液。
将制备的细胞悬液置于冰浴中，利用超声破碎仪对细胞液进行处理，细胞破碎仪探头置于液面下1cm，破碎条件为超声3秒，间隔6秒，超声60次，功率200W。然后4℃、12,000rpm离心15min去除不溶性细胞碎片，上清即为含有带His-tag标签的苯丙氨酸脱氢酶的粗酶液。
(3)氨基酸脱氢酶纯酶制备：采用GE公司的His Trap镍柱(HistrapTMHP，5mL)对步骤(1)得到的粗酶液进行分离纯化，并用PALL公司的10K的超滤离心管进行超滤除盐。所述的纯化过程采用的纯化柱为能够特异性纯化带有His-tagged标签的蛋白质的HisTrap HP柱，其步骤包括平衡、上样、平衡、洗脱、柱子再生；收集洗脱的部分并利用超滤离心管进行除盐；除盐后获得的液体即为纯化的如图2所示的带His-tag标签的苯丙氨酸脱氢酶的纯酶溶液。
(4)酶活力检测：催化反应体系包含40mM NADH、0.2mol/L甘氨酸-氢氧化钠缓冲溶液(pH 9.5)，助溶剂为20％的异丙醇，40mM的2-氧代-4-苯基丁酸乙酯和20mg/ml酶，37℃下反应，340nm波长下测定酶活。酶活力定义为在上述条件下，每分钟氧化消耗(或生成)1μmolNAD+所需要的酶量为一个酶活力单位。测定酶活为0.192U/mg。
(5)产物分析：利用NMR进行底物分析，获得NMR图谱为1H NMR：δ1.86-1.98(2H，1.92(dt，J＝7.6，7.4Hz)，1.92(dt，J＝7.6，7.4Hz))，2.61-2.69(2H，2.65(t，J＝7.4Hz)，2.65(t，J＝7.4Hz))，3.44(1H，t，J＝7.6Hz)，7.14-7.21(3H，7.18(tt，J＝7.7，1.3Hz)，7.17(dddd，J＝7.8，1.3，1.1，0.5Hz))，7.26(2H，dddd，J＝7.8，7.7，1.8，0.5Hz).符合L-苯基丁氨酸的特征。
实施例2
(1)为了提高来源于Bacillus nanhaiensis的苯丙氨酸脱氢酶催化非天然氨基酸的活性，构建C-末端减少8个氨基酸的突变体，序列如SEQ ID NO.2所示；具体步骤如下：采用PCR法构建5’端和3’端分别带有NdeI和Xhol酶切位点的苯丙氨酸脱氢酶基因，PCR合成过程由上海生工生物工程技术服务有限公司完成。如图1所示，PCR扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定后，胶回收PheDH基因片段，用NdeI和XhoI酶切酶进行双酶切，回收酶切产物，与同样双酶切的pET-28a质粒(带有His-tag标签)进行连接，连接好的质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)，得到pET28a-PheDH质粒。将上述质粒转化至E.coli BL21(DE3)，得到可表达带His-tag标签的苯丙氨酸脱氢酶的重组表达菌株E.coli BL21(DE3)/pET28a。
实验步骤(2)-(3)、(5)参照实施例1的步骤(2)-(3)、(5)。
(4)酶活力检测：催化反应体系包含200mM NADH、0.5mol/L甘氨酸-氢氧化钠缓冲溶液(pH 11)，助溶剂为10％的乙腈，80mM的L-2-羰基-5-苯基戊酮酸和60mg/ml酶，40℃下反应，340nm波长下测定酶活。酶活力定义为在上述条件下，每分钟氧化消耗(或生成)1μmolNAD+所需要的酶量为一个酶活力单位。测定酶活为0.223U/mg。
利用NMR进行底物分析，获得NMR图谱为1H NMR：61.67-1.90(4H，1.75(tt，J＝7.4，7.3Hz)，1.84(dt，J＝7.6，7.4Hz)，1.84(dt，J＝7.6，7.4Hz)，1.75(tt，J＝7.4，7.3Hz))，2.56-2.65(2H，2.60(t，J＝7.3Hz)，2.60(t，J＝7.3Hz))，3.43(1H，t，J＝7.6Hz)，7.14-7.20(3H，7.18(tt，J＝7.7，1.3Hz)，7.17(dddd，J＝7.8，1.3，1.1，0.5Hz))，7.26(2H，dddd，J＝7.8，7.7，1.8，0.5Hz).符合L-2-氨基-5-苯基戊酸的特征。
实施例3
(1)为了提高来源于Bacillus nanhaiensis的苯丙氨酸脱氢酶催化非天然氨基酸的活性，构建C-末端减少12个氨基酸的突变体，序列如SEQ D NO.3所示；具体步骤如下：
采用PCR法构建5’端和3’端分别带有NdeI和Xhol酶切位点的苯丙氨酸脱氢酶基因，PCR合成过程由上海生工生物工程技术服务有限公司完成。如图1所示，PCR扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定后，胶回收PheDH基因片段，用NdeI和XhoI酶切酶进行双酶切，回收酶切产物，与同样双酶切的pET-28a质粒(带有His-tag标签)进行连接，连接好的质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)，得到pET28a-PheDH质粒。将上述质粒转化至E.coli BL21(DE3)，得到可表达带His-tag标签的苯丙氨酸脱氢酶的重组表达菌株E.coli BL21(DE3)/pET28a。
实验步骤(2)-(3)、(5)参照实施例1的步骤(2)-(3)、(5)。
(4)酶活力检测：催化反应体系包含100mM NADH、0.6mol/L甘氨酸-氢氧化钠缓冲溶液(pH 11)，助溶剂为30％的丙醇，40mM的L-2-羰基-3-苯基丁酮酸和80mg/ml酶，35℃下反应，340nm波长下测定酶活。酶活力定义为在上述条件下，每分钟氧化消耗(或生成)1μmolNAD+所需要的酶量为一个酶活力单位。测定酶活为0.22U/mg。利用NMR进行产物分析，获得NMR图谱1H NMR：δ1.26(3H，d，J＝6.7Hz)，3.18(1H，dq，J＝7.1，6.7Hz)，3.64(1H，d，J＝7.1Hz)，7.21(2H，dddd，J＝7.8，1.3，1.2，0.5Hz)，7.28-7.40(3H，7.35(dddd，J＝7.8，7.7，1.9，0.5Hz)，7.31(tt，J＝7.7，1.3Hz)).符合产物L-2-氨基-3-苯基丁酸的特征。
实施例4
(1)为了提高来源于Bacillus nanhaiensis的苯丙氨酸脱氢酶催化非天然氨基酸的活性，构建C-末端减少16个氨基酸的突变体，序列如SEQ ID NO.4所示；具体步骤如下：
采用PCR法构建5’端和3’端分别带有NdeI和Xhol酶切位点的苯丙氨酸脱氢酶基因，PCR合成过程由上海生工生物工程技术服务有限公司完成。如图1所示，PCR扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定后，胶回收PheDH基因片段，用NdeI和XhoI酶切酶进行双酶切，回收酶切产物，与同样双酶切的pET-28a质粒(带有His-tag标签)进行连接，连接好的质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)，得到pET28a-PheDH质粒。将上述质粒转化至E.coli BL21(DE3)，得到可表达带His-tag标签的苯丙氨酸脱氢酶的重组表达菌株E.coli BL21(DE3)/pET28a。
实验步骤(2)-(3)、(5)参照实施例1的步骤(2)-(3)、(5)。
(4)酶活力检测：催化反应体系包含200mM NADH、0.4mol/L甘氨酸-氢氧化钠缓冲溶液(pH 9)，助溶剂为30％的二甲基亚砜，200mM的对甲基苯丙酮酸和50mg/ml酶，25℃下反应，340nm波长下测定酶活。酶活力定义为在上述条件下，每分钟氧化消耗(或生成)1μmolNAD+所需要的酶量为一个酶活力单位。测定酶活为0.13U/mg。利用NMR进行产物分析，获得NMR图谱1H NMR：δ2.25(3H，s)，2.99-3.04(2H，3.01(d，J＝7.6Hz)，3.01(d，J＝7.6Hz))，3.64(1H，t，J＝7.6Hz)，7.02(2H，ddd，J＝8.0，1.2，0.5Hz)，7.20(2H，ddd，J＝8.0，1.4，0.5Hz)符合的L-对甲基苯丙氨酸的特征。
实施例5
本实施例原理如图3所示：
(1)-(3)实验步骤同实施例1的步骤(1)-(3)。
(4)辅酶再生酶甘油脱氢酶的制备：
菌株构建、培养与收集：构建如SEQ ID NO.05所示的甘油脱氢酶基因，甘油脱氢酶基因序列来源于Klebsiella pneumoniae，利用上述甘油脱氢酶基因制备可表达甘油脱氢酶的工程菌重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)-gldA；以1％的接种量，将菌种接入200mL LB培养基中，接种前添加氨苄霉素使其终浓度为50μg/mL。37℃、200rpm培养时间6小时。加入诱导剂IPTG，使其终浓度为10mg/ml，继续在30℃、200rpm条件下培养4小时。粗酶液制备及纯酶制备步骤同上述氨基酸脱氢酶的粗酶液制备及纯酶制备步骤，即得甘油脱氢酶。
(5)利用氨基酸脱氢酶与辅酶再生酶构建多酶耦联体系，本实施例之中为氨基酸脱氢酶-甘油脱氢酶耦联体系：加入氨基酸脱氢酶酶液与甘油脱氢酶酶液，并使氨基酸脱氢酶与甘油脱氢酶的终浓度均为150U/L，得到氨基酸脱氢酶-甘油脱氢酶耦联体系；催化反应体系包含0.5M的甘油，60mM NAD+、0.2mol/L甘氨酸-氢氧化钠缓冲溶液(pH 9)，助溶剂为10％的甲醇，70mM的邻甲基苯丙酮酸和30mg/ml酶，37℃下反应，340nm波长下测定酶活。酶活力定义为在上述条件下，每分钟氧化消耗(或生成)1μmol NAD+所需要的酶量为一个酶活力单位。测定氨基酸脱氢酶酶活为0.34U/mg。
(6)分离与检测：利用NMR进行产物分析，获得NMR图谱1H NMR：1H NMR：δ2.22(3H，s)，3.02-3.06(2H，3.04(d，J＝7.6Hz)，3.04(d，J＝7.6Hz))，3.65(1H，t，J＝7.6Hz)，6.96-7.08(2H，7.03(ddd，J＝8.0，7.6，2.2Hz)，6.99(ddd，J＝8.0，1.6，0.5Hz))，7.17-7.27(2H，7.22(ddd，J＝7.8，7.6，1.6Hz)，7.20(ddd，J＝7.8，2.2，0.5Hz)).符合产物L-邻甲基苯丙氨酸的特征。
实施例6
本实施例原理如图3所示：
(1)-(3)实验步骤同实施例1的步骤(1)-(3)。
(4)辅酶再生酶甲酸脱氢酶的制备：
菌株构建、培养与收集：甲酸脱氢酶：菌株构建、培养与收集：构建如SEQ ID NO.06所示的甲酸脱氢酶基因，甲酸脱氢酶基因序列来源于Candida boidinii，利用上述甲酸脱氢酶基因制备可表达甲酸脱氢酶的工程菌重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)-fdh；以1％的接种量，将菌种接入200mL LB培养基中，接种前添加卡那霉素使其终浓度为40μg/mL。37℃、转速200rpm培养时间6小时。加入诱导剂IPTG，使其终浓度为10mg/ml，继续在30℃、200rpm条件下培养4小时。
粗酶液制备及纯酶制备步骤同实施例1步骤(1)中氨基酸脱氢酶的粗酶液制备及纯酶制备步骤，即得甲酸脱氢酶。
(5)利用氨基酸脱氢酶与辅酶再生酶构建多酶耦联体系，本实施例中为氨基酸脱氢酶-甲酸脱氢酶耦联体系：
将甲酸铵与NAD+溶于浓度为300mM，pH值为10的氯化铵-氨水缓冲液中，甲酸铵的加入量为300mM，NAD+的添加量为0.2g/L，加入氨基酸脱氢酶与甲酸脱氢酶酶液，并使氨基酸脱氢酶与甲酸脱氢酶的终浓度均为100U/L，得到氨基酸脱氢酶-甲酸脱氢酶耦联体系；底物对氟苯丙酮酸的加入量为400mM，利用所述氨基酸脱氢酶-甲酸脱氢酶耦联体系在60℃、200rpm条件下催化反应36小时。测定氨基酸脱氢酶酶活为0.25U/mg。
(6)分离与检测：利用NMR进行产物分析，获得NMR图谱1H NMR：1H NMR：δ2.25(3H，s)，2.99-3.04(2H，3.01(d，J＝7.6Hz)，3.01(d，J＝7.6Hz))，3.64(1H，t，J＝7.6Hz)，7.02(2H，ddd，J＝8.0，1.2，0.5Hz)，7.20(2H，ddd，J＝8.0，1.4，0.5Hz).符合产物L-4-氟苯丙氨酸的特征。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。
序列表
<110> 厦门大学
<120> 一种用于催化制备非天然氨基酸的苯丙氨酸脱氢酶及其应用
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 362
<212> PRT
<213> Bacillus nanhaiensis
<400> 1
Met Phe Glu Lys Ile Ser Gln His Glu Gln Val Val Phe Cys Asn Asp
1 5 10 15
Pro Ser Thr Gly Leu Lys Ala Ile Ile Ala Ile His Asn Thr Thr Leu
20 25 30
Gly Pro Ala Leu Gly Gly Cys Arg Met Arg Pro Tyr Gly Ser Val Asp
35 40 45
Glu Ala Leu Glu Asp Val Leu Arg Leu Ser Lys Gly Met Thr Tyr Lys
50 55 60
Cys Ala Gly Ala Asp Val Asp Phe Gly Gly Gly Lys Ser Val Ile Ile
65 70 75 80
Gly Asp Pro Met Thr Asp Arg Thr Pro Glu Leu Phe Arg Ala Phe Gly
85 90 95
Gln Phe Val Asp Ser Leu Asn Gly Arg Phe Tyr Thr Gly Thr Asp Met
100 105 110
Gly Thr Thr Pro Asp Asp Phe Met His Ala Leu Lys Glu Thr Asn Cys
115 120 125
Ile Val Gly Val Pro Glu Glu Tyr Gly Gly Ser Gly Asp Ser Ser Val
130 135 140
Pro Thr Ala Gln Gly Val Ile Tyr Gly Leu Gln Ala Thr Ile Gln Thr
145 150 155 160
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165 170 175
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180 185 190
Thr Gln Ile Tyr Val Thr Asp Ile Asn Glu Lys Ala Leu Lys Met Ile
195 200 205
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210 215 220
Ser Asp Ile Tyr Gly Val Asp Ala Asp Ile Phe Ile Pro Cys Ala Leu
225 230 235 240
Gly Gly Ile Ile His Asp Glu Thr Ile Glu Gln Leu Lys Val Lys Ala
245 250 255
Ile Val Gly Ser Ala Asn Asn Gln Leu Leu Glu Asp Lys His Gly Leu
260 265 270
Tyr Leu Gln Gln Lys Gly Ile Leu Tyr Gly Pro Asp Tyr Ile Val Asn
275 280 285
Ala Gly Gly Leu Ile Gln Val Ala Asp Glu Leu Tyr Gly Pro Asn Lys
290 295 300
Ala Arg Val Leu Thr Lys Thr Arg Ala Ile Tyr Asp Ser Leu Ile Gln
305 310 315 320
Ile Tyr Ser Glu Ser Thr Lys Asn Gln Ile Ser Thr Met Glu Ala Ala
325 330 335
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340 345 350
Phe Phe Ala His Asn Arg Arg Pro Lys Trp
355 360
<210> 2
<211> 358
<212> PRT
<213> Bacillus nanhaiensis
<400> 2
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Pro Ser Thr Gly Leu Lys Ala Ile Ile Ala Ile His Asn Thr Thr Leu
20 25 30
Gly Pro Ala Leu Gly Gly Cys Arg Met Arg Pro Tyr Gly Ser Val Asp
35 40 45
Glu Ala Leu Glu Asp Val Leu Arg Leu Ser Lys Gly Met Thr Tyr Lys
50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
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145 150 155 160
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165 170 175
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180 185 190
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195 200 205
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210 215 220
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225 230 235 240
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245 250 255
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260 265 270
Tyr Leu Gln Gln Lys Gly Ile Leu Tyr Gly Pro Asp Tyr Ile Val Asn
275 280 285
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290 295 300
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305 310 315 320
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325 330 335
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355
<210> 3
<211> 354
<212> PRT
<213> Bacillus nanhaiensis
<400> 3
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1 5 10 15
Pro Ser Thr Gly Leu Lys Ala Ile Ile Ala Ile His Asn Thr Thr Leu
20 25 30
Gly Pro Ala Leu Gly Gly Cys Arg Met Arg Pro Tyr Gly Ser Val Asp
35 40 45
Glu Ala Leu Glu Asp Val Leu Arg Leu Ser Lys Gly Met Thr Tyr Lys
50 55 60
Cys Ala Gly Ala Asp Val Asp Phe Gly Gly Gly Lys Ser Val Ile Ile
65 70 75 80
Gly Asp Pro Met Thr Asp Arg Thr Pro Glu Leu Phe Arg Ala Phe Gly
85 90 95
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100 105 110
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115 120 125
Ile Val Gly Val Pro Glu Glu Tyr Gly Gly Ser Gly Asp Ser Ser Val
130 135 140
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145 150 155 160
Leu Glu Gly Thr Asp Glu Leu Ser Gly Lys Ser Tyr Ser Ile Gln Gly
165 170 175
Leu Gly Lys Val Gly Phe Lys Val Ala Glu Gln Leu Leu Ala Ala Gly
180 185 190
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195 200 205
Gln Glu Arg Ala Glu Leu Leu Pro Gly Asn Val Glu Val Val Glu Gly
210 215 220
Ser Asp Ile Tyr Gly Val Asp Ala Asp Ile Phe Ile Pro Cys Ala Leu
225 230 235 240
Gly Gly Ile Ile His Asp Glu Thr Ile Glu Gln Leu Lys Val Lys Ala
245 250 255
Ile Val Gly Ser Ala Asn Asn Gln Leu Leu Glu Asp Lys His Gly Leu
260 265 270
Tyr Leu Gln Gln Lys Gly Ile Leu Tyr Gly Pro Asp Tyr Ile Val Asn
275 280 285
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290 295 300
Ala Arg Val Leu Thr Lys Thr Arg Ala Ile Tyr Asp Ser Leu Ile Gln
305 310 315 320
Ile Tyr Ser Glu Ser Thr Lys Asn Gln Ile Ser Thr Met Glu Ala Ala
325 330 335
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Phe Phe
<210> 4
<211> 350
<212> PRT
<213> Bacillus nanhaiensis
<400> 4
Met Phe Glu Lys Ile Ser Gln His Glu Gln Val Val Phe Cys Asn Asp
1 5 10 15
Pro Ser Thr Gly Leu Lys Ala Ile Ile Ala Ile His Asn Thr Thr Leu
20 25 30
Gly Pro Ala Leu Gly Gly Cys Arg Met Arg Pro Tyr Gly Ser Val Asp
35 40 45
Glu Ala Leu Glu Asp Val Leu Arg Leu Ser Lys Gly Met Thr Tyr Lys
50 55 60
Cys Ala Gly Ala Asp Val Asp Phe Gly Gly Gly Lys Ser Val Ile Ile
65 70 75 80
Gly Asp Pro Met Thr Asp Arg Thr Pro Glu Leu Phe Arg Ala Phe Gly
85 90 95
Gln Phe Val Asp Ser Leu Asn Gly Arg Phe Tyr Thr Gly Thr Asp Met
100 105 110
Gly Thr Thr Pro Asp Asp Phe Met His Ala Leu Lys Glu Thr Asn Cys
115 120 125
Ile Val Gly Val Pro Glu Glu Tyr Gly Gly Ser Gly Asp Ser Ser Val
130 135 140
Pro Thr Ala Gln Gly Val Ile Tyr Gly Leu Gln Ala Thr Ile Gln Thr
145 150 155 160
Leu Glu Gly Thr Asp Glu Leu Ser Gly Lys Ser Tyr Ser Ile Gln Gly
165 170 175
Leu Gly Lys Val Gly Phe Lys Val Ala Glu Gln Leu Leu Ala Ala Gly
180 185 190
Thr Gln Ile Tyr Val Thr Asp Ile Asn Glu Lys Ala Leu Lys Met Ile
195 200 205
Gln Glu Arg Ala Glu Leu Leu Pro Gly Asn Val Glu Val Val Glu Gly
210 215 220
Ser Asp Ile Tyr Gly Val Asp Ala Asp Ile Phe Ile Pro Cys Ala Leu
225 230 235 240
Gly Gly Ile Ile His Asp Glu Thr Ile Glu Gln Leu Lys Val Lys Ala
245 250 255
Ile Val Gly Ser Ala Asn Asn Gln Leu Leu Glu Asp Lys His Gly Leu
260 265 270
Tyr Leu Gln Gln Lys Gly Ile Leu Tyr Gly Pro Asp Tyr Ile Val Asn
275 280 285
Ala Gly Gly Leu Ile Gln Val Ala Asp Glu Leu Tyr Gly Pro Asn Lys
290 295 300
Ala Arg Val Leu Thr Lys Thr Arg Ala Ile Tyr Asp Ser Leu Ile Gln
305 310 315 320
Ile Tyr Ser Glu Ser Thr Lys Asn Gln Ile Ser Thr Met Glu Ala Ala
325 330 335
Asn Leu Phe Cys Glu Glu Lys Leu Leu Ala Arg Ser Lys Arg
340 345 350
<210> 5
<211> 1116
<212> DNA
<213> Klebsiella pneumoniae
<400> 5
atgctaaaag ttattcaatc tccagccaaa tatcttcagg gtcctgatgc tgctgttctg 60
ttcggtcaat atgccaaaaa cctggcggag agcttcttcg tcatcgccga cgatttcgta 120
atgaagctgg cgggagagaa agtggtgaat ggcctgcaga gccacgatat tcgctgccat 180
gcggaacggt ttaacggcga atgcagccat gcggaaatca accgtctgat ggcgattttg 240
caaaaacagg gctgccgcgg cgtggtcggg atcggcggtg gtaaaaccct cgataccgcg 300
aaggcgatcg gttactacca gaagctgccg gtggtggtga tcccgaccat cgcctcgacc 360
gatgcgccaa ccagcgcgct gtcggtgatc tacaccgaag cgggcgagtt tgaagagtat 420
ctgatctatc cgaaaaaccc ggatatggtg gtgatggaca cggcgattat cgccaaagcg 480
ccggtacgcc tgctggtctc cggcatgggc gatgcgctct ccacctggtt cgaggccaaa 540
gcttgctacg atgcgcgcgc caccagcatg gccggaggac agtccaccga ggcggcgctg 600
agcctcgccc gcctgtgcta tgatacgctg ctggcggagg gcgaaaaggc ccgtctggcg 660
gcgcaggccg gggtagtgac cgaagcgctg gagcgcatca tcgaggcgaa cacttatctc 720
agcggcattg gctttgaaag cagtggcctg gccgctgccc acgcaatcca caacggtttc 780
accattcttg aagagtgcca tcacctgtat cacggtgaga aagtggcctt cggtaccctg 840
gcgcagctgg tgctgcagaa cagcccgatg gacgagattg aaacggtgct gggcttctgc 900
cagcgcgccg gcctgccggt gacgctcgcg cagatgggcg tcaaagaggg gatcgacgag 960
aaaatcgccg cggtggcgaa agccacctgc gcggaagggg aaaccatcca taatatgccg 1020
tttgcggtga ccccggagag cgtccatgcc gctatcctca ccgccgatct gttaggccag 1080
cagtggctgg cgcgtcacca ccaccaccac cactga 1116
<210> 6
<211> 1092
<212> DNA
<213> 博伊丁假丝酵母(Candida boidinii)
<400> 6
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tacggatcta cggaaaataa actggggatc gccaattggc tgaaagatca gggccacgaa 120
ctgatcacca caagtgataa agaaggggaa acaagcgaat tggataagca tattccggat 180
gcagatatca ttattactac gccgtttcat ccagcatata tcaccaaaga acgcctcgat 240
aaagctaaga acctgaagtt ggtggtagtc gcaggggtgg ggtcggatca tattgacctg 300
gattacatta atcagaccgg gaaaaaaatt tctgtgttag aagttaccgg cagtaatgtc 360
gtttctgtgg ccgaacacgt ggttatgacc atgttggttc tggtgcgcaa ctttgtgcca 420
gcacatgaac agattatcaa tcacgactgg gaggttgccg cgatcgcaaa agacgcctac 480
gatatcgaag gaaaaactat cgctactatc ggtgcgggcc gcatcggtta tcgtgttttg 540
gagcgtcttc tgccttttaa cccgaaagag ctcttatatt acgattatca ggccttaccg 600
aaagaagcgg aagagaaagt aggtgcgcgt cgtgtggaaa atatcgaaga attagtagcg 660
caagcagata tcgtgacggt gaacgcgcct ctccatgccg gtacgaaagg cctgattaat 720
aaggaactcc tgtccaaatt caaaaaaggt gcgtggcttg tgaataccgc tcgcggtgcg 780
atttgcgtcg ctgaagacgt ggcggcagcg ctggagagcg gccaacttcg cggttatggc 840
ggtgacgtat ggtttccgca gccggctccg aaagaccacc catggcgcga catgcgtaac 900
aaatatggcg cgggcaacgc catgaccccg cattattcgg gtaccaccct ggatgcccaa 960
acccggtacg cagagggcac caagaatatt ctggagtcat ttttcacggg caaattcgat 1020
tatcggccgc aggatattat tctgttgaac ggagagtatg ttacgaaggc ctatggcaaa 1080
cacgataaaa ag 1092

Claims (8)

1.一种用于催化制备非天然氨基酸的苯丙氨酸脱氢酶，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID NO.1、2、3或4所示。
2.一种非天然氨基酸的催化制备方法，其特征在于：其催化体系包括：将底物和NAD+溶解于pH＝9-11的甘氨酸-氢氧化钠缓冲溶液中，接着加入10-30％的助溶剂，使得底物的浓度为10～500mM，然后加入权利要求1所述的苯丙氨酸脱氢酶的酶液至该苯丙氨酸脱氢酶浓度为20-200U/L，于10-70℃并搅拌条件下进行反应10-100h。
3.如权利要求2所述的催化制备方法，其特征在于：其催化体系包括：将底物、甘油和NAD+溶解于pH＝9-11的甘氨酸-氢氧化钠缓冲溶液中，接着加入10-30％的助溶剂，使得甘油的浓度为0.5-3M，NADH浓度为0.2-20mM，底物的浓度为10～500mM，然后加入所述苯丙氨酸脱氢酶的酶液和甘油脱氢酶的酶液至该苯丙氨酸脱氢酶和该甘油脱氢酶的浓度分别为20-200U/L和50-150U/L，于10-70℃并搅拌条件下进行反应10-100h。
4.如权利要求3所述的催化制备方法，其特征在于：所述助溶剂为十二烷基硫酸钠、吐温-80、吐温-60、司盘-80、司盘-60、甲醇、乙醇、异丙醇、正丁醇、四氢呋喃、二甲基亚砜、乙酸乙酯、甲基叔丁基醚、乙醚、甲苯、二氧六环、石油醚、正戊烷、环戊烷、正己烷、环己烷和正庚烷中的至少一种。
5.如权利要求3或4所述的催化制备方法，其特征在于：所述甘油脱氢酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.05所示。
6.如权利要求2所述的催化制备方法，其特征在于：其催化体系包括：将甲酸钠和NAD+溶解于pH＝9-11的甘氨酸-氢氧化钠缓冲溶液中，接着加入10-30％的助溶剂，使得甲酸钠的浓度为20-500mM，NADH浓度为0.2-20mM，底物的浓度为10～500mM，然后加入所述苯丙氨酸脱氢酶的酶液和甲酸脱氢酶的酶液至该苯丙氨酸脱氢酶和该甲酸脱氢酶的浓度分别为20-200U/L和50-150U/L，于10-70℃并搅拌条件下进行反应10-100h。
7.如权利要求6所述的催化制备方法，其特征在于：所述助溶剂为十二烷基硫酸钠、吐温-80、吐温-60、司盘-80、司盘-60、甲醇、乙醇、异丙醇、正丁醇、四氢呋喃、二甲基亚砜、乙酸乙酯、甲基叔丁基醚、乙醚、甲苯、二氧六环、石油醚、正戊烷、环戊烷、正己烷、环己烷和正庚烷中的至少一种。
8.如权利要求6或7所述的催化制备方法，其特征在于：所述甲酸脱氢酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.06所示。
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