CN110577963B - 提高枯草芽孢杆菌CRISPR-Cas9n系统基因组多位点编辑效率的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了提高枯草芽孢杆菌CRISPR‑Cas9n系统基因组多位点编辑效率的方法，包括如下步骤：根据编辑位点，构建枯草芽孢杆菌CRISPR‑Cas9n基因组编辑系统；(2)敲除待编辑枯草芽孢杆菌菌株的ligD基因，所述ligD基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.90所示；(3)将步骤(1)获得的枯草芽孢杆菌CRISPR‑Cas9n基因组编辑系统导入步骤(2)获得的重组菌中进行基因组多位点编辑。本发明的方法可以提高枯草芽孢杆菌CRISPR‑Cas9n系统基因组多位点编辑效率。利用枯草芽孢杆菌CRISPR‑Cas9n基因组编辑系统，提升枯草芽孢杆菌BS89的核黄素生产能力。

Description

提高枯草芽孢杆菌CRISPR-Cas9n系统基因组多位点编辑效率 的方法

技术领域

本发明属于基因组编辑技术与代谢工程领域，具体涉及提高枯草芽孢杆菌CRISPR-Cas9n系统基因组多位点编辑效率的方法及在代谢工程中应用。

背景技术

高效的基因组编辑工具是代谢网络调控的关键。随着系统生物学的发展和开发微生物细胞工厂的需要，对代谢网络的优化调控已经逐渐从对单一基因或途径的调控发展为对多靶点、多途径的同时修饰。因此，多重基因组编辑工具的开发是基因编辑技术领域的重要内容。

以具有切口酶活性的Cas9n为基础的CRISPR-Cas9n基因组编辑技术克服了Cas9系统对宿主细胞生长压力大，双链切口不利于修复且脱靶率高的缺点。同时在多位点基因组编辑时，单链切口不会过多的破坏基因组的完整性，因此有更高的编辑效率。

目前枯草芽孢杆菌传统基因组编辑技术中，无法实现高效的2位点以上基因编辑。此外，近年来随着CIRSPR技术在基因编辑领域的广泛应用，显著提高了枯草芽孢杆菌的基因编辑效率。目前枯草芽孢杆菌CRISPR-Cas9n系统多位点编辑效率较低。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种提高枯草芽孢杆菌CRISPR-Cas9n系统基因组多位点编辑效率的方法。

本发明的第二个目的是提供一种利用枯草芽孢杆菌CRISPR-Cas9n基因组编辑系统，提升枯草芽孢杆菌BS89的核黄素生产能力。

本发明的技术方案概述如下：

提高枯草芽孢杆菌CRISPR-Cas9n基因组编辑系统多位点编辑效率的方法，包括如下步骤：

(1)根据编辑位点，构建枯草芽孢杆菌CRISPR-Cas9n基因组编辑系统；

(2)敲除待编辑枯草芽孢杆菌菌株的ligD基因，所述ligD基因的核苷酸序列如SEQID NO.90所示；

(3)将步骤(1)获得的枯草芽孢杆菌CRISPR-Cas9n基因组编辑系统导入步骤(2)获得的重组菌中进行基因组多位点编辑。

利用枯草芽孢杆菌CRISPR-Cas9n基因组编辑系统，提升枯草芽孢杆菌BS89的核黄素生产能力，包括如下步骤：

(1)对枯草芽孢杆菌BS89核黄素操纵子上的ribA，ribB，ribH三个基因的RBS区域进行同时修饰，根据三个修饰位点构建枯草芽孢杆菌CRISPR-Cas9n基因组编辑系统，所述ribA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.47所示；所述ribB基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.48所示；所述ribH基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.49所示；

(2)敲除枯草芽孢杆菌BS89菌株的ligD基因，所述ligD基因的核苷酸序列如SEQID NO.90所示；

(3)将步骤(1)获得的CRISPR-Cas9n基因组编辑系统导入步骤(2)获得的重组菌中，对核黄素操纵子上的ribA，ribB，ribH三个基因的RBS区域进行随机突变，获得不同突变组合的菌株，从中筛选到核黄素生产能力显著提升的菌株。

本发明的优点：

本发明的方法可以提高枯草芽孢杆菌CRISPR-Cas9n系统基因组多位点编辑效率。

利用枯草芽孢杆菌CRISPR-Cas9n基因组编辑系统，提升枯草芽孢杆菌BS89的核黄素生产能力。

附图说明

图1为三位点编辑效率对比。

图2为核黄素操纵子优化菌株96孔板发酵结果。

图3为核黄素操纵子优化菌株摇瓶复筛结果。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步说明，下述实施例是为了使本领域的技术人员能够更好地理解本发明，但对本发明不作任何限制。

本发明所用到的宿主菌株Bacillus subtilis 168来源为BGSC(BacillusGenetic Stock Center，http://www.bgsc.org/)。枯草芽孢杆菌BS89来源为参考文献ShiT,Wang Y,Wang Z,Wang G,Liu D,Fu J,Chen T,Zhao X.Deregulation of purinepathway in Bacillus subtilis and its use in riboflavin biosynthesis.Microbialcell factories.2014,13(1):101.

本发明所用到的原始质粒pAX01和pHP13来源为BGSC(Bacillus Genetic StockCenter，http://www.bgsc.org/)。

质粒pEBS-cop1来源于专利《枯草芽孢杆菌基因组无痕修饰方法》(申请公布专利号：CN103451224A)。

质粒pUC18和质粒pCas9cur来源于addgene(http://www.addgene.org)。

pGRB质粒来源于参考文献Li et.al.Metabolic engineering of Escherichiacoli using CRISPR-Cas9meditated genome editing.Metab Eng.2015,31:13-21.

所用限制性内切酶、去磷酸化酶、DNA连接酶等分子生物学试剂从thermo公司购买(http://www.thermoscientificbio.com/fermentas)，所用其他生化试剂从生工生物工程(上海)股份有限公司购买(http://www.sangon.com/)。

实施例1构建枯草芽孢杆菌CRISPR-Cas9n基因组编辑系统

本发明所用到的质粒pBSCas9n以B.subtilis 168基因组为模板，用引物P43-F和P43-L扩增P43启动子序列，以质粒pUC18为模板，用引物ColE1-F和ColE1-L扩增pUC18复制子ColE1序列，用引物P43-F和ColE1-L将以上两片段融合为片段F1。这一步融合中，通过引物在P43启动子下游引入gRNA与Cas9蛋白结合的序列和终止子序列。以质粒pHP13为模板，用引物Cm-F和Cm-L扩增氯霉素抗性基因及其启动子序列(Cm)，以质粒pEBs-cop1为模板，用引物repF-F和repF-L扩增pEBs-cop1复制子repF序列，以质粒pAX01为模板，引物xylA-F和xylA-L扩增木糖启动子及诱导元件序列(xylA cassette)，用引物Cm-F和xylA-L将以上三片段融合为片段F2。以pCas9cur为出发质粒用引物Cas9-F和Cas9-L扩增Cas9基因序列。将获得的F1、F2和Cas9片段测定浓度后，按等摩尔比例加入CPEC PCR反应体系中进行一步组装，最终得到pBSCas9质粒。

通过对pBSCas9质粒上Cas9蛋白的内切酶区域进行点突变的方式获得Cas9n序列。以pBSCas9为模板，采用5’端磷酸化引物D10-F和D10-L全质粒扩增pBSCas9，通过引物引入点突变，将原Cas9序列中第10位Asp(GAT)突变为Ala(GCT)，得到Cas9n；全质粒扩增后的片段经T4连接酶连接、转化、筛选阳性克隆，得到质粒pBSCas9n。

所述Cas9基因核苷酸序列如SEQ ID NO.76所示；氯霉素抗性基因及其启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.77所示；质粒pEBS-cop1的复制子的核苷酸序列如SEQ ID NO.78所示；质粒pUC18的复制子的核苷酸序列如SEQ ID NO.79所示；枯草芽孢杆菌启动子P43的核苷酸序列如SEQ ID NO.80所示；质粒pAX01上的木糖启动子及诱导元件的核苷酸序列如SEQID NO.81所示；所述质粒pBSCas9的核苷酸序列如SEQ ID NO.82所示；所述质粒pBSCas9n的核苷酸序列如SEQ ID NO.83所示。

以枯草芽孢杆菌质粒pHP13为出发质粒构建pDonor质粒。

采用引物manp-F和manp-L对质粒pHP13进行第一轮全质粒扩增，扩增过程中通过引物引入启动子Pmanp序列，通过Golden Gate克隆重新连接质粒，获得质粒pHP13-2。采用引物gRNA-F和gRNA-L对pHP13-2质粒进行全质粒扩增，扩增过程中通过引物引入靶向复制子rep60的gRNA序列gRNA-rep60，通过Golden Gate克隆重新连接质粒，获得质粒pHP13-3。最后将质粒上的氯霉素基因及启动子序列替换为氨苄青霉素基因及启动子序列，以pGRB质粒为模板，采用引物Amp-F和Amp-L扩增氨苄青霉素基因及启动子序列。以pHP13-3为模板，采用引物P3-F和P3-L扩增模板质粒，以上两段PCR产物通过Golden Gate克隆连接，获得质粒pDonor。

所述枯草芽孢杆菌启动子Pmanp的核苷酸序列如SEQ ID NO.84所示；所述靶向复制子rep60的gRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.85所示；所述氨苄青霉素抗性基因及启动子核苷酸序列如SEQ ID NO.86所示，所述质粒pDonor的核苷酸序列如SEQ ID NO.87所示；

工具质粒pHG的构建

以质粒pUC18为模板，采用引物pUC-F和pUC-L扩增复制子(ColE1)和氨苄青霉素基因(Amp)组合区域序列。以B.subtilis 168基因组为模板，采用引物P-F和P-L扩增P43启动子序列。以上两个PCR片段，通过CPEC进行一步组装，获得pHG质粒。在质粒的构建过程中，gRNA与Cas9蛋白结合的序列和终止子序列通过引物分别引入。

所述质粒pUC18的复制子(ColE1)和氨苄青霉素抗性基因及其启动子(Amp)组合区域核苷酸序列如SEQ ID NO.88所示，所述枯草芽孢杆菌启动子P43的核苷酸序列如SEQ IDNO.80所示，多位点gRNA表达过程中辅助质粒pHG的核苷酸序列如SEQ ID NO.89所示。

由质粒pBSCas9n，pDonor和pHG组成枯草芽孢杆菌CRISPR-Cas9n基因组编辑系统。

实施例2枯草芽孢杆菌ligD基因的失活

以枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis 168为出发菌株，敲除ligD基因(SEQ IDNO.90)。此过程采用CRISPR-Cas9n系统完成。以质粒pBSCas9n为模板，采用引物ligDgRNA-F和ligDgRNA-L进行全质粒PCR扩增，上下游引物中分别引入BsaI酶切位点以及一部分gRNA序列，所得片段通过Golden Gate克隆重新连接，此过程中将gRNA序列插入pBSCas9n质粒P43启动子下游区域。以Bacillus subtilis 168基因组为模板，采用引物DonligDU-F/L和DonligDD-F/L分别扩增上下游同源臂片段，以pDonor质粒为模板，采用引物pDonorligD-F/L进行全质粒扩增，所得PCR产物和上下游同源臂片段通过CPEC反应重新连接，此过程中将同源臂片段组装至质粒pDonor。敲除ligD基因具体流程为：

(1)依次将上述为敲除ligD构建的pBSCas9n和pDonor质粒转入宿主菌株，最终获得带有双质粒系统的菌株。

(2)将带有双质粒系统的阳性克隆菌株接入氯霉素(5μg/ml)和红霉素(0.5μg/ml)双抗且1％木糖终浓度的LB液体培养基中，培养8h，培养过程中木糖诱导Cas9n切割基因组提升同源重组效率。

(3)木糖诱导培养后的菌液经稀释，涂布于氯霉素和红霉素双抗性的LB平板，获得一定数量的单菌落，待进一步验证。

(4)采用DNA测序验证ligD是否敲除成功。

(5)将验证正确的菌株接种于终浓度1％木糖和1％甘露糖的氯霉素(5μg/mL)LB液体培养基中，过夜培养，将菌液在氯霉素平板上划线，培养至菌落可见。

(6)将氯霉素平板上的单菌落对点于红霉素(0.5μg/ml)平板，不能在红霉素平板上生长的菌落是pDonor质粒消除的菌株，为保证成功率，可一次对点多个菌落以确保获得质粒消除的菌株。

(7)将pDonor质粒消除的菌株，接种在无抗LB液体培养基中，50℃培养至少8h，将菌液在无抗LB平板上划线，获得的菌落对点于氯霉素(5μg/mL)平板，在氯霉素平板上不能生长的菌落为pBSCas9n质粒消除的菌株。

将两个质粒消除后，最终获得失活基因ligD的菌株Bacillus subtilis 168ΔligD。

实施例3：敲除ligD提高CRISPR-Cas9n基因组编辑系统多位点编辑效率

选取amyE，upp和sigE三个基因位点来表征CRISPR-Cas9n多位点编辑效率。基因编辑方式为同时将以上三个基因中连续两个密码子突变为终止密码子。确定三个基因位点中的三条gRNA序列为：

gRNA-1:GCGGTGATAGCTTCTCGTTC(SEQ ID NO.91)

gRNA-2:GCTGATTCCTGCGGCAAAAG(SEQ ID NO.92)

gRNA-3:GAAGCTCCCAAACGGCGATC(SEQ ID NO.43)

以pBSCas9n为模板，采用引物TM1-F/L进行全质粒扩增，以pHG为模板，引物TM2-F/L和TM3-F/L分别扩增质粒上的目的片段。上述引物中分别引入BsaI酶切位点和相应的部分gRNA序列，上述得到的三条PCR片段通过Golden Gate克隆重新连接，获得将三条gRNA序列及其对应启动子分别插入的pBSCas9n质粒。以Bacillus subtilis 168基因组为模板，采用引物ThrMuamyEU-F/L和ThrMuamyED-F/L扩增amyE位点处的上下游同源臂；采用引物ThrMuuppU-F/L和ThrMuuppD-F/L扩增upp位点处的上下游同源臂；采用引物ThrMusigEU-F/L和ThrMusigEU-F/L扩增sigE位点处的上下游同源臂。在上下游同源臂构建过程中引入点突变，分别将三个基因PAM位点附近的连续两个密码子突变为终止密码子。将上述三个基因各自的上下游同源臂通过融合PCR融合为一段同源臂序列。以pDonor质粒为模板，采用引物pDonThrMu-F/L进行全质粒扩增，所得PCR产物与上述三个位点融合后的同源臂片段通过CPEC重新连接，此过程中将三个位点的同源臂片段均插入质粒pDonor中。

构建质粒后，分别对Bacillus subtilis 168和Bacillus subtilis 168ΔligD进行三位点同时修饰，并比较其效率。具体操作流程为

(1)依次将上述为修饰三位点构建的pBSCas9n和pDonor质粒转入宿主菌株，最终获得带有双质粒系统的菌株。

(2)将带有双质粒系统的阳性克隆菌株接入氯霉素(5μg/ml)和红霉素(0.5μg/ml)双抗且1％木糖终浓度的LB液体培养基中，培养8h，培养过程中木糖诱导Cas9n切割基因组提升同源重组效率。

(3)木糖诱导培养后的菌液经稀释，涂布于氯霉素和红霉素双抗性的LB平板，获得一定数量的单菌落，待进一步验证突变效率。

(4)采用DNA测序验证发生突变的阳性克隆，并根据验证的总菌落数计算突变效率。

经比较不同菌株三位点编辑效率，ligD失活菌株中的三位点编辑效率明显提高(图1)。

实施例4：利用枯草芽孢杆菌CRISPR-Cas9n基因组编辑系统，提升枯草芽孢杆菌BS89的核黄素生产能力

对枯草芽孢杆菌BS89的核黄素操纵子上ribA，ribB和ribH三个基因的RBS区域进行随机突变，获得不同突变组合的菌株，从中筛选到核黄素生产能力显著提升的菌株。

ribA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.47所示；

ribB基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.48所示；

ribH基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.49所示；

具体流程为：

依据实施例2中的方法，失活枯草芽孢杆菌核黄素生产菌株BS89的ligD基因，得到菌株BS89ΔligD。

采用CRISPR-Cas9n多位点编辑系统，在ligD失活的枯草芽孢杆菌核黄素生产菌株中优化核黄素操纵子，设计简并引物构建RBS文库，对ribB，ribA和ribH三个基因的RBS序列同时突变，通过组合优化筛选得到核黄素合成能力显著提高的菌株。

(1)构建相应的CRISPR-Cas9n基因组编辑系统。确定三个基因位点的gRNA序列为：

gRNA-ribA:GATAGCGGTACCATTATAAA(SEQ ID NO.44)

gRNA-ribB:AAACCGACAAAGGAATAGGA(SEQ ID NO.45)

gRNA-ribH:AATCACAAATATCACAAAAA(SEQ ID NO.46)

以pBSCas9n为模板，采用引物grib1-F/L，进行全质粒扩增，以pHG为模板，引物grib2-F/L和grib3-F/L分别扩增质粒上的目的片段。上述得到的三条PCR片段通过GoldenGate克隆重新连接，获得将三条gRNA序列及其相应启动子插入的pBSCas9n质粒。以Bacillus subtilis 168基因组为模板，采用引物ribBU-F/L和ribBD-F/L扩增ribB位点处的上下游同源臂；采用引物ribAU-F/L和ribAD-F/L扩增ribA位点处的上下游同源臂；采用引物ribHU-F/L和ribHD-F/L扩增ribH位点处的上下游同源臂。其中引物ribBD-F，ribAD-F和ribHD-F均为简并引物，获得的同源臂在同源重组过程中可对相依基因位点引入随机突变。以pDonor质粒为模板，采用引物pDonLib-F/L进行全质粒扩增，所得PCR产物与上述三个位点的同源臂片段通过CPEC重新连接，将三个位点处的上下游同源臂序列插入pDonor中。

(2)构建CRISPR-Cas9n系统后，采用与实施例2中相同的方法敲除枯草芽孢杆菌BS89菌株的ligD基因(SEQ ID NO.90)。以质粒pBSCas9n为模板，采用引物ligDgRNA-F和ligDgRNA-L进行全质粒PCR扩增，上下游引物中分别引入BsaI酶切位点以及一部分gRNA序列，所得片段通过Golden Gate克隆重新连接，此过程中将gRNA序列插入pBSCas9n质粒P43启动子下游区域。以BS89基因组为模板，采用引物DonligDU-F/L和DonligDD-F/L分别扩增上下游同源臂片段，以pDonor质粒为模板，采用引物pDonorligD-F/L进行全质粒扩增，所得PCR产物和上下游同源臂片段通过CPEC反应重新连接，此过程中将同源臂片段组装至质粒pDonor。敲除ligD基因具体流程为：

1)依次将上述为敲除ligD构建的pBSCas9n和pDonor质粒转入宿主菌株，最终获得带有双质粒系统的菌株。

2)将带有双质粒系统的阳性克隆菌株接入氯霉素(5μg/ml)和红霉素(0.5μg/ml)双抗且1％木糖终浓度的LB液体培养基中，培养8h，培养过程中木糖诱导Cas9n切割基因组提升同源重组效率。

3)木糖诱导培养后的菌液经稀释，涂布于氯霉素和红霉素双抗性的LB平板，获得一定数量的单菌落，待进一步验证。

4)采用DNA测序验证ligD是否敲除成功。

5)将验证正确的菌株接种于终浓度1％木糖和1％甘露糖的氯霉素(5μg/mL)LB液体培养基中，过夜培养，将菌液在氯霉素平板上划线，培养至菌落可见。

6)将氯霉素平板上的单菌落对点于红霉素(0.5μg/ml)平板，不能在红霉素平板上生长的菌落是pDonor质粒消除的菌株，为保证成功率，可一次对点多个菌落以确保获得质粒消除的菌株。

7)将pDonor质粒消除的菌株，接种在无抗LB液体培养基中，50℃培养至少8h，将菌液在无抗LB平板上划线，获得的菌落对点于氯霉素(5μg/mL)平板，在氯霉素平板上不能生长的菌落为pBSCas9n质粒消除的菌株。

将两个质粒消除后，最终获得失活基因ligD的菌株BS89ΔligD。

(3)将步骤(1)中构建的两个质粒分别转入BS89ΔligD，将带有双质粒系统的阳性克隆菌株接入氯霉素(5μg/ml)和红霉素(0.5μg/ml)双抗且1％木糖终浓度的LB液体培养基中，培养8h，木糖诱导Cas9n表达，菌液经稀释涂布于氯霉素和红霉素双抗性的LB平板，获得不同RBS突变组合的菌株文库。

首先通过颜色辨别尽量挑取黄色较深的菌落，重新对点于新的平板中，作为待发酵菌株文库。将平板上的菌落逐个接种于96深孔板中培养，41℃，发酵24h。发酵结束后分别测定每株菌的核黄素产量，BS89菌株作为对照。整个过程中共筛选菌株190株，发酵验证的190株菌株中，111株菌株在初筛中产量超过了BS89(图2)。综合选取有潜力的初筛菌株20株进行摇瓶发酵复筛，在500mL摇瓶中发酵48h(图3)，其中18株菌株的摇瓶发酵产量超过BS89，摇瓶发酵中产量最高的4株菌株CY124、CY79、CY49和CY46在初筛中均为较高产量菌株。两次筛选具有较好的一致性。CY46为复筛最高产量菌株，其在复筛产量最高的4株菌株中，初筛时的产量也最高。CY46产量达到1.39g/L，得率为17.16mg/g葡萄糖。其产量与对照菌株BS89相比，提高了59％。对产量最高的4株菌株核黄素操纵子区域进行DNA测序，4株菌株的三个RBS位点均发生了突变(表2)，证明通过ligD基因的失活，CRISPR-Cas9n编辑系统的多位点编辑效率提高，高效率的对核黄素操纵子上不同基因的表达水平进行了组合优化，进而提升了核黄素的合成能力。

96孔板发酵与摇瓶发酵所用培养基为YE培养基，YE培养基配方为：葡萄糖100g/L，酵母粉(YE)20g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5g/L，KH₂PO₄0.5g/L，K₂HPO₄0.5g/L。

表1质粒构建所用引物序列

表2组合优化菌株核黄素操纵子基因RBS区域序列

序列表

<110> 天津大学

<120> 提高枯草芽孢杆菌CRISPR-Cas9n系统基因组多位点编辑效率的方法

<160> 92

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

cacaccaggt ctcactgtct cgcagtttta gagctagaaa tagcaagtta a 51

<210> 2

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cacaccaggt ctcaacagag gcaatcgggt gtacattcct ctcttaccta taatggtac 59

<210> 3

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gttttacaac gtcgtgatgc gctcaaccgg aaagatcggt atcgc 45

<210> 4

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

acacggaaag agctgacttc attaggcgct atgatgtgcc ggaggctttt 50

<210> 5

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

aaaagcctcc ggcacatcat agcgcctaat gaagtcagct ctttccgtgt 50

<210> 6

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

acgccagggt tttcccaggc gttatccgga agcgaatctg 40

<210> 7

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

cagattcgct tccggataac gcctgggaaa accctggcgt 40

<210> 8

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

atctttccgg ttgagcgcat cacgacgttg taaaac 36

<210> 9

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

cacaccaggt ctcactcgtt cgttttagag ctagaaatag caagttaa 48

<210> 10

<211> 61

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

cacaccaggt ctcagccgtt tgggagcttc gtgtacattc ctctcttacc tataatggta 60

c 61

<210> 11

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

cacaccaggt ctcagcggca aaaggtttta gagctagaaa tagcaagtta a 51

<210> 12

<211> 62

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

cacaccaggt ctcacgagaa gctatcaccg cgtgtacatt cctctcttac ctataatggt 60

ac 62

<210> 13

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

cacaccaggt ctcacggcga tcgttttaga gctagaaata gcaagttaa 49

<210> 14

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

cacaccaggt ctcaccgcag gaatcagcgt gtacattcct ctcttaccta taatggtac 59

<210> 15

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

gttttacaac gtcgtgatct gatcgatggg atgtcacgca gaat 44

<210> 16

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

gaggcgtact ttattaacga gaagctatca ccg 33

<210> 17

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

cggtgatagc ttctcgttaa taaagtacgc ctc 33

<210> 18

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

gctacacgct gtcttgcttc ttcaagttga taaacggctt ttgttgtatt cgc 53

<210> 19

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

gcgaatacaa caaaagccgt ttatcaactt gaagaagcaa gacagcgtgt agc 53

<210> 20

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

catgtcctta ttatgccgca ggaatcagc 29

<210> 21

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

gctgattcct gcggcataat aaggacatg 29

<210> 22

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

gctgttcgat ggcttccaat gggtcgcccc taacatgtgt caatctgttt aaag 54

<210> 23

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

ctttaaacag attgacacat gttaggggcg acccattgga agccatcgaa cagc 54

<210> 24

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

gcgcgcttat taatcgccgt ttgggagctt c 31

<210> 25

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

gaagctccca aacggcgatt aataagcgcg c 31

<210> 26

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

acgccagggt tttcccagga aatccccatc atatccgcta catcc 45

<210> 27

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

ggatgtagcg gatatgatgg ggatttcctg ggaaaaccct ggcgt 45

<210> 28

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

attctgcgtg acatcccatc gatcagatca cgacgttgta aaac 44

<210> 29

<211> 61

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

gttatcaact tgaaaaagtg gcacccagga tgctcagcaa tacaggaaaa cacaccaaag 60

c 61

<210> 30

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

ctattccttt gtcggttttg ccgtcagttt 30

<210> 31

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 31

caaaaccgac aaaggaatag rnnnnrraat tcaaaatgtt tacaggaatt atcgaagaa 59

<210> 32

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 32

ctaaaagccg ttttcgctta agaaggc 27

<210> 33

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 33

gccttcttaa gcgaaaacgg cttttag 27

<210> 34

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 34

tataatggta ccgctatcac tttatat 27

<210> 35

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 35

gtgatagcgg taccattata rnnnnrraat tcaaaatgtt tcatccgata gaagaagca 59

<210> 36

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 36

aatgcacccg gaccaatacc ggttcttctc c 31

<210> 37

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 37

ggagaagaac cggtattggt ccgggtgcat t 31

<210> 38

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 38

ttagaaatga agtaaatgac ctagcttgtt 30

<210> 39

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 39

ggtcatttac ttcatttcta arnnnnrraa ttcaaaatga atatcataca aggaaattt 59

<210> 40

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 40

gacgttgtaa aacgacggcc agtgaaaaaa acccctctat atccaaaatg tccagtct 58

<210> 41

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 41

agactggaca ttttggatat agaggggttt ttttcactgg ccgtcgtttt acaacgtc 58

<210> 42

<211> 61

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 42

gctttggtgt gttttcctgt attgctgagc atcctgggtg ccactttttc aagttgataa 60

c 61

<210> 43

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 43

gaagctccca aacggcgatc 20

<210> 44

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 44

gatagcggta ccattataaa 20

<210> 45

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 45

aaaccgacaa aggaatagga 20

<210> 46

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 46

aatcacaaat atcacaaaaa 20

<210> 47

<211> 1197

<212> DNA

<213> 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)

<400> 47

atgtttcatc cgatagaaga agcactggac gctttaaaaa aaggcgaagt catcatcgtt 60

gtagatgatg aagacagaga aaatgaagga gactttgtgg ctcttgccga gcatgcaacg 120

ccggaagtca ttaactttat ggcgacacat gggagaggac tgatctgcac gccgctcagt 180

gaggaaatcg cagacaggct tgatcttcac cctatggttg agcataatac agactctcac 240

cacactgcat ttaccgtaag catagaccat cgtgaaacga agacaggtat cagcgctcaa 300

gaaagatctt ttaccgttca agcattgctg gacagcaaat ccgtgccatc tgattttcag 360

cgtccggggc acatttttcc actgattgcg aaaaaaggag gtgtcctgaa aagagcgggc 420

catacagaag ctgctgttga tcttgctgaa gcttgcggat ctccaggagc cggcgtcatt 480

tgtgaaatta tgaatgaaga cggaacgatg gcgagagtgc ctgagctcat tgaaattgcg 540

aaaaagcatc aattaaaaat gatcaccatt aaggatttga ttcaataccg ttacaatctg 600

acaacacttg tcgagcgtga agttgacatt acgctgccta ctgattttgg gacatttaag 660

gtttatggat acacaaatga ggtagatgga aaagagcatg tcgcatttgt gatgggagat 720

gtgccgttcg gagaagaacc ggtattggtc cgggtgcatt cagaatgtct cacaggtgac 780

gtgtttggct ctcatcgctg tgattgcgga ccgcagctgc acgccgcgct gaaccaaatt 840

gccgcagaag gccgtggagt gctcctgtac ttgcgccaag aaggacgagg catcggttta 900

atcaataaat taaaagctta taagcttcag gaacaaggct atgacaccgt agaagccaat 960

gaggcgcttg gattcttgcc ggatcttcgc aactatggca tcggagcaca aattttacgc 1020

gacctcggtg tccggaatat gaagcttttg acgaataatc cgcgaaaaat cgcaggcctt 1080

gaaggctacg gactcagtat ttcagaaaga gtgccgcttc aaatggaggc gaaagaacac 1140

aataaaaaat atttgcaaac caaaatgaac aagctaggtc atttacttca tttctaa 1197

<210> 48

<211> 648

<212> DNA

<213> 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)

<400> 48

atgtttacag gaattatcga agaaacaggc acaatcgaat ccatgaaaaa agcagggcat 60

gcaatggcct taactattaa atgctcaaag attttagagg atgttcatct tggcgacagc 120

attgcagtga acggcatttg tctgactgtc actgatttta caaaaaatca attcacagtg 180

gatgttatgc ctgaaacagt caaagctacg tcactgaatg atttaacaaa aggaagcaaa 240

gtaaatctgg aaagagcgat ggcggcaaac ggccgtttcg gaggccattt cgtctcaggc 300

catgtcgacg gaactgcgga aatcacacga attgaagaga aaagcaacgc agtttactat 360

gatttaaaaa tggacccgtc attaacaaaa acattggttt taaagggatc aattactgtg 420

gatggcgtga gcttaaccat attcggcctg acagaagaca cagtgacgat ctccttaata 480

ccgcatacga tcagcgaaac gatcttttca gaaaaaacga tcggctctaa agtgaatatc 540

gaatgcgata tgatcggaaa atatatgtat cgatttttgc ataaagccaa tgaaaataag 600

acccaacaaa ccattacaaa agccttctta agcgaaaacg gcttttag 648

<210> 49

<211> 465

<212> DNA

<213> 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)

<400> 49

atgaatatca tacaaggaaa tttagttggt acaggtctta aaatcggaat cgtagtagga 60

agatttaatg attttattac gagcaagctg ctgagcggag cagaagatgc gctgctcaga 120

catggcgtag acacaaatga cattgatgtg gcttgggttc caggcgcatt tgaaataccg 180

tttgctgcga aaaaaatggc ggaaacaaaa aaatatgatg ctattatcac attgggcact 240

gtcatcagag gcgcaacgac acattacgat tatgtctgca atgaagctgc aaaaggcatc 300

gcgcaagcag caaacactac tggtgtacct gtcatctttg gaattgtaac aactgaaaac 360

atcgaacagg ctatcgagcg tgccggcaca aaagcgggca acaaaggtgt agattgtgct 420

gtttctgcca ttgaaatggc aaatttaaac cgctcatttg aataa 465

<210> 50

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 50

cacgcattga tttgagtcag ctaggaggtg actgacgtgc atgcaggccg gggcat 56

<210> 51

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 51

gtcatcaccg aaacgtgtac attcctctct tacct 35

<210> 52

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 52

taaggctagt ccgttatcaa cttgaaaaag tggcaccctt cctcgctcac tgactcgc 58

<210> 53

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 53

ttaaaggatt tgagcgtagc gaaaaatcct ttctgtcaga ccaagtttac tcatat 56

<210> 54

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 54

caatctaaag tatatatgag taaacttggt ctgacagaaa ggatttttcg ctacgctca 59

<210> 55

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 55

gtgtgatgcg ctgcgtccat taaaggatat ggatctggag ctg 43

<210> 56

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 56

cagctccaga tccatatcct ttaatggacg cagcgcatca cac 43

<210> 57

<211> 61

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 57

attgattctt ttttaagtgt tacccctata agttagtgtc ttttgcgcag tcggcttaaa 60

c 61

<210> 58

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 58

gtttaagccg actgcgcaaa agacactaac ttataggggt aacactt 47

<210> 59

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 59

tatctaagcc tattgagtat ttcttatcca tggatcccat ttcccccttt gatttttag 59

<210> 60

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 60

tcaaaggggg aaatgggatc catggataag aaatactcaa taggcttag 49

<210> 61

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 61

atgccccggc ctgcatgcac gtcagtcacc tcctagctga ctcaaatcaa t 51

<210> 62

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 62

taggcttagc tatcggcaca aat 23

<210> 63

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 63

ttgagtattt cttatccatg gatc 24

<210> 64

<211> 87

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 64

cacaccaggt ctcagatttt aatgagctga tttcggtata cagttgagac aagatctaag 60

cttggctgca ggtcgacgga tccccgg 87

<210> 65

<211> 89

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 65

cacaccaggt ctcaaatcgc tttttttacc ataggttccg gtaataaagg catttttccc 60

tggcgtaatc atggtcatag ctgtttcct 89

<210> 66

<211> 87

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 66

cacaccaggt ctcattaaaa taaggctagt ccgttatcaa cttgaaaaag tggcaccaag 60

cttggctgca ggtcgacgga tccccgg 87

<210> 67

<211> 89

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 67

cacaccaggt ctcattaact tgctatttct agctctaaaa cttacatttc gaatcgtcag 60

cagatcttgt ctcaactgta taccgaaat 89

<210> 68

<211> 89

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 68

cacaccaggt ctcattaact tgctatttct agctctaaaa cttacatttc gaatcgtcag 60

cagatcttgt ctcaactgta taccgaaat 89

<210> 69

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 69

cacaccaggt ctcatcctgc ctcgtgatac gcctattttt ataggttaat gtcatg 56

<210> 70

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 70

cacaccaggt ctcaaggagg cttacttgtc tgctttcttc 40

<210> 71

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 71

cacaccaggt ctcataatgt cactaacctg ccccgttagt c 41

<210> 72

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 72

ggtaagagag gaatgtacac gctgtttcct gtgtgaaatt g 41

<210> 73

<211> 74

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 73

taacggacta gccttatttt aacttgctat ttctagctct aaaacgacga aagggcctcg 60

tgatacgcct attt 74

<210> 74

<211> 74

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 74

atagcaagtt aaaataaggc tagtccgtta tcaacttgaa aaagtggcac ccgtgcatgc 60

aggccggggc atat 74

<210> 75

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 75

caatttcaca caggaaacag cgtgtacatt cctctcttac ctataatggt 50

<210> 76

<211> 4107

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 76

atggataaga aatactcaat aggcttagat atcggcacaa atagcgtcgg atgggcggtg 60

atcactgatg aatataaggt tccgtctaaa aagttcaagg ttctgggaaa tacagaccgc 120

cacagtatca aaaaaaatct tataggggct cttttatttg acagtggaga gacagcggaa 180

gcgactcgtc tcaaacggac agctcgtaga aggtatacac gtcggaagaa tcgtatttgt 240

tatctacagg agattttttc aaatgagatg gcgaaagtag atgatagttt ctttcatcga 300

cttgaagagt cttttttggt ggaagaagac aagaagcatg aacgtcatcc tatttttgga 360

aatatagtag atgaagttgc ttatcatgag aaatatccaa ctatctatca tctgcgaaaa 420

aaattggtag attctactga taaagcggat ttgcgcttaa tctatttggc cttagcgcat 480

atgattaagt ttcgtggtca ttttttgatt gagggagatt taaatcctga taatagtgat 540

gtggacaaac tatttatcca gttggtacaa acctacaatc aattatttga agaaaaccct 600

attaacgcaa gtggagtaga tgctaaagcg attctttctg cacgattgag taaatcaaga 660

cgattagaaa atctcattgc tcagctcccc ggtgagaaga aaaatggctt atttgggaat 720

ctcattgctt tgtcattggg tttgacccct aattttaaat caaattttga tttggcagaa 780

gatgctaaat tacagctttc aaaagatact tacgatgatg atttagataa tttattggcg 840

caaattggag atcaatatgc tgatttgttt ttggcagcta agaatttatc agatgctatt 900

ttactttcag atatcctaag agtaaatact gaaataacta aggctcccct atcagcttca 960

atgattaaac gctacgatga acatcatcaa gacttgactc ttttaaaagc tttagttcga 1020

caacaacttc cagaaaagta taaagaaatc ttttttgatc aatcaaaaaa cggatatgca 1080

ggttatattg atgggggagc tagccaagaa gaattttata aatttatcaa accaatttta 1140

gaaaaaatgg atggtactga ggaattattg gtgaaactaa atcgtgaaga tttgctgcgc 1200

aagcaacgga cctttgacaa cggctctatt ccccatcaaa ttcacttggg tgagctgcat 1260

gctattttga gaagacaaga agacttttat ccatttttaa aagacaatcg tgagaagatt 1320

gaaaaaatct tgacttttcg aattccttat tatgttggtc cattggcgcg tggcaatagt 1380

cgttttgcat ggatgactcg gaagtctgaa gaaacaatta ccccatggaa ttttgaagaa 1440

gttgtcgata aaggtgcttc agctcaatca tttattgaac gcatgacaaa ctttgataaa 1500

aatcttccaa atgaaaaagt actaccaaaa catagtttgc tttatgagta ttttacggtt 1560

tataacgaat tgacaaaggt caaatatgtt actgaaggaa tgcgaaaacc agcatttctt 1620

tcaggtgaac agaagaaagc cattgttgat ttactcttca aaacaaatcg aaaagtaacc 1680

gttaagcaat taaaagaaga ttatttcaaa aaaatagaat gttttgatag tgttgaaatt 1740

tcaggagttg aagatagatt taatgcttca ttaggtacct accatgattt gctaaaaatt 1800

attaaagata aagatttttt ggataatgaa gaaaatgaag atatcttaga ggatattgtt 1860

ttaacattga ccttatttga agatagggag atgattgagg aaagacttaa aacatatgct 1920

cacctctttg atgataaggt gatgaaacag cttaaacgtc gccgttatac tggttgggga 1980

cgtttgtctc gaaaattgat taatggtatt agggataagc aatctggcaa aacaatatta 2040

gattttttga aatcagatgg ttttgccaat cgcaatttta tgcagctgat ccatgatgat 2100

agtttgacat ttaaagaaga cattcaaaaa gcacaagtgt ctggacaagg cgatagttta 2160

catgaacata ttgcaaattt agctggtagc cctgctatta aaaaaggtat tttacagact 2220

gtaaaagttg ttgatgaatt ggtcaaagta atggggcggc ataagccaga aaatatcgtt 2280

attgaaatgg cacgtgaaaa tcagacaact caaaagggcc agaaaaattc gcgagagcgt 2340

atgaaacgaa tcgaagaagg tatcaaagaa ttaggaagtc agattcttaa agagcatcct 2400

gttgaaaata ctcaattgca aaatgaaaag ctctatctct attatctcca aaatggaaga 2460

gacatgtatg tggaccaaga attagatatt aatcgtttaa gtgattatga tgtcgatcac 2520

attgttccac aaagtttcct taaagacgat tcaatagaca ataaggtctt aacgcgttct 2580

gataaaaatc gtggtaaatc ggataacgtt ccaagtgaag aagtagtcaa aaagatgaaa 2640

aactattgga gacaacttct aaacgccaag ttaatcactc aacgtaagtt tgataattta 2700

acgaaagctg aacgtggagg tttgagtgaa cttgataaag ctggttttat caaacgccaa 2760

ttggttgaaa ctcgccaaat cactaagcat gtggcacaaa ttttggatag tcgcatgaat 2820

actaaatacg atgaaaatga taaacttatt cgagaggtta aagtgattac cttaaaatct 2880

aaattagttt ctgacttccg aaaagatttc caattctata aagtacgtga gattaacaat 2940

taccatcatg cccatgatgc gtatctaaat gccgtcgttg gaactgcttt gattaagaaa 3000

tatccaaaac ttgaatcgga gtttgtctat ggtgattata aagtttatga tgttcgtaaa 3060

atgattgcta agtctgagca agaaataggc aaagcaaccg caaaatattt cttttactct 3120

aatatcatga acttcttcaa aacagaaatt acacttgcaa atggagagat tcgcaaacgc 3180

cctctaatcg aaactaatgg ggaaactgga gaaattgtct gggataaagg gcgagatttt 3240

gccacagtgc gcaaagtatt gtccatgccc caagtcaata ttgtcaagaa aacagaagta 3300

cagacaggcg gattctccaa ggagtcaatt ttaccaaaaa gaaattcgga caagcttatt 3360

gctcgtaaaa aagactggga tccaaaaaaa tatggtggtt ttgatagtcc aacggtagct 3420

tattcagtcc tagtggttgc taaggtggaa aaagggaaat cgaagaagtt aaaatccgtt 3480

aaagagttac tagggatcac aattatggaa agaagttcct ttgaaaaaaa tccgattgac 3540

tttttagaag ctaaaggata taaggaagtt aaaaaagact taatcattaa actacctaaa 3600

tatagtcttt ttgagttaga aaacggtcgt aaacggatgc tggctagtgc cggagaatta 3660

caaaaaggaa atgagctggc tctgccaagc aaatatgtga attttttata tttagctagt 3720

cattatgaaa agttgaaggg tagtccagaa gataacgaac aaaaacaatt gtttgtggag 3780

cagcataagc attatttaga tgagattatt gagcaaatca gtgaattttc taagcgtgtt 3840

attttagcag atgccaattt agataaagtt cttagtgcat ataacaaaca tagagacaaa 3900

ccaatacgtg aacaagcaga aaatattatt catttattta cgttgacgaa tcttggagct 3960

cccgctgctt ttaaatattt tgatacaaca attgatcgta aacgatatac gtctacaaaa 4020

gaagttttag atgccactct tatccatcaa tccatcactg gtctttatga aacacgcatt 4080

gatttgagtc agctaggagg tgactga 4107

<210> 77

<211> 1008

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 77

aaaggatttt tcgctacgct caaatccttt aaaaaaacac aaaagaccac attttttaat 60

gtggtcttta ttcttcaact aaagcaccca ttagttcaac aaacgaaaat tggataaagt 120

gggatatttt taaaatatat atttatgtta cagtaatatt gacttttaaa aaaggattga 180

ttctaatgaa gaaagcagac aagtaagcct cctaaattca ctttagataa aaatttagga 240

ggcatatcaa atgaacttta ataaaattga tttagacaat tggaagagaa aagagatatt 300

taatcattat ttgaaccaac aaacgacttt tagtataacc acagaaattg atattagtgt 360

tttataccga aacataaaac aagaaggata taaattttac cctgcattta ttttcttagt 420

gacaagggtg ataaactcaa atacagcttt tagaactggt tacaatagcg acggagagtt 480

aggttattgg gataagttag agccacttta tacaattttt gatggtgtat ctaaaacatt 540

ctctggtatt tggactcctg taaagaatga cttcaaagag ttttatgatt tatacctttc 600

tgatgtagag aaatataatg gttcggggaa attgtttccc aaaacaccta tacctgaaaa 660

tgctttttct ctttctatta ttccatggac ttcatttact gggtttaact taaatatcaa 720

taataatagt aattaccttc tacccattat tacagcagga aaattcatta ataaaggtaa 780

ttcaatatat ttaccgctat ctttacaggt acatcattct gtttgtgatg gttatcatgc 840

aggattgttt atgaactcta ttcaggaatt gtcagatagg cctaatgact ggcttttata 900

atatgagata atgccgactg tactttttac agtcggtttt ctaatgtcac taacctgccc 960

cgttagttga agaaggtttt tatattacag ctccagatcc atatcctt 1008

<210> 78

<211> 1186

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 78

taatggacgc agcgcatcac acgcaaaaag gaaattggaa taaatgcgaa atttgagatg 60

ttaattaaag acctttttga ggtctttttt tcttagattt ttggggttat ttaggggaga 120

aaacataggg gggtactacg acctcccccc taggtgtcca ttgtccattg tccaaacaaa 180

taaataaata ttgggttttt aatgttaaaa ggttgttttt tatgttaaag tgaaaaaaac 240

agatgttggg aggtacagtg atggttgtag atagaaaaga agagaaaaaa gttgctgtta 300

ctttaagact tacaacagaa gaaaatgaga tattaaatag aatcaaagaa aaatataata 360

ttagcaaatc agatgcaacc ggtattctaa taaaaaaata tgcaaaggag gaatacggtg 420

cattttaaac aaaaaaagat agacagcact ggcatgctgc ctatctatga ctaaattttg 480

ttaagtgtat tagcaccgtt attatatgat gagcgaaaat gtaataaaag aaactgaaaa 540

caagaaaaat tcaagaggac gtaattggac atttgtttta tatccagaat cagcaaaagc 600

cgagtggtta gagtatttaa aagagttaca cattcaattt gtagtgtctc cattacatga 660

tagggatact gatacagaag gtaggatgaa aaaagagcat tatcatattc tagtgatgta 720

tgagggtaat aaatcttatg aacagataaa aataattaac agaagaattg aatgcgacta 780

ttccgcagat tgcaggaagt gtgaaaggtc ttgtgagata tatgcttcac atggacgatc 840

ctaataaatt taaatatcaa aaagaagata tgatagttta tggcggtgta gatgttgatg 900

aattattaaa gaaaacaaca acagatagat ataaattaat taaagaaatg attgagttta 960

ttgatgaaca aggaatcgta gaatttaaga gtttaatgga ttatgcaatg aagtttaaat 1020

ttgatgattg gttcccgctt ttatgtgata actcggcgta tgttattcaa gaatatataa 1080

aatcaaatcg gtataaatct gaccgataga ttttgaattt aggtgtcaca agacactctt 1140

ttttcgcacc agcgaaaact ggtttaagcc gactgcgcaa aagaca 1186

<210> 79

<211> 934

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 79

cttcctcgct cactgactcg ctgcgctcgg tcgttcggct gcggcgagcg gtatcagctc 60

actcaaaggc ggtaatacgg ttatccacag aatcagggga taacgcagga aagaacatgt 120

gagcaaaagg ccagcaaaag gccaggaacc gtaaaaaggc cgcgttgctg gcgtttttcc 180

ataggctccg cccccctgac gagcatcaca aaaatcgacg ctcaagtcag aggtggcgaa 240

acccgacagg actataaaga taccaggcgt ttccccctgg aagctccctc gtgcgctctc 300

ctgttccgac cctgccgctt accggatacc tgtccgcctt tctcccttcg ggaagcgtgg 360

cgctttctca tagctcacgc tgtaggtatc tcagttcggt gtaggtcgtt cgctccaagc 420

tgggctgtgt gcacgaaccc cccgttcagc ccgaccgctg cgccttatcc ggtaactatc 480

gtcttgagtc caacccggta agacacgact tatcgccact ggcagcagcc actggtaaca 540

ggattagcag agcgaggtat gtaggcggtg ctacagagtt cttgaagtgg tggcctaact 600

acggctacac tagaaggaca gtatttggta tctgcgctct gctgaagcca gttaccttcg 660

gaaaaagagt tggtagctct tgatccggca aacaaaccac cgctggtagc ggtggttttt 720

ttgtttgcaa gcagcagatt acgcgcagaa aaaaaggatc tcaagaagat cctttgatct 780

tttctacggg gtctgacgct cagtggaacg aaaactcacg ttaagggatt ttggtcatga 840

gattatcaaa aaggatcttc acctagatcc ttttaaatta aaaatgaagt tttaaatcaa 900

tctaaagtat atatgagtaa acttggtctg acag 934

<210> 80

<211> 440

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 80

cgtgcatgca ggccggggca tatgggaaac agcgcggacg cagcggaatt tccaatttca 60

tgccgcagcc gcctgcgctg ttctcatttg cggcttcctt gtagagctca gcattattga 120

gtggatgatt atattccttt tgataggtgg tatgttttcg cttgaacttt taaatacagc 180

cattgaacat acggttgatt taataactga caaacatcac cctcttgcta aagcggccaa 240

ggacgctgcc gccggggctg tttgcgtttt tgccgtgatt tcgtgtatca ttggtttact 300

tatttttttg ccaaagctgt aatggctgaa aattcttaca tttattttac atttttagaa 360

atgggcgtga aaaaaagcgc gcgattatgt aaaatataaa gtgatagcgg taccattata 420

ggtaagagag gaatgtacac 440

<210> 81

<211> 1440

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 81

ctaacttata ggggtaacac ttaaaaaaga atcaataacg atagaaaccg ctcctaaagc 60

aggtgcattt tttcctaacg aagaaggcaa tagttcacat ttattgtcta aatgagaatg 120

gactctagaa gaaacttcgt ttttaatcgt atttaaaaca atgggatgag attcaattat 180

atgatttctc aagataacag cttctatatc aaatgtatta aggatattgg ttaatccaat 240

tccgatataa aagccaaagt tttgaagtgc atttaacatt tctacatcat ttttatttgc 300

gcgttccaca atctcttttc gagaaatatt cttttcttct ttagagagcg aagccagtaa 360

cgctttttca gaagcatata attcccaaca gcctcgattt ccacagctgc atttgggtcc 420

attaaaatct atcgtcatat gacccatttc cccagaaaaa ccctgaacac ctttatacaa 480

ttcgttgtta ataacaagtc cagttccaat tccgatatta atactgatgt aaacgatgtt 540

ttcatagttt tttgtcatac caaatacttt ttcaccgtat gctcctgcat tagcttcatt 600

ttcaacaaaa accggaacat taaactcact ctcaattaaa aactgcaaat ctttgatatt 660

ccaatttaag ttaggcatga aaataatttg ctgatgacga tctacaaggc ctggaacaca 720

aattcctatt ccgactagac cataagggga ctcaggcata tgggttacaa aaccatgaat 780

aagtgcaaat aaaatctctt ttacttcact agcggaagaa ctagacaagt cagaagtctt 840

ctcgagaata atatttcctt ctaagtcggt tagaattccg ttaagatagt cgactcctat 900

atcaatacca atcgagtagc ctgcattctt attaaaaaca agcattacag gtcttctgcc 960

gcctctagat tgccctgccc caatttcaaa aataaaatct ttttcaagca gtgtatttac 1020

ttgagaggag acagtagact tgtttaatcc tgtaatctca gagagagttg ccctggagac 1080

aggggagttc ttcaaaattt catctaatat taatttttga ttcatttttt ttactaaagc 1140

ttgatctgca atttgaataa taaccactcc tttgtttatc caccgaacta agttggtgtt 1200

ttttgaagct tgaattagat atttaaaagt atcatatcta atattataac taaattttct 1260

aaaaaaaaca ttgaaataaa catttatttt gtatatgatg agataaagtt agtttattgg 1320

ataaacaaac taactcaatt aagatagttg atggataaac ttgttcactt aaatcaaagg 1380

gggaaatgac aaatggtcca aactagtgat atctaaaaat caaaggggga aatgggatcc 1440

<210> 82

<211> 9237

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 82

ctaacttata ggggtaacac ttaaaaaaga atcaataacg atagaaaccg ctcctaaagc 60

aggtgcattt tttcctaacg aagaaggcaa tagttcacat ttattgtcta aatgagaatg 120

gactctagaa gaaacttcgt ttttaatcgt atttaaaaca atgggatgag attcaattat 180

atgatttctc aagataacag cttctatatc aaatgtatta aggatattgg ttaatccaat 240

tccgatataa aagccaaagt tttgaagtgc atttaacatt tctacatcat ttttatttgc 300

gcgttccaca atctcttttc gagaaatatt cttttcttct ttagagagcg aagccagtaa 360

cgctttttca gaagcatata attcccaaca gcctcgattt ccacagctgc atttgggtcc 420

attaaaatct atcgtcatat gacccatttc cccagaaaaa ccctgaacac ctttatacaa 480

ttcgttgtta ataacaagtc cagttccaat tccgatatta atactgatgt aaacgatgtt 540

ttcatagttt tttgtcatac caaatacttt ttcaccgtat gctcctgcat tagcttcatt 600

ttcaacaaaa accggaacat taaactcact ctcaattaaa aactgcaaat ctttgatatt 660

ccaatttaag ttaggcatga aaataatttg ctgatgacga tctacaaggc ctggaacaca 720

aattcctatt ccgactagac cataagggga ctcaggcata tgggttacaa aaccatgaat 780

aagtgcaaat aaaatctctt ttacttcact agcggaagaa ctagacaagt cagaagtctt 840

ctcgagaata atatttcctt ctaagtcggt tagaattccg ttaagatagt cgactcctat 900

atcaatacca atcgagtagc ctgcattctt attaaaaaca agcattacag gtcttctgcc 960

gcctctagat tgccctgccc caatttcaaa aataaaatct ttttcaagca gtgtatttac 1020

ttgagaggag acagtagact tgtttaatcc tgtaatctca gagagagttg ccctggagac 1080

aggggagttc ttcaaaattt catctaatat taatttttga ttcatttttt ttactaaagc 1140

ttgatctgca atttgaataa taaccactcc tttgtttatc caccgaacta agttggtgtt 1200

ttttgaagct tgaattagat atttaaaagt atcatatcta atattataac taaattttct 1260

aaaaaaaaca ttgaaataaa catttatttt gtatatgatg agataaagtt agtttattgg 1320

ataaacaaac taactcaatt aagatagttg atggataaac ttgttcactt aaatcaaagg 1380

gggaaatgac aaatggtcca aactagtgat atctaaaaat caaaggggga aatgggatcc 1440

atggataaga aatactcaat aggcttagat atcggcacaa atagcgtcgg atgggcggtg 1500

atcactgatg aatataaggt tccgtctaaa aagttcaagg ttctgggaaa tacagaccgc 1560

cacagtatca aaaaaaatct tataggggct cttttatttg acagtggaga gacagcggaa 1620

gcgactcgtc tcaaacggac agctcgtaga aggtatacac gtcggaagaa tcgtatttgt 1680

tatctacagg agattttttc aaatgagatg gcgaaagtag atgatagttt ctttcatcga 1740

cttgaagagt cttttttggt ggaagaagac aagaagcatg aacgtcatcc tatttttgga 1800

aatatagtag atgaagttgc ttatcatgag aaatatccaa ctatctatca tctgcgaaaa 1860

aaattggtag attctactga taaagcggat ttgcgcttaa tctatttggc cttagcgcat 1920

atgattaagt ttcgtggtca ttttttgatt gagggagatt taaatcctga taatagtgat 1980

gtggacaaac tatttatcca gttggtacaa acctacaatc aattatttga agaaaaccct 2040

attaacgcaa gtggagtaga tgctaaagcg attctttctg cacgattgag taaatcaaga 2100

cgattagaaa atctcattgc tcagctcccc ggtgagaaga aaaatggctt atttgggaat 2160

ctcattgctt tgtcattggg tttgacccct aattttaaat caaattttga tttggcagaa 2220

gatgctaaat tacagctttc aaaagatact tacgatgatg atttagataa tttattggcg 2280

caaattggag atcaatatgc tgatttgttt ttggcagcta agaatttatc agatgctatt 2340

ttactttcag atatcctaag agtaaatact gaaataacta aggctcccct atcagcttca 2400

atgattaaac gctacgatga acatcatcaa gacttgactc ttttaaaagc tttagttcga 2460

caacaacttc cagaaaagta taaagaaatc ttttttgatc aatcaaaaaa cggatatgca 2520

ggttatattg atgggggagc tagccaagaa gaattttata aatttatcaa accaatttta 2580

gaaaaaatgg atggtactga ggaattattg gtgaaactaa atcgtgaaga tttgctgcgc 2640

aagcaacgga cctttgacaa cggctctatt ccccatcaaa ttcacttggg tgagctgcat 2700

gctattttga gaagacaaga agacttttat ccatttttaa aagacaatcg tgagaagatt 2760

gaaaaaatct tgacttttcg aattccttat tatgttggtc cattggcgcg tggcaatagt 2820

cgttttgcat ggatgactcg gaagtctgaa gaaacaatta ccccatggaa ttttgaagaa 2880

gttgtcgata aaggtgcttc agctcaatca tttattgaac gcatgacaaa ctttgataaa 2940

aatcttccaa atgaaaaagt actaccaaaa catagtttgc tttatgagta ttttacggtt 3000

tataacgaat tgacaaaggt caaatatgtt actgaaggaa tgcgaaaacc agcatttctt 3060

tcaggtgaac agaagaaagc cattgttgat ttactcttca aaacaaatcg aaaagtaacc 3120

gttaagcaat taaaagaaga ttatttcaaa aaaatagaat gttttgatag tgttgaaatt 3180

tcaggagttg aagatagatt taatgcttca ttaggtacct accatgattt gctaaaaatt 3240

attaaagata aagatttttt ggataatgaa gaaaatgaag atatcttaga ggatattgtt 3300

ttaacattga ccttatttga agatagggag atgattgagg aaagacttaa aacatatgct 3360

cacctctttg atgataaggt gatgaaacag cttaaacgtc gccgttatac tggttgggga 3420

cgtttgtctc gaaaattgat taatggtatt agggataagc aatctggcaa aacaatatta 3480

gattttttga aatcagatgg ttttgccaat cgcaatttta tgcagctgat ccatgatgat 3540

agtttgacat ttaaagaaga cattcaaaaa gcacaagtgt ctggacaagg cgatagttta 3600

catgaacata ttgcaaattt agctggtagc cctgctatta aaaaaggtat tttacagact 3660

gtaaaagttg ttgatgaatt ggtcaaagta atggggcggc ataagccaga aaatatcgtt 3720

attgaaatgg cacgtgaaaa tcagacaact caaaagggcc agaaaaattc gcgagagcgt 3780

atgaaacgaa tcgaagaagg tatcaaagaa ttaggaagtc agattcttaa agagcatcct 3840

gttgaaaata ctcaattgca aaatgaaaag ctctatctct attatctcca aaatggaaga 3900

gacatgtatg tggaccaaga attagatatt aatcgtttaa gtgattatga tgtcgatcac 3960

attgttccac aaagtttcct taaagacgat tcaatagaca ataaggtctt aacgcgttct 4020

gataaaaatc gtggtaaatc ggataacgtt ccaagtgaag aagtagtcaa aaagatgaaa 4080

aactattgga gacaacttct aaacgccaag ttaatcactc aacgtaagtt tgataattta 4140

acgaaagctg aacgtggagg tttgagtgaa cttgataaag ctggttttat caaacgccaa 4200

ttggttgaaa ctcgccaaat cactaagcat gtggcacaaa ttttggatag tcgcatgaat 4260

actaaatacg atgaaaatga taaacttatt cgagaggtta aagtgattac cttaaaatct 4320

aaattagttt ctgacttccg aaaagatttc caattctata aagtacgtga gattaacaat 4380

taccatcatg cccatgatgc gtatctaaat gccgtcgttg gaactgcttt gattaagaaa 4440

tatccaaaac ttgaatcgga gtttgtctat ggtgattata aagtttatga tgttcgtaaa 4500

atgattgcta agtctgagca agaaataggc aaagcaaccg caaaatattt cttttactct 4560

aatatcatga acttcttcaa aacagaaatt acacttgcaa atggagagat tcgcaaacgc 4620

cctctaatcg aaactaatgg ggaaactgga gaaattgtct gggataaagg gcgagatttt 4680

gccacagtgc gcaaagtatt gtccatgccc caagtcaata ttgtcaagaa aacagaagta 4740

cagacaggcg gattctccaa ggagtcaatt ttaccaaaaa gaaattcgga caagcttatt 4800

gctcgtaaaa aagactggga tccaaaaaaa tatggtggtt ttgatagtcc aacggtagct 4860

tattcagtcc tagtggttgc taaggtggaa aaagggaaat cgaagaagtt aaaatccgtt 4920

aaagagttac tagggatcac aattatggaa agaagttcct ttgaaaaaaa tccgattgac 4980

tttttagaag ctaaaggata taaggaagtt aaaaaagact taatcattaa actacctaaa 5040

tatagtcttt ttgagttaga aaacggtcgt aaacggatgc tggctagtgc cggagaatta 5100

caaaaaggaa atgagctggc tctgccaagc aaatatgtga attttttata tttagctagt 5160

cattatgaaa agttgaaggg tagtccagaa gataacgaac aaaaacaatt gtttgtggag 5220

cagcataagc attatttaga tgagattatt gagcaaatca gtgaattttc taagcgtgtt 5280

attttagcag atgccaattt agataaagtt cttagtgcat ataacaaaca tagagacaaa 5340

ccaatacgtg aacaagcaga aaatattatt catttattta cgttgacgaa tcttggagct 5400

cccgctgctt ttaaatattt tgatacaaca attgatcgta aacgatatac gtctacaaaa 5460

gaagttttag atgccactct tatccatcaa tccatcactg gtctttatga aacacgcatt 5520

gatttgagtc agctaggagg tgactgacgt gcatgcaggc cggggcatat gggaaacagc 5580

gcggacgcag cggaatttcc aatttcatgc cgcagccgcc tgcgctgttc tcatttgcgg 5640

cttccttgta gagctcagca ttattgagtg gatgattata ttccttttga taggtggtat 5700

gttttcgctt gaacttttaa atacagccat tgaacatacg gttgatttaa taactgacaa 5760

acatcaccct cttgctaaag cggccaagga cgctgccgcc ggggctgttt gcgtttttgc 5820

cgtgatttcg tgtatcattg gtttacttat ttttttgcca aagctgtaat ggctgaaaat 5880

tcttacattt attttacatt tttagaaatg ggcgtgaaaa aaagcgcgcg attatgtaaa 5940

atataaagtg atagcggtac cattataggt aagagaggaa tgtacacgtt tcggtgatga 6000

cctttccagt cgggaaacct gtcgtaggtc gttcgctcca agcgttttag agctagaaat 6060

agcaagttaa aataaggcta gtccgttatc aacttgaaaa agtggcaccc ttcctcgctc 6120

actgactcgc tgcgctcggt cgttcggctg cggcgagcgg tatcagctca ctcaaaggcg 6180

gtaatacggt tatccacaga atcaggggat aacgcaggaa agaacatgtg agcaaaaggc 6240

cagcaaaagg ccaggaaccg taaaaaggcc gcgttgctgg cgtttttcca taggctccgc 6300

ccccctgacg agcatcacaa aaatcgacgc tcaagtcaga ggtggcgaaa cccgacagga 6360

ctataaagat accaggcgtt tccccctgga agctccctcg tgcgctctcc tgttccgacc 6420

ctgccgctta ccggatacct gtccgccttt ctcccttcgg gaagcgtggc gctttctcat 6480

agctcacgct gtaggtatct cagttcggtg taggtcgttc gctccaagct gggctgtgtg 6540

cacgaacccc ccgttcagcc cgaccgctgc gccttatccg gtaactatcg tcttgagtcc 6600

aacccggtaa gacacgactt atcgccactg gcagcagcca ctggtaacag gattagcaga 6660

gcgaggtatg taggcggtgc tacagagttc ttgaagtggt ggcctaacta cggctacact 6720

agaaggacag tatttggtat ctgcgctctg ctgaagccag ttaccttcgg aaaaagagtt 6780

ggtagctctt gatccggcaa acaaaccacc gctggtagcg gtggtttttt tgtttgcaag 6840

cagcagatta cgcgcagaaa aaaaggatct caagaagatc ctttgatctt ttctacgggg 6900

tctgacgctc agtggaacga aaactcacgt taagggattt tggtcatgag attatcaaaa 6960

aggatcttca cctagatcct tttaaattaa aaatgaagtt ttaaatcaat ctaaagtata 7020

tatgagtaaa cttggtctga cagaaaggat ttttcgctac gctcaaatcc tttaaaaaaa 7080

cacaaaagac cacatttttt aatgtggtct ttattcttca actaaagcac ccattagttc 7140

aacaaacgaa aattggataa agtgggatat ttttaaaata tatatttatg ttacagtaat 7200

attgactttt aaaaaaggat tgattctaat gaagaaagca gacaagtaag cctcctaaat 7260

tcactttaga taaaaattta ggaggcatat caaatgaact ttaataaaat tgatttagac 7320

aattggaaga gaaaagagat atttaatcat tatttgaacc aacaaacgac ttttagtata 7380

accacagaaa ttgatattag tgttttatac cgaaacataa aacaagaagg atataaattt 7440

taccctgcat ttattttctt agtgacaagg gtgataaact caaatacagc ttttagaact 7500

ggttacaata gcgacggaga gttaggttat tgggataagt tagagccact ttatacaatt 7560

tttgatggtg tatctaaaac attctctggt atttggactc ctgtaaagaa tgacttcaaa 7620

gagttttatg atttatacct ttctgatgta gagaaatata atggttcggg gaaattgttt 7680

cccaaaacac ctatacctga aaatgctttt tctctttcta ttattccatg gacttcattt 7740

actgggttta acttaaatat caataataat agtaattacc ttctacccat tattacagca 7800

ggaaaattca ttaataaagg taattcaata tatttaccgc tatctttaca ggtacatcat 7860

tctgtttgtg atggttatca tgcaggattg tttatgaact ctattcagga attgtcagat 7920

aggcctaatg actggctttt ataatatgag ataatgccga ctgtactttt tacagtcggt 7980

tttctaatgt cactaacctg ccccgttagt tgaagaaggt ttttatatta cagctccaga 8040

tccatatcct ttaatggacg cagcgcatca cacgcaaaaa ggaaattgga ataaatgcga 8100

aatttgagat gttaattaaa gacctttttg aggtcttttt ttcttagatt tttggggtta 8160

tttaggggag aaaacatagg ggggtactac gacctccccc ctaggtgtcc attgtccatt 8220

gtccaaacaa ataaataaat attgggtttt taatgttaaa aggttgtttt ttatgttaaa 8280

gtgaaaaaaa cagatgttgg gaggtacagt gatggttgta gatagaaaag aagagaaaaa 8340

agttgctgtt actttaagac ttacaacaga agaaaatgag atattaaata gaatcaaaga 8400

aaaatataat attagcaaat cagatgcaac cggtattcta ataaaaaaat atgcaaagga 8460

ggaatacggt gcattttaaa caaaaaaaga tagacagcac tggcatgctg cctatctatg 8520

actaaatttt gttaagtgta ttagcaccgt tattatatga tgagcgaaaa tgtaataaaa 8580

gaaactgaaa acaagaaaaa ttcaagagga cgtaattgga catttgtttt atatccagaa 8640

tcagcaaaag ccgagtggtt agagtattta aaagagttac acattcaatt tgtagtgtct 8700

ccattacatg atagggatac tgatacagaa ggtaggatga aaaaagagca ttatcatatt 8760

ctagtgatgt atgagggtaa taaatcttat gaacagataa aaataattaa cagaagaatt 8820

gaatgcgact attccgcaga ttgcaggaag tgtgaaaggt cttgtgagat atatgcttca 8880

catggacgat cctaataaat ttaaatatca aaaagaagat atgatagttt atggcggtgt 8940

agatgttgat gaattattaa agaaaacaac aacagataga tataaattaa ttaaagaaat 9000

gattgagttt attgatgaac aaggaatcgt agaatttaag agtttaatgg attatgcaat 9060

gaagtttaaa tttgatgatt ggttcccgct tttatgtgat aactcggcgt atgttattca 9120

agaatatata aaatcaaatc ggtataaatc tgaccgatag attttgaatt taggtgtcac 9180

aagacactct tttttcgcac cagcgaaaac tggtttaagc cgactgcgca aaagaca 9237

<210> 83

<211> 9237

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 83

ctaacttata ggggtaacac ttaaaaaaga atcaataacg atagaaaccg ctcctaaagc 60

aggtgcattt tttcctaacg aagaaggcaa tagttcacat ttattgtcta aatgagaatg 120

gactctagaa gaaacttcgt ttttaatcgt atttaaaaca atgggatgag attcaattat 180

atgatttctc aagataacag cttctatatc aaatgtatta aggatattgg ttaatccaat 240

tccgatataa aagccaaagt tttgaagtgc atttaacatt tctacatcat ttttatttgc 300

gcgttccaca atctcttttc gagaaatatt cttttcttct ttagagagcg aagccagtaa 360

cgctttttca gaagcatata attcccaaca gcctcgattt ccacagctgc atttgggtcc 420

attaaaatct atcgtcatat gacccatttc cccagaaaaa ccctgaacac ctttatacaa 480

ttcgttgtta ataacaagtc cagttccaat tccgatatta atactgatgt aaacgatgtt 540

ttcatagttt tttgtcatac caaatacttt ttcaccgtat gctcctgcat tagcttcatt 600

ttcaacaaaa accggaacat taaactcact ctcaattaaa aactgcaaat ctttgatatt 660

ccaatttaag ttaggcatga aaataatttg ctgatgacga tctacaaggc ctggaacaca 720

aattcctatt ccgactagac cataagggga ctcaggcata tgggttacaa aaccatgaat 780

aagtgcaaat aaaatctctt ttacttcact agcggaagaa ctagacaagt cagaagtctt 840

ctcgagaata atatttcctt ctaagtcggt tagaattccg ttaagatagt cgactcctat 900

atcaatacca atcgagtagc ctgcattctt attaaaaaca agcattacag gtcttctgcc 960

gcctctagat tgccctgccc caatttcaaa aataaaatct ttttcaagca gtgtatttac 1020

ttgagaggag acagtagact tgtttaatcc tgtaatctca gagagagttg ccctggagac 1080

aggggagttc ttcaaaattt catctaatat taatttttga ttcatttttt ttactaaagc 1140

ttgatctgca atttgaataa taaccactcc tttgtttatc caccgaacta agttggtgtt 1200

ttttgaagct tgaattagat atttaaaagt atcatatcta atattataac taaattttct 1260

aaaaaaaaca ttgaaataaa catttatttt gtatatgatg agataaagtt agtttattgg 1320

ataaacaaac taactcaatt aagatagttg atggataaac ttgttcactt aaatcaaagg 1380

gggaaatgac aaatggtcca aactagtgat atctaaaaat caaaggggga aatgggatcc 1440

atggataaga aatactcaat aggcttagct atcggcacaa atagcgtcgg atgggcggtg 1500

atcactgatg aatataaggt tccgtctaaa aagttcaagg ttctgggaaa tacagaccgc 1560

cacagtatca aaaaaaatct tataggggct cttttatttg acagtggaga gacagcggaa 1620

gcgactcgtc tcaaacggac agctcgtaga aggtatacac gtcggaagaa tcgtatttgt 1680

tatctacagg agattttttc aaatgagatg gcgaaagtag atgatagttt ctttcatcga 1740

cttgaagagt cttttttggt ggaagaagac aagaagcatg aacgtcatcc tatttttgga 1800

aatatagtag atgaagttgc ttatcatgag aaatatccaa ctatctatca tctgcgaaaa 1860

aaattggtag attctactga taaagcggat ttgcgcttaa tctatttggc cttagcgcat 1920

atgattaagt ttcgtggtca ttttttgatt gagggagatt taaatcctga taatagtgat 1980

gtggacaaac tatttatcca gttggtacaa acctacaatc aattatttga agaaaaccct 2040

attaacgcaa gtggagtaga tgctaaagcg attctttctg cacgattgag taaatcaaga 2100

cgattagaaa atctcattgc tcagctcccc ggtgagaaga aaaatggctt atttgggaat 2160

ctcattgctt tgtcattggg tttgacccct aattttaaat caaattttga tttggcagaa 2220

gatgctaaat tacagctttc aaaagatact tacgatgatg atttagataa tttattggcg 2280

caaattggag atcaatatgc tgatttgttt ttggcagcta agaatttatc agatgctatt 2340

ttactttcag atatcctaag agtaaatact gaaataacta aggctcccct atcagcttca 2400

atgattaaac gctacgatga acatcatcaa gacttgactc ttttaaaagc tttagttcga 2460

caacaacttc cagaaaagta taaagaaatc ttttttgatc aatcaaaaaa cggatatgca 2520

ggttatattg atgggggagc tagccaagaa gaattttata aatttatcaa accaatttta 2580

gaaaaaatgg atggtactga ggaattattg gtgaaactaa atcgtgaaga tttgctgcgc 2640

aagcaacgga cctttgacaa cggctctatt ccccatcaaa ttcacttggg tgagctgcat 2700

gctattttga gaagacaaga agacttttat ccatttttaa aagacaatcg tgagaagatt 2760

gaaaaaatct tgacttttcg aattccttat tatgttggtc cattggcgcg tggcaatagt 2820

cgttttgcat ggatgactcg gaagtctgaa gaaacaatta ccccatggaa ttttgaagaa 2880

gttgtcgata aaggtgcttc agctcaatca tttattgaac gcatgacaaa ctttgataaa 2940

aatcttccaa atgaaaaagt actaccaaaa catagtttgc tttatgagta ttttacggtt 3000

tataacgaat tgacaaaggt caaatatgtt actgaaggaa tgcgaaaacc agcatttctt 3060

tcaggtgaac agaagaaagc cattgttgat ttactcttca aaacaaatcg aaaagtaacc 3120

gttaagcaat taaaagaaga ttatttcaaa aaaatagaat gttttgatag tgttgaaatt 3180

tcaggagttg aagatagatt taatgcttca ttaggtacct accatgattt gctaaaaatt 3240

attaaagata aagatttttt ggataatgaa gaaaatgaag atatcttaga ggatattgtt 3300

ttaacattga ccttatttga agatagggag atgattgagg aaagacttaa aacatatgct 3360

cacctctttg atgataaggt gatgaaacag cttaaacgtc gccgttatac tggttgggga 3420

cgtttgtctc gaaaattgat taatggtatt agggataagc aatctggcaa aacaatatta 3480

gattttttga aatcagatgg ttttgccaat cgcaatttta tgcagctgat ccatgatgat 3540

agtttgacat ttaaagaaga cattcaaaaa gcacaagtgt ctggacaagg cgatagttta 3600

catgaacata ttgcaaattt agctggtagc cctgctatta aaaaaggtat tttacagact 3660

gtaaaagttg ttgatgaatt ggtcaaagta atggggcggc ataagccaga aaatatcgtt 3720

attgaaatgg cacgtgaaaa tcagacaact caaaagggcc agaaaaattc gcgagagcgt 3780

atgaaacgaa tcgaagaagg tatcaaagaa ttaggaagtc agattcttaa agagcatcct 3840

gttgaaaata ctcaattgca aaatgaaaag ctctatctct attatctcca aaatggaaga 3900

gacatgtatg tggaccaaga attagatatt aatcgtttaa gtgattatga tgtcgatcac 3960

attgttccac aaagtttcct taaagacgat tcaatagaca ataaggtctt aacgcgttct 4020

gataaaaatc gtggtaaatc ggataacgtt ccaagtgaag aagtagtcaa aaagatgaaa 4080

aactattgga gacaacttct aaacgccaag ttaatcactc aacgtaagtt tgataattta 4140

acgaaagctg aacgtggagg tttgagtgaa cttgataaag ctggttttat caaacgccaa 4200

ttggttgaaa ctcgccaaat cactaagcat gtggcacaaa ttttggatag tcgcatgaat 4260

actaaatacg atgaaaatga taaacttatt cgagaggtta aagtgattac cttaaaatct 4320

aaattagttt ctgacttccg aaaagatttc caattctata aagtacgtga gattaacaat 4380

taccatcatg cccatgatgc gtatctaaat gccgtcgttg gaactgcttt gattaagaaa 4440

tatccaaaac ttgaatcgga gtttgtctat ggtgattata aagtttatga tgttcgtaaa 4500

atgattgcta agtctgagca agaaataggc aaagcaaccg caaaatattt cttttactct 4560

aatatcatga acttcttcaa aacagaaatt acacttgcaa atggagagat tcgcaaacgc 4620

cctctaatcg aaactaatgg ggaaactgga gaaattgtct gggataaagg gcgagatttt 4680

gccacagtgc gcaaagtatt gtccatgccc caagtcaata ttgtcaagaa aacagaagta 4740

cagacaggcg gattctccaa ggagtcaatt ttaccaaaaa gaaattcgga caagcttatt 4800

gctcgtaaaa aagactggga tccaaaaaaa tatggtggtt ttgatagtcc aacggtagct 4860

tattcagtcc tagtggttgc taaggtggaa aaagggaaat cgaagaagtt aaaatccgtt 4920

aaagagttac tagggatcac aattatggaa agaagttcct ttgaaaaaaa tccgattgac 4980

tttttagaag ctaaaggata taaggaagtt aaaaaagact taatcattaa actacctaaa 5040

tatagtcttt ttgagttaga aaacggtcgt aaacggatgc tggctagtgc cggagaatta 5100

caaaaaggaa atgagctggc tctgccaagc aaatatgtga attttttata tttagctagt 5160

cattatgaaa agttgaaggg tagtccagaa gataacgaac aaaaacaatt gtttgtggag 5220

cagcataagc attatttaga tgagattatt gagcaaatca gtgaattttc taagcgtgtt 5280

attttagcag atgccaattt agataaagtt cttagtgcat ataacaaaca tagagacaaa 5340

ccaatacgtg aacaagcaga aaatattatt catttattta cgttgacgaa tcttggagct 5400

cccgctgctt ttaaatattt tgatacaaca attgatcgta aacgatatac gtctacaaaa 5460

gaagttttag atgccactct tatccatcaa tccatcactg gtctttatga aacacgcatt 5520

gatttgagtc agctaggagg tgactgacgt gcatgcaggc cggggcatat gggaaacagc 5580

gcggacgcag cggaatttcc aatttcatgc cgcagccgcc tgcgctgttc tcatttgcgg 5640

cttccttgta gagctcagca ttattgagtg gatgattata ttccttttga taggtggtat 5700

gttttcgctt gaacttttaa atacagccat tgaacatacg gttgatttaa taactgacaa 5760

acatcaccct cttgctaaag cggccaagga cgctgccgcc ggggctgttt gcgtttttgc 5820

cgtgatttcg tgtatcattg gtttacttat ttttttgcca aagctgtaat ggctgaaaat 5880

tcttacattt attttacatt tttagaaatg ggcgtgaaaa aaagcgcgcg attatgtaaa 5940

atataaagtg atagcggtac cattataggt aagagaggaa tgtacacgtt tcggtgatga 6000

cctttccagt cgggaaacct gtcgtaggtc gttcgctcca agcgttttag agctagaaat 6060

agcaagttaa aataaggcta gtccgttatc aacttgaaaa agtggcaccc ttcctcgctc 6120

actgactcgc tgcgctcggt cgttcggctg cggcgagcgg tatcagctca ctcaaaggcg 6180

gtaatacggt tatccacaga atcaggggat aacgcaggaa agaacatgtg agcaaaaggc 6240

cagcaaaagg ccaggaaccg taaaaaggcc gcgttgctgg cgtttttcca taggctccgc 6300

ccccctgacg agcatcacaa aaatcgacgc tcaagtcaga ggtggcgaaa cccgacagga 6360

ctataaagat accaggcgtt tccccctgga agctccctcg tgcgctctcc tgttccgacc 6420

ctgccgctta ccggatacct gtccgccttt ctcccttcgg gaagcgtggc gctttctcat 6480

agctcacgct gtaggtatct cagttcggtg taggtcgttc gctccaagct gggctgtgtg 6540

cacgaacccc ccgttcagcc cgaccgctgc gccttatccg gtaactatcg tcttgagtcc 6600

aacccggtaa gacacgactt atcgccactg gcagcagcca ctggtaacag gattagcaga 6660

gcgaggtatg taggcggtgc tacagagttc ttgaagtggt ggcctaacta cggctacact 6720

agaaggacag tatttggtat ctgcgctctg ctgaagccag ttaccttcgg aaaaagagtt 6780

ggtagctctt gatccggcaa acaaaccacc gctggtagcg gtggtttttt tgtttgcaag 6840

cagcagatta cgcgcagaaa aaaaggatct caagaagatc ctttgatctt ttctacgggg 6900

tctgacgctc agtggaacga aaactcacgt taagggattt tggtcatgag attatcaaaa 6960

aggatcttca cctagatcct tttaaattaa aaatgaagtt ttaaatcaat ctaaagtata 7020

tatgagtaaa cttggtctga cagaaaggat ttttcgctac gctcaaatcc tttaaaaaaa 7080

cacaaaagac cacatttttt aatgtggtct ttattcttca actaaagcac ccattagttc 7140

aacaaacgaa aattggataa agtgggatat ttttaaaata tatatttatg ttacagtaat 7200

attgactttt aaaaaaggat tgattctaat gaagaaagca gacaagtaag cctcctaaat 7260

tcactttaga taaaaattta ggaggcatat caaatgaact ttaataaaat tgatttagac 7320

aattggaaga gaaaagagat atttaatcat tatttgaacc aacaaacgac ttttagtata 7380

accacagaaa ttgatattag tgttttatac cgaaacataa aacaagaagg atataaattt 7440

taccctgcat ttattttctt agtgacaagg gtgataaact caaatacagc ttttagaact 7500

ggttacaata gcgacggaga gttaggttat tgggataagt tagagccact ttatacaatt 7560

tttgatggtg tatctaaaac attctctggt atttggactc ctgtaaagaa tgacttcaaa 7620

gagttttatg atttatacct ttctgatgta gagaaatata atggttcggg gaaattgttt 7680

cccaaaacac ctatacctga aaatgctttt tctctttcta ttattccatg gacttcattt 7740

actgggttta acttaaatat caataataat agtaattacc ttctacccat tattacagca 7800

ggaaaattca ttaataaagg taattcaata tatttaccgc tatctttaca ggtacatcat 7860

tctgtttgtg atggttatca tgcaggattg tttatgaact ctattcagga attgtcagat 7920

aggcctaatg actggctttt ataatatgag ataatgccga ctgtactttt tacagtcggt 7980

tttctaatgt cactaacctg ccccgttagt tgaagaaggt ttttatatta cagctccaga 8040

tccatatcct ttaatggacg cagcgcatca cacgcaaaaa ggaaattgga ataaatgcga 8100

aatttgagat gttaattaaa gacctttttg aggtcttttt ttcttagatt tttggggtta 8160

tttaggggag aaaacatagg ggggtactac gacctccccc ctaggtgtcc attgtccatt 8220

gtccaaacaa ataaataaat attgggtttt taatgttaaa aggttgtttt ttatgttaaa 8280

gtgaaaaaaa cagatgttgg gaggtacagt gatggttgta gatagaaaag aagagaaaaa 8340

agttgctgtt actttaagac ttacaacaga agaaaatgag atattaaata gaatcaaaga 8400

aaaatataat attagcaaat cagatgcaac cggtattcta ataaaaaaat atgcaaagga 8460

ggaatacggt gcattttaaa caaaaaaaga tagacagcac tggcatgctg cctatctatg 8520

actaaatttt gttaagtgta ttagcaccgt tattatatga tgagcgaaaa tgtaataaaa 8580

gaaactgaaa acaagaaaaa ttcaagagga cgtaattgga catttgtttt atatccagaa 8640

tcagcaaaag ccgagtggtt agagtattta aaagagttac acattcaatt tgtagtgtct 8700

ccattacatg atagggatac tgatacagaa ggtaggatga aaaaagagca ttatcatatt 8760

ctagtgatgt atgagggtaa taaatcttat gaacagataa aaataattaa cagaagaatt 8820

gaatgcgact attccgcaga ttgcaggaag tgtgaaaggt cttgtgagat atatgcttca 8880

catggacgat cctaataaat ttaaatatca aaaagaagat atgatagttt atggcggtgt 8940

agatgttgat gaattattaa agaaaacaac aacagataga tataaattaa ttaaagaaat 9000

gattgagttt attgatgaac aaggaatcgt agaatttaag agtttaatgg attatgcaat 9060

gaagtttaaa tttgatgatt ggttcccgct tttatgtgat aactcggcgt atgttattca 9120

agaatatata aaatcaaatc ggtataaatc tgaccgatag attttgaatt taggtgtcac 9180

aagacactct tttttcgcac cagcgaaaac tggtttaagc cgactgcgca aaagaca 9237

<210> 84

<211> 86

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 84

agggaaaaat gcctttatta ccggaaccta tggtaaaaaa agcgatttta atgagctgat 60

ttcggtatac agttgagaca agatct 86

<210> 85

<211> 86

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 85

gctgacgatt cgaaatgtaa gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc 60

cgttatcaac ttgaaaaagt ggcacc 86

<210> 86

<211> 1049

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 86

gcctcgtgat acgcctattt ttataggtta atgtcatgat aataatggtt tcttagacgt 60

caggtggcac ttttcgggga aatgtgcgcg gaacccctat ttgtttattt ttctaaatac 120

attcaaatat gtatccgctc atgagacaat aaccctgata aatgcttcaa taatattgaa 180

aaaggaagag tatgagtatt caacatttcc gtgtcgccct tattcccttt tttgcggcat 240

tttgccttcc tgtttttgct cacccagaaa cgctggtgaa agtaaaagat gctgaagatc 300

agttgggtgc acgagtgggt tacatcgaac tggatctcaa cagcggtaag atccttgaga 360

gttttcgccc cgaagaacgt tttccaatga tgagcacttt taaagttctg ctatgtggcg 420

cggtattatc ccgtattgac gccgggcaag agcaactcgg tcgccgcata cactattctc 480

agaatgactt ggttgagtac tcaccagtca cagaaaagca tcttacggat ggcatgacag 540

taagagaatt atgcagtgct gccataacca tgagtgataa cactgcggcc aacttacttc 600

tgacaacgat cggaggaccg aaggagctaa ccgctttttt gcacaacatg ggggatcatg 660

taactcgcct tgatcgttgg gaaccggagc tgaatgaagc cataccaaac gacgagcgtg 720

acaccacgat gcctgtagca atggcaacaa cgttgcgcaa actattaact ggcgaactac 780

ttactctagc ttcccggcaa caattaatag actggatgga ggcggataaa gttgcaggac 840

cacttctgcg ctcggccctt ccggctggct ggtttattgc tgataaatct ggagccggtg 900

agcgtgggtc acgcggtatc attgcagcac tggggccaga tggtaagccc tcccgtatcg 960

tagttatcta cacgacgggg agtcaggcaa ctatggatga acgaaataga cagatcgctg 1020

agataggtgc ctcactgatt aagcattgg 1049

<210> 87

<211> 5270

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 87

ggttgataat gaactgtgct gattacaaaa atactaaaaa tgcccatatt ttttcctcct 60

tataaaatta gtataattat agcacgaaaa ggatctaggt gaagatcctt tttgataatc 120

tcatgaccaa aatcccttaa cgtgagtttt cgttccactg agcgtcagac cccgtagaaa 180

agatcaaagg atcttcttga gatccttttt ttctgcgcgt aatctgctgc ttgcaaacaa 240

aaaaaccacc gctaccagcg gtggtttgtt tgccggatca agagctacca actctttttc 300

cgaaggtaac tggcttcagc agagcgcaga taccaaatac tgttcttcta gtgtagccgt 360

agttaggcca ccacttcaag aactctgtag caccgcctac atacctcgct ctgctaatcc 420

tgttaccagt ggctgctgcc agtggcgata agtcgtgtct taccgggttg gactcaagac 480

gatagttacc ggataaggcg cagcggtcgg gctgaacggg gggttcgtgc acacagccca 540

gcttggagcg aacgacctac accgaactga gatacctaca gcgtgagcta tgagaaagcg 600

ccacgcttcc cgaagggaga aaggcggaca ggtatccggt aagcggcagg gtcggaacag 660

gagagcgcac gagggagctt ccagggggaa acgcctggta tctttatagt cctgtcgggt 720

ttcgccacct ctgacttgag cgtcgatttt tgtgatgctc gtcagggggg cggagcctat 780

ggaaaaacgc cagcaacgcg gcctttttac ggttcctggc cttttgctgg ccttttgctc 840

acatgttctt tcctgcgtta tcccctgatt ctgtggataa ccgtattacc gcctttgagt 900

gagctgatac cgctcgccgc agccgaacga ccgagcgcag cgagtcagtg agcgaggaag 960

cggaagagcg cccaatacgc aaaccgcctc tccccgcgcg ttggccgatt cattaatgca 1020

gctggcacga caggtttccc gactggaaag cgggcagtga gcgcaacgca attaatgtga 1080

gttagctcac tcattaggca ccccaggctt tacactttat gcttccggct cgtatgttgt 1140

gtggaattgt gagcggataa caatttcaca caggaaacag ctatgaccat gattacgcca 1200

gggaaaaatg cctttattac cggaacctat ggtaaaaaaa gcgattttaa tgagctgatt 1260

tcggtataca gttgagacaa gatctgctga cgattcgaaa tgtaagtttt agagctagaa 1320

atagcaagtt aaaataaggc tagtccgtta tcaacttgaa aaagtggcac caagcttggc 1380

tgcaggtcga cggatccccg ggaattcact ggccgtcgtt ttacaacgtc gtgactggga 1440

aaaccctggc gttacccaac ttaatcgcct tgcagcacat ccccctttcg ccagctggcg 1500

taatagcgaa gaggcccgca ccgatcgccc ttcccaacag ttgcgcagcc tgaatggcga 1560

atggcgacta acggggcagg ttagtgacat tagcctcgtg atacgcctat ttttataggt 1620

taatgtcatg ataataatgg tttcttagac gtcaggtggc acttttcggg gaaatgtgcg 1680

cggaacccct atttgtttat ttttctaaat acattcaaat atgtatccgc tcatgagaca 1740

ataaccctga taaatgcttc aataatattg aaaaaggaag agtatgagta ttcaacattt 1800

ccgtgtcgcc cttattccct tttttgcggc attttgcctt cctgtttttg ctcacccaga 1860

aacgctggtg aaagtaaaag atgctgaaga tcagttgggt gcacgagtgg gttacatcga 1920

actggatctc aacagcggta agatccttga gagttttcgc cccgaagaac gttttccaat 1980

gatgagcact tttaaagttc tgctatgtgg cgcggtatta tcccgtattg acgccgggca 2040

agagcaactc ggtcgccgca tacactattc tcagaatgac ttggttgagt actcaccagt 2100

cacagaaaag catcttacgg atggcatgac agtaagagaa ttatgcagtg ctgccataac 2160

catgagtgat aacactgcgg ccaacttact tctgacaacg atcggaggac cgaaggagct 2220

aaccgctttt ttgcacaaca tgggggatca tgtaactcgc cttgatcgtt gggaaccgga 2280

gctgaatgaa gccataccaa acgacgagcg tgacaccacg atgcctgtag caatggcaac 2340

aacgttgcgc aaactattaa ctggcgaact acttactcta gcttcccggc aacaattaat 2400

agactggatg gaggcggata aagttgcagg accacttctg cgctcggccc ttccggctgg 2460

ctggtttatt gctgataaat ctggagccgg tgagcgtggg tcacgcggta tcattgcagc 2520

actggggcca gatggtaagc cctcccgtat cgtagttatc tacacgacgg ggagtcaggc 2580

aactatggat gaacgaaata gacagatcgc tgagataggt gcctcactga ttaagcattg 2640

gaggaggctt acttgtctgc tttcttcatt agaatcaatc cttttttaaa agtcaatatt 2700

actgtaacat aaatatatat tttaaaaata tcccacttta tccaattttc gtttgttgaa 2760

ctaatgggtg ctttagttga agaataaaag accacattaa aaaatgtggt cttttgtgtt 2820

tttttaaagg atttgagcgt agcgaaaaat ccttttcttt cttatcttga tactatatag 2880

aaacaacatc atttttcaaa attaggtcaa agccttgtgt atcaagggtt tgatggttct 2940

ttgacaggta aaaactcctt ctgctattat taaggtgtcg aatcaaaata atagaatgct 3000

agagaactag ctcagaagga gtttttttgt tgatttattc atctgaaaat gattatagca 3060

tcctcgaaga taaaaccgca acaggtaaaa agcgggattg gaaggggaaa aagagacgga 3120

cgaacctcat ggcggagcat tacgaagcgt tagagagtaa gattggggca ccttactatg 3180

gcaaaaaggc tgaaaaacta attagttgtg cagagtatct ttcgtttaag agggatccgg 3240

agacgggcaa gttaaaactg tatcaagccc atttttgtaa agtgaggtta tgtccgatgt 3300

gtgcgtggcg caggtcgtta aaaattgctt atcacaataa gttgatcgta gaggaagcca 3360

atagacagta cggctgcgga tggatttttc tcacgctgac gattcgaaat gtaaagggag 3420

aacggctgaa gccacaaatt tctgcgatga tggaaggctt taggaaactg ttccagtaca 3480

aaaaagtaaa aacttcggtt cttggatttt tcagagcttt agagattacc aaaaatcatg 3540

aagaagatac atatcatcct cattttcatg tgttgatacc agtaaggaaa aattattttg 3600

ggaaaaacta tattaagcag gcggagtgga cgagcctttg gaaaaaggcg atgaaattgg 3660

attacactcc aattgtcgat attcgtcgag tgaaaggtaa agctaagatt gacgctgaac 3720

agattgaaaa cgatgtgcgg aacgcaatga tggagcaaaa agctgttctc gaaatctcta 3780

aatatccggt taaggatacg gatgttgtgc gcggtaataa ggtgactgaa gacaatctga 3840

acacggtgct ttacttggat gatgcgttgg cagctcgaag gttaattgga tacggtggca 3900

ttttgaagga gatacataaa gagctgaatc ttggtgatgc ggaggacggc gatctggtca 3960

agattgagga agaagatgac gaggttgcaa atggtgcatt tgaggttatg gcttattggc 4020

atcctggcat taaaaattac ataatcaaat aaaaaaagca gacctttaga aggcctgctt 4080

ttttaactaa cccatttgta ttgtgttgaa atatgttttg tatggtgcac tctcagtaca 4140

atctgctctg atgccgcata gttaagccag ccccgacacc cgccaacacc cgctgacgcg 4200

ccctgacggg cttgtctgct cccggcatcc gcttacagac aagctgtgac cgtctccggg 4260

agctgcatgt gtcagaggtt ttcaccgtca tcaccgaaac gcgcgagacg aaagggcctc 4320

gtgatacgcc tatttttata ggttaatgtc atgataataa tggtttctta gcgattcaca 4380

aaaaataggc acacgaaaaa caagttaagg gatgcagttt atgcatccct tacttattaa 4440

ataatttata gctattgaaa agagataaga attgttcaaa gctaatattg tttaaatcgt 4500

caattcctgc atgttttaag gaattgttaa attgattttt tgtaaatatt ttcttgtatt 4560

ctttgttaac ccatttcata acgaaataat tatacttttg tttatctttg tgtgatattc 4620

ttgatttttt tctacttaat ctgataagtg agctattcac tttaggttta ggatgaaaat 4680

attctcttgg aaccatactt aatatagaaa tatcaacttc tgccattaaa agtaatgcca 4740

atgagcgttt tgtatttaat aatcttttag caaacccgta ttccacgatt aaataaatct 4800

cattagctat actatcaaaa acaattttgc gtattatatc cgtacttatg ttataaggta 4860

tattaccata tattttatag gattggtttt taggaaattt aaactgcaat atatccttgt 4920

ttaaaacttg gaaattatcg tgatcaacaa gtttattttc tgtagttttg cataatttat 4980

ggtctatttc aatggcagtt acgaaattac acctctttac taattcaagg gtaaaatggc 5040

cttttcctga gccgatttca aagatattat catgttcatt taatcttata tttgtcatta 5100

ttttatctat attatgtttt gaagtaataa agttttgact gtgttttata tttttctcgt 5160

tcattataac cctctttaat ttggttatat gaattttgct tattaacgat tcattataac 5220

cacttatttt ttgtttggtt gataatgaac tgtgctgatt acaaaaatac 5270

<210> 88

<211> 2216

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 88

gctgtttcct gtgtgaaatt gttatccgct cacaattcca cacaacatac gagccggaag 60

cataaagtgt aaagcctggg gtgcctaatg agtgagctaa ctcacattaa ttgcgttgcg 120

ctcactgccc gctttccagt cgggaaacct gtcgtgccag ctgcattaat gaatcggcca 180

acgcgcgggg agaggcggtt tgcgtattgg gcgctcttcc gcttcctcgc tcactgactc 240

gctgcgctcg gtcgttcggc tgcggcgagc ggtatcagct cactcaaagg cggtaatacg 300

gttatccaca gaatcagggg ataacgcagg aaagaacatg tgagcaaaag gccagcaaaa 360

ggccaggaac cgtaaaaagg ccgcgttgct ggcgtttttc cataggctcc gcccccctga 420

cgagcatcac aaaaatcgac gctcaagtca gaggtggcga aacccgacag gactataaag 480

ataccaggcg tttccccctg gaagctccct cgtgcgctct cctgttccga ccctgccgct 540

taccggatac ctgtccgcct ttctcccttc gggaagcgtg gcgctttctc atagctcacg 600

ctgtaggtat ctcagttcgg tgtaggtcgt tcgctccaag ctgggctgtg tgcacgaacc 660

ccccgttcag cccgaccgct gcgccttatc cggtaactat cgtcttgagt ccaacccggt 720

aagacacgac ttatcgccac tggcagcagc cactggtaac aggattagca gagcgaggta 780

tgtaggcggt gctacagagt tcttgaagtg gtggcctaac tacggctaca ctagaaggac 840

agtatttggt atctgcgctc tgctgaagcc agttaccttc ggaaaaagag ttggtagctc 900

ttgatccggc aaacaaacca ccgctggtag cggtggtttt tttgtttgca agcagcagat 960

tacgcgcaga aaaaaaggat ctcaagaaga tcctttgatc ttttctacgg ggtctgacgc 1020

tcagtggaac gaaaactcac gttaagggat tttggtcatg agattatcaa aaaggatctt 1080

cacctagatc cttttaaatt aaaaatgaag ttttaaatca atctaaagta tatatgagta 1140

aacttggtct gacagttacc aatgcttaat cagtgaggca cctatctcag cgatctgtct 1200

atttcgttca tccatagttg cctgactccc cgtcgtgtag ataactacga tacgggaggg 1260

cttaccatct ggccccagtg ctgcaatgat accgcgagac ccacgctcac cggctccaga 1320

tttatcagca ataaaccagc cagccggaag ggccgagcgc agaagtggtc ctgcaacttt 1380

atccgcctcc atccagtcta ttaattgttg ccgggaagct agagtaagta gttcgccagt 1440

taatagtttg cgcaacgttg ttgccattgc tacaggcatc gtggtgtcac gctcgtcgtt 1500

tggtatggct tcattcagct ccggttccca acgatcaagg cgagttacat gatcccccat 1560

gttgtgcaaa aaagcggtta gctccttcgg tcctccgatc gttgtcagaa gtaagttggc 1620

cgcagtgtta tcactcatgg ttatggcagc actgcataat tctcttactg tcatgccatc 1680

cgtaagatgc ttttctgtga ctggtgagta ctcaaccaag tcattctgag aatagtgtat 1740

gcggcgaccg agttgctctt gcccggcgtc aatacgggat aataccgcgc cacatagcag 1800

aactttaaaa gtgctcatca ttggaaaacg ttcttcgggg cgaaaactct caaggatctt 1860

accgctgttg agatccagtt cgatgtaacc cactcgtgca cccaactgat cttcagcatc 1920

ttttactttc accagcgttt ctgggtgagc aaaaacagga aggcaaaatg ccgcaaaaaa 1980

gggaataagg gcgacacgga aatgttgaat actcatactc ttcctttttc aatattattg 2040

aagcatttat cagggttatt gtctcatgag cggatacata tttgaatgta tttagaaaaa 2100

taaacaaata ggggttccgc gcacatttcc ccgaaaagtg ccacctgacg tctaagaaac 2160

cattattatc atgacattaa cctataaaaa taggcgtatc acgaggccct ttcgtc 2216

<210> 89

<211> 2722

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 89

gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc cgttatcaac ttgaaaaagt 60

ggcacccgtg catgcaggcc ggggcatatg ggaaacagcg cggacgcagc ggaatttcca 120

atttcatgcc gcagccgcct gcgctgttct catttgcggc ttccttgtag agctcagcat 180

tattgagtgg atgattatat tccttttgat aggtggtatg ttttcgcttg aacttttaaa 240

tacagccatt gaacatacgg ttgatttaat aactgacaaa catcaccctc ttgctaaagc 300

ggccaaggac gctgccgccg gggctgtttg cgtttttgcc gtgatttcgt gtatcattgg 360

tttacttatt tttttgccaa agctgtaatg gctgaaaatt cttacattta ttttacattt 420

ttagaaatgg gcgtgaaaaa aagcgcgcga ttatgtaaaa tataaagtga tagcggtacc 480

attataggta agagaggaat gtacacgctg tttcctgtgt gaaattgtta tccgctcaca 540

attccacaca acatacgagc cggaagcata aagtgtaaag cctggggtgc ctaatgagtg 600

agctaactca cattaattgc gttgcgctca ctgcccgctt tccagtcggg aaacctgtcg 660

tgccagctgc attaatgaat cggccaacgc gcggggagag gcggtttgcg tattgggcgc 720

tcttccgctt cctcgctcac tgactcgctg cgctcggtcg ttcggctgcg gcgagcggta 780

tcagctcact caaaggcggt aatacggtta tccacagaat caggggataa cgcaggaaag 840

aacatgtgag caaaaggcca gcaaaaggcc aggaaccgta aaaaggccgc gttgctggcg 900

tttttccata ggctccgccc ccctgacgag catcacaaaa atcgacgctc aagtcagagg 960

tggcgaaacc cgacaggact ataaagatac caggcgtttc cccctggaag ctccctcgtg 1020

cgctctcctg ttccgaccct gccgcttacc ggatacctgt ccgcctttct cccttcggga 1080

agcgtggcgc tttctcatag ctcacgctgt aggtatctca gttcggtgta ggtcgttcgc 1140

tccaagctgg gctgtgtgca cgaacccccc gttcagcccg accgctgcgc cttatccggt 1200

aactatcgtc ttgagtccaa cccggtaaga cacgacttat cgccactggc agcagccact 1260

ggtaacagga ttagcagagc gaggtatgta ggcggtgcta cagagttctt gaagtggtgg 1320

cctaactacg gctacactag aaggacagta tttggtatct gcgctctgct gaagccagtt 1380

accttcggaa aaagagttgg tagctcttga tccggcaaac aaaccaccgc tggtagcggt 1440

ggtttttttg tttgcaagca gcagattacg cgcagaaaaa aaggatctca agaagatcct 1500

ttgatctttt ctacggggtc tgacgctcag tggaacgaaa actcacgtta agggattttg 1560

gtcatgagat tatcaaaaag gatcttcacc tagatccttt taaattaaaa atgaagtttt 1620

aaatcaatct aaagtatata tgagtaaact tggtctgaca gttaccaatg cttaatcagt 1680

gaggcaccta tctcagcgat ctgtctattt cgttcatcca tagttgcctg actccccgtc 1740

gtgtagataa ctacgatacg ggagggctta ccatctggcc ccagtgctgc aatgataccg 1800

cgagacccac gctcaccggc tccagattta tcagcaataa accagccagc cggaagggcc 1860

gagcgcagaa gtggtcctgc aactttatcc gcctccatcc agtctattaa ttgttgccgg 1920

gaagctagag taagtagttc gccagttaat agtttgcgca acgttgttgc cattgctaca 1980

ggcatcgtgg tgtcacgctc gtcgtttggt atggcttcat tcagctccgg ttcccaacga 2040

tcaaggcgag ttacatgatc ccccatgttg tgcaaaaaag cggttagctc cttcggtcct 2100

ccgatcgttg tcagaagtaa gttggccgca gtgttatcac tcatggttat ggcagcactg 2160

cataattctc ttactgtcat gccatccgta agatgctttt ctgtgactgg tgagtactca 2220

accaagtcat tctgagaata gtgtatgcgg cgaccgagtt gctcttgccc ggcgtcaata 2280

cgggataata ccgcgccaca tagcagaact ttaaaagtgc tcatcattgg aaaacgttct 2340

tcggggcgaa aactctcaag gatcttaccg ctgttgagat ccagttcgat gtaacccact 2400

cgtgcaccca actgatcttc agcatctttt actttcacca gcgtttctgg gtgagcaaaa 2460

acaggaaggc aaaatgccgc aaaaaaggga ataagggcga cacggaaatg ttgaatactc 2520

atactcttcc tttttcaata ttattgaagc atttatcagg gttattgtct catgagcgga 2580

tacatatttg aatgtattta gaaaaataaa caaatagggg ttccgcgcac atttccccga 2640

aaagtgccac ctgacgtcta agaaaccatt attatcatga cattaaccta taaaaatagg 2700

cgtatcacga ggccctttcg tc 2722

<210> 90

<211> 1836

<212> DNA

<213> 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)

<400> 90

atggcgttta ccatgcagcc ggtcttaact tcgtcaccgc caatcggagc agaatggcgt 60

tacgaagtaa aatatgatgg gtaccgctgt attctccgca tccattcttc aggtgtgacc 120

ttaaccagca gaaatggtgt ggagctcagc agcaccttcc ctgaaatcac acaattcgcc 180

aaaactgcct ttcagcacct agaaaaagag cttccgctga cacttgacgg tgaaatcgta 240

tgtttggtga atccctgtcg tgcagatttt gaacaccttc aagtgcgggg gcgtttgaaa 300

aggccagaca agattcagga atcggcaaac gcgcggccgt gctgctttct cgcctttgat 360

ttgttagagc gaagcggaga agatgtaacg cttctttcgt atttggaccg caaaaaatcg 420

ctgcgtgaac tcatatccgc agcaaagctt cctgcatctc cagatcctta cgcaaaagaa 480

accattcaat ccattccctg ttatgatcat tttgatcaac tctgggagat ggtaataaaa 540

tatgacggag aaggaattgt agcgaagaaa acaaacagca aatggcttga aaagaagcgg 600

tcgtccgatt ggctcaaata taaaaacttt aaacaagctt atgtttgcat aacagggttc 660

aaccctaaca acgggtttct gacggtatcg gtgttaaaaa acggaataat gacaccgatt 720

gcctctgtct cgcacggaat gcgtgatgag gaaaaaagcg ctatacgcga gattatggaa 780

cagcacggac atcaaacacc ctcaggcgaa tttacgcttg aaccttcgat ttgtgcagct 840

gttcaatact taacaattct ccaaggcaca ttaagagagg tatcgtttat cggtttcgaa 900

ttccaaatgg actggaccga atgcacgtat gcgcaagtca tacgacactc caaaccggtt 960

cacccaaagc tccagttcac aagcctggat aaaatcatat ttgaaaagaa taaaaaaaca 1020

aaagaagatt ttattcagta tatgattgaa gtcagtgact acctgctccc atttctgaaa 1080

aaccgggctg tcaccgtcat ccgctatccg catggatcta ggagcgaatc atttttccaa 1140

aaaaacaagc cggactatgc gccggatttt gttcagtctt tctatgatgg aagccatgaa 1200

catattgtct gtgaggatat gtctacattg ctatggcttt gcaaccagct tgctttggag 1260

tttcacgttc cttttcaaac cattaaaagc aggcgtccgg ctgagattgt cattgattta 1320

gacccgcctt cgcgagatga ctttcttatg gccgtgcagg ccgcaaatga actgaagcgg 1380

ctgttggatt cctttggcat cacatcgtac ccgaagctgt ccggcaacaa aggcatccag 1440

ctttatattc ccttgtctcc cgaggcattt acgtatgaag aaacacgcca atttacgcag 1500

ctgatcgcag agtactgcac caatgcattt cccgagctct ttaccactga acgcttgatt 1560

aaaaacagac actgcaaatt gtatcttgat tatttgcagc atgcagaagg aaaaacgatt 1620

atctgtccct attcaacgag aggaaatgag cttgggactg ttgcagcccc gctctactgg 1680

catgaggtgc aatcatcttt aacacccgct ctgtttacaa ttgatacggt catcgatcga 1740

attaagaagc agggctgccc attttttgat ttttaccgca acccgcaaga cgaaccgctt 1800

agcgctatat tgcatcagtt gaagaaaaag agctga 1836

<210> 91

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 91

gcggtgatag cttctcgttc 20

<210> 92

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 92

gctgattcct gcggcaaaag 20

Claims (2)

1.提高枯草芽孢杆菌CRISPR-Cas9n基因组编辑系统多位点编辑效率的方法，其特征是包括如下步骤：

（1）根据编辑位点，构建枯草芽孢杆菌CRISPR-Cas9n基因组编辑系统；

所述枯草芽孢杆菌CRISPR-Cas9n基因组编辑系统由质粒pBSCas9n，pDonor和pHG组成；

（2）敲除待编辑枯草芽孢杆菌菌株的ligD基因，所述ligD基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.90所示；

（3）将步骤（1）获得的枯草芽孢杆菌CRISPR-Cas9n基因组编辑系统导入步骤（2）获得的重组菌中进行基因组多位点编辑；

所述质粒pBSCas9n以B. subtilis 168基因组为模板，用引物P43-F和P43-L扩增P43启动子序列，以质粒pUC18为模板，用引物ColE1-F和ColE1-L扩增pUC18复制子ColE1序列，用引物P43-F和ColE1-L将以上两片段融合为片段F1；这一步融合中，通过引物在P43启动子下游引入gRNA与Cas9蛋白结合的序列和终止子序列；以质粒pHP13为模板，用引物Cm-F和Cm-L扩增氯霉素抗性基因及其启动子序列Cm，以质粒pEBs-cop1为模板，用引物repF-F和repF-L扩增pEBs-cop1复制子repF序列，以质粒pAX01为模板，引物xylA-F和xylA-L扩增木糖启动子及诱导元件序列xylA cassette，用引物Cm-F和xylA-L将以上三片段融合为片段F2；以pCas9cur为出发质粒用引物Cas9-F和Cas9-L扩增Cas9基因序列；将获得的F1、F2和Cas9片段测定浓度后，按等摩尔比例加入CPEC PCR反应体系中进行一步组装，最终得到pBSCas9质粒；

通过对pBSCas9质粒上Cas9蛋白的内切酶区域进行点突变的方式获得Cas9n序列；以pBSCas9为模板，采用5’端磷酸化引物D10-F和D10-L全质粒扩增pBSCas9，通过引物引入点突变，将原Cas9序列中第10位Asp，其核苷酸序列为GAT突变为Ala，其核苷酸序列为GCT，得到Cas9n；全质粒扩增后的片段经T4连接酶连接、转化、筛选阳性克隆，得到质粒pBSCas9n；

所述Cas9基因核苷酸序列如SEQ ID NO.76所示；氯霉素抗性基因及其启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.77所示；质粒pEBS-cop1的复制子的核苷酸序列如SEQ ID NO.78所示；质粒pUC18的复制子的核苷酸序列如SEQ ID NO.79所示；枯草芽孢杆菌启动子P43的核苷酸序列如SEQ ID NO.80所示；质粒pAX01上的木糖启动子及诱导元件的核苷酸序列如SEQ IDNO.81所示；所述质粒pBSCas9的核苷酸序列如SEQ ID NO.82所示；所述质粒pBSCas9n的核苷酸序列如SEQ ID NO.83所示；所述引物P43-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.50所示；所述引物P43-L的核苷酸序列如SEQ ID NO.51所示；所述引物ColE1-F的核苷酸序列如SEQ IDNO.52所示；所述引物ColE1-L的核苷酸序列如SEQ ID NO.53所示；所述引物Cm-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.54所示；所述引物Cm-L的核苷酸序列如SEQ ID NO.55所示；所述引物repF-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.56所示；所述引物repF-L的核苷酸序列如SEQ ID NO.57所示；所述引物xylA-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.58所示；所述引物xylA-L的核苷酸序列如SEQ ID NO.59所示；所述引物Cas9-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.60所示；所述引物Cas9-L的核苷酸序列如SEQ ID NO.61所示；所述引物D10-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.62所示；所述引物D10-L的核苷酸序列如SEQ ID NO.63所示；

以枯草芽孢杆菌质粒pHP13为出发质粒构建pDonor质粒；

采用引物manp-F和manp-L对质粒pHP13进行第一轮全质粒扩增，扩增过程中通过引物引入启动子Pmanp序列，通过Golden Gate克隆重新连接质粒，获得质粒pHP13-2；采用引物gRNA-F和gRNA-L对pHP13-2质粒进行全质粒扩增，扩增过程中通过引物引入靶向复制子rep60的gRNA序列gRNA-rep60，通过Golden Gate克隆重新连接质粒，获得质粒pHP13-3；将质粒上的氯霉素基因及启动子序列替换为氨苄青霉素基因及启动子序列，以pGRB质粒为模板，采用引物Amp-F和Amp-L扩增氨苄青霉素基因及启动子序列；以pHP13-3为模板，采用引物P3-F和P3-L扩增模板质粒，以上两段PCR产物通过Golden Gate克隆连接，获得质粒pDonor；

所述枯草芽孢杆菌启动子Pmanp的核苷酸序列如SEQ ID NO.84所示；所述靶向复制子rep60的gRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.85所示；所述氨苄青霉素抗性基因及启动子核苷酸序列如SEQ ID NO.86所示，所述质粒pDonor的核苷酸序列如SEQ ID NO.87所示；所述引物manp-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.64所示；所述引物manp-L的核苷酸序列如SEQ IDNO.65所示；所述引物gRNA-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.66所示；所述引物gRNA-L的核苷酸序列如SEQ ID NO.67所示；所述引物Amp-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.68所示；所述引物Amp-L的核苷酸序列如SEQ ID NO.69所示；所述引物P3-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.70所示；所述引物P3-L的核苷酸序列如SEQ ID NO.71所示；

工具质粒pHG的构建：

以质粒pUC18为模板，采用引物pUC-F和pUC-L扩增复制子ColE1和氨苄青霉素基因Amp组合区域序列；以B. subtilis 168基因组为模板，采用引物P-F和P-L扩增P43启动子序列；以上两个PCR片段，通过CPEC进行一步组装，获得pHG质粒；在质粒的构建过程中，gRNA与Cas9蛋白结合的序列和终止子序列通过引物分别引入；

所述质粒pUC18的复制子ColE1和氨苄青霉素抗性基因及其启动子Amp组合区域核苷酸序列如SEQ ID NO.88所示，所述枯草芽孢杆菌启动子P43的核苷酸序列如SEQ ID NO.80所示，多位点gRNA表达过程中辅助质粒pHG的核苷酸序列如SEQ ID NO.89所示；所述引物pUC-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.72所示；所述引物pUC-L的核苷酸序列如SEQ ID NO.73所示；所述引物P-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.74所示；所述引物P-L的核苷酸序列如SEQ IDNO.75所示。

2.利用枯草芽孢杆菌CRISPR-Cas9n基因组编辑系统，提升枯草芽孢杆菌BS89的核黄素生产能力的方法，其特征包括如下步骤：

（1）对枯草芽孢杆菌BS89核黄素操纵子上的ribA，ribB，ribH三个基因的RBS区域进行同时修饰，三个修饰位点的gRNA序列为：gRNA-ribA、gRNA-ribB、gRNA-ribH，根据三个修饰位点的gRNA序列构建枯草芽孢杆菌CRISPR-Cas9n基因组编辑系统，所述ribA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.47所示；所述ribB基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.48所示；所述ribH基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.49所示；所述gRNA-ribA的核苷酸序列如SEQ ID NO.44所示；所述gRNA-ribB的核苷酸序列如SEQ ID NO.45所示；所述gRNA-ribH的核苷酸序列如SEQ IDNO.46所示；

（2）敲除枯草芽孢杆菌BS89菌株的ligD基因，所述ligD基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.90所示；

（3）将步骤（1）获得的CRISPR-Cas9n基因组编辑系统导入步骤（2）获得的重组菌中，对核黄素操纵子上的ribA，ribB，ribH三个基因的RBS区域进行随机突变，获得不同突变组合的菌株，从中筛选到核黄素生产能力显著提升的菌株。

Images