CN110558222A - 植物激素在促进大型钙化海藻生长速率、钙化作用、光合作用中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种植物激素在促进大型钙化海藻生长速率、钙化作用、光合作用中的应用。本发明通过探究不同浓度条件下IAA、NAA、GA和6‑BA对大型钙化海藻生长的影响，明确4种植物激素均呈现低浓度下促进和高浓度下抑制的特征，且IAA和NAA促进作用显著高于GA和6‑BA。本发明提供的添加外源植物激素培育的方式具有显著提高大型钙化海藻生长的效果。相比于传统的培养，本发明提供的方法简单、快捷，成本低廉，培育出的大型钙化海藻可以直接用于受损珊瑚礁的生态修复中，在恢复和维持珊瑚礁生态系统多样性和稳定性方面具有广泛用途。

Description

植物激素在促进大型钙化海藻生长速率、钙化作用、光合作用 中的应用

技术领域：

本发明属于生物技术领域，具体涉及植物激素在促进大型钙化海藻生长速率、钙化作用、光合作用中的应用。

背景技术：

大型钙化海藻(Calcifying macroalgae)作为珊瑚礁生态系统中一类重要的钙化生物，分布广泛，我国现记录的大型钙化海藻就有234种及变种。他们在珊瑚礁生态系统中具有极其重要的生态地位，不仅能够提高较高的初级生产力、参与并稳固珊瑚礁体，部分大型钙化海藻还能够为海洋无脊椎动物幼虫提供良好的附着变态的基底。但近几十年来，在全球气候变化和人类活动的双重影响下，世界范围内珊瑚礁生态系统总体处于严重退化之中，大型钙化海藻的生物量和多样性也受到了严重影响。因此，开展大型钙化海藻种群修复与重构对修复和保护珊瑚礁生态系统意义重大。目前，生长速率缓慢、生长周期长是实现大型钙化海藻种群修复的一个关键的瓶颈技术。如何提高大型钙化海藻的生长和钙化作用，缩短培育时间，成为了急需解决的重要问题。

植物激素(phytohormone)是由植物产生并维持其自身生长发育、代谢和适应环境等生理过程中重要的微量代谢产物，在调控细胞分裂、延伸、光合作用和抗氧化等方面有明显的作用。植物激素包括六大类：生长素(auxius)、赤霉素(gibberellins,GA)、细胞分裂素(cytokinins,CTK)、脱落酸(abscisic acid,ABA)、乙烯(ethylene,ET)和一类新的油菜素甾醇(brasinosteroloid,BR)。有研究表明植物激素对部分藻类具有调节作用，且存在明显的种间差异。王萍等(2007)发现不同种类植物激素对条斑紫菜(Porphyra yezoensis)叶状体组织生长和发育影响有所不同，当6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)浓度为2–6mg L^-1时有利于诱导形成紫菜小叶状体，2–4mg L^-1的2，4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)可促进叶状体更早发育成丝状体。

当前，对植物激素和藻类之间关系的研究主要集中在褐藻(海带)、红藻(龙须菜)等大型经济藻类和单细胞藻类和原核藻类(紫球藻、铜绿微囊藻)，对绿藻，特别是大型钙化绿藻的研究甚少，面对自然和人为等多种因素的干扰，保护珊瑚礁生物多样性迫在眉睫。

发明内容：

本发明的目的在于克服现有技术中的缺陷，提供一种植物激素在促进大型钙化海藻生长速率、钙化作用、光合作用中的应用。

本实验通过探究不同浓度条件下吲哚乙酸(IAA)、萘乙酸(NAA)、赤霉素(GA)和6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)四种植物激素对仙掌藻(Halimeda opuntia)生长速率、钙化作用、光合作用等生长特性影响，筛选出对仙掌藻有促进作用的植物激素种类和适宜浓度，以期为恢复和维持珊瑚礁生态系统生态多样性和健康发展提供理论基础。

本发明的第一个目的是提供植物激素在促进大型钙化海藻生长速率、钙化作用、光合作用中的应用。

优选，所述的植物激素在促进大型钙化海藻生长速率中的应用是植物激素在促进大型钙化海藻新叶形成中的应用。

所述的植物激素优选为吲哚乙酸、萘乙酸、赤霉素或6-苄氨基腺嘌呤。

所述的大型钙化海藻优选为仙掌藻(Halimeda opuntia)。

本发明的第二个目的是提供一种大型钙化海藻人工快速培育方法，在海水中添加植物激素，然后培育大型钙化海藻。

所述的植物激素优选为吲哚乙酸、萘乙酸、赤霉素或6-苄氨基腺嘌呤。

优选，当植物激素为吲哚乙酸时，其在海水中的浓度为0.5-2.0mg/L；当植物激素为萘乙酸时，其在海水中的浓度为0.5-1.5mg/L；当植物激素为赤霉素时，其在海水中的浓度为0.5-1.5mg/L；当植物激素为6-苄氨基腺嘌呤时，其在海水中的浓度为1.0-3.5mg/L。

所述的培育大型钙化海藻，其培育条件优选为：海水盐度33-34ppt，水温26-28℃，pH7.9-8.1，光暗周期12L：12D，光照强度150μmol photons m^-2s^-1，培养时间为42天，每周更换两次海水。

所述的大型钙化海藻优选为仙掌藻(Halimeda opuntia)。

本发明有益效果归纳如下：

(1)环境因子可控：采用立体多层次循环水培养结构，可以有效地利用室内空间，合理的空间结构可以为减少室内占地面积；

(2)材料容易获得：4种外源植物激素易获得，价格低廉，容易购买；

(3)促进效果显著：适宜的激素种类和浓度范围，可以显著提高大型钙化海藻的生长作用，特定生长率(SGR)最快可提高到2倍以上；

(4)培养条件简化：培养缸的每层通过隔离板，可以形成一个独立的培养单元，有利于培养过程中对光照强度的控制，同时可以造浪泵和控温棒调节水流和温度；适合不同环境梯度下大型钙化海藻的培养；

(5)应用范围广泛：本发明在大型钙化海藻培育、受损珊瑚礁生态修复、恢复和维持珊瑚礁生态多样性等方面具有广泛用途。

本发明提供一种利用添加外源植物激素的方式，在适宜浓度范围内促进大型钙化海藻的生长。通过探究不同浓度条件下吲哚乙酸(IAA)、萘乙酸(NAA)、赤霉素(GA)和6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)对大型钙化海藻生长的影响，明确4种植物激素均呈现低浓度下促进和高浓度下抑制的特征，其中，IAA浓度0.5–2.0mg L^-1、NAA浓度0.5–1.5mg L^-1、GA浓度0.5–1.5mg L^-1和6-BA浓度1.0–3.5mg L^-1，对大型钙化海藻的生长促进作用最显著，且IAA和NAA促进作用显著高于GA和6-BA。本发明提供的添加外源植物激素培育的方式具有显著提高大型钙化海藻生长的效果。相比于传统的培养，本发明提供的方法简单、快捷，成本低廉，培育出的大型钙化海藻可以直接用于受损珊瑚礁的生态修复中，在恢复和维持珊瑚礁生态系统多样性和稳定性方面具有广泛用途。

附图说明：

图1为4种植物激素在不同浓度培养条件下对大型钙化海藻特定生长率(SGR，％d^-1)和最大新生叶片率(New Seg_max，％)的影响；

图2为4种植物激素在不同浓度培养条件下对大型钙化海藻钙化速率(G_net，mg g^{- 1}d^-1)和钙质含量(CaCO₃，％)的影响；

图3为4种植物激素在不同浓度培养条件下对大型钙化海藻净光合产氧速率(P _net -O₂，nmol O₂ g^-1s^-1)的影响。

具体实施方式：

以下通过具体实施例对本发明的技术方案作进一步详细描述。提供的实施例是为了更好地理解本发明，而不应该被解释为限制本发明的目的。

在本发明的实施案例中所用到的材料包括：大型钙化海藻，立式不锈钢培养架，30L亚克力培养缸若干，数字式温度控制器和钛合金加热棒(Weipro，China)，造浪泵(Altman，China)，全光谱T5荧光水族灯，光照计(ELDONET Terrestrial Spectro-radiometer，Germany)，手持式多参数水质仪(YSI，Yellow Springs，OH，USA)，pH计(FE20，Mettler Toledo，Switzerland)，电子天平(AR224CN，OHAUS，USA；～0.1mg)，亚克力托盘，微型光纤氧气传感器(PreSens，OXY-4micro，US)，无菌海水，吲哚乙酸(IAA)，萘乙酸(NAA)，赤霉素(GA)和6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)(上海生工生物有限公司)。

实施例1：

1.样品采集与暂养

选用大型钙化海藻仙掌藻(Halimeda opuntia)为实验材料，藻种采集自西沙珊瑚礁区，采集深度为4–14m，充气培养运输至实验室循环水培养缸中暂养2周。暂养条件盐度33–34ppt，水温26–28℃，pH为8.1–8.3，光暗周期为12L：12D，光照强度150μmol photons m^{- 2}s^-1，暂养期间，仙掌藻生长状态良好，无明显白化现象。

2.案例设计

实验开始时，选取状态良好的仙掌藻，用过滤海水将附着的泥沙、杂藻等清除，放置到装有25L海水的30L的亚克力培养缸中，分别添加不同种类和浓度的外源植物激素(吲哚乙酸(IAA)、萘乙酸(NAA)、赤霉素(GA)和6-苄氨基腺嘌呤(6-BA))进行培育，IAA、NAA、GA和6-BA分别设置3个浓度梯度，每种浓度设3个重复，具体如下表1。培育条件为：海水盐度33–34ppt，水温控制在28±0.4℃，pH为7.9–8.1。实验水温采用数字式温度控制器和钛合金加热棒(Weipro，China)控制在～28℃；各培养缸中加置一个小型潜水泵(Altman，China)，流速为～300L h^-1；实验光照采用全光谱T5荧光水族灯，培养缸底部有效光照辐射为150μmol photons m^-2s^-1(ELDONET Terrestrial Spectro-radiometer，Germany)，光照周期为12L：12D，每株海藻均匀放置以保证接受相同的有效光照；每周更换两次海水，并重新添加对应浓度的四种植物激素。实验周期为42天，期间，每天对各实验缸的海水理化参数进行监测。海水温度和盐度用手持式多参数水质仪(YSI，Yellow Springs，OH，USA)测量；海水pH用pH计(FE20，Mettler Toledo，Switzerland)监测，使用前用NBS缓冲液校准(4.01，7.00，9.21，相对误差为±0.01)。

表1植物激素浓度设定

3.指标监测

3.1生长速率测定

在实验开始和结束时，用吸水纸将大型钙化海藻表面的海水吸干至恒重，并用电子天平称量鲜重(AR224CN，OHAUS，USA；～0.1mg)，特定生长率(specific growth rate，SGR，％d^-1)按照如下公式计算：

SGR＝[(lnW_t–lnW_t0)/t]×100

式中，W_t为第t天的鲜重(g)；W_t0为初始鲜重(g)；t为间隔的天数(d)。同时，实验开始和结束对每种选定的3株藻的叶片总数进行统计，计算新生叶片率(％)。

3.2钙化作用的测定

钙化速率(Net calcification rates，G_net，mg g^-1d^-1)通过浮重称量法进行测定。在实验开始和结束时，将直径为10cm的亚克力托盘悬挂于电子天平下方，完全浸没在过滤海水中直至读数恒定，校零；实验藻株置于托盘上称取浮重，并记录鲜重；计算公式如下：

G_net＝(F_wt–F_wo)/(W_o×t)

式中，F_wt和F_wo分别表示实验结束和开始时仙掌藻的浮重(mg)；W_o为海藻的初始鲜重(g)；t为间隔的天数(d)。

实验结束后，测定藻体组织中钙质含量(CaCO₃，％)。用蒸馏水将海藻清洗3–5次，用吸水纸吸干，放置60℃烘箱中烘干至恒重W_t1(g)；随后，用5％的12N HCl将所有样品脱钙，以再添加HCl不产生气泡为准，脱钙完成后，用蒸馏水再次清洗3-5次，60℃烘箱中烘干至恒重W_t2(g)。钙质含量的计算如下：

CaCO₃％＝(W_t1–W_t2)/W_t1×100

3.3光合作用的测定

光合作用效率的测定在微型光纤氧气传感器上进行(PreSens，OXY-4micro，US)。每隔7天的上午，从每个实验缸中取成熟叶片～100mg，精确称量鲜重并记录(g)，置于2ml的透明玻璃呼吸瓶中，内置3×5mm转子，装满海水，拧紧瓶盖并确认呼吸瓶中无气泡产生，呼吸瓶底部内壁贴有一个直径为3mm的光学感性贴片，将光纤传感器对准贴片，另一端连接溶氧测量仪。实验开始前，在实验海水温度(28℃)下利用两点经验值进行校正，即测定28℃条件下的饱和空气海水和饱和Na₂SO₃。设定光照为150μmol photons m^-2s^-1，转速～300rpm，测定10min内呼吸瓶内氧气含量变化；利用线性拟合计算净光合产氧速率(P_net-O₂，nmol O₂ g^-1s^-1)。

4.监测结果

4.1生长速率

培养期间，水温始终控制在28±0.4℃变化范围内，pH的变化范围是7.93–8.13；培养42天后，低浓度条件下，4种植物激素对仙掌藻的生长均有不同程度的促进作用(图1)。相对于对照组，IAA浓度0.5–2.0mg L^-1和NAA浓度0.5–1.5mg L^-1范围内，仙掌藻的SGR提高11.82–54.55％；随着浓度的升高，IAA(5.0mg L^-1)和NAA(4.0mg L^-1)对仙掌藻的SGR有不同程度的下降。低浓度GA(0.5–1.5mg L^-1)和6-BA(1.0–3.5mg L^-1)对仙掌藻SGR提高1.43–23.95％；高浓度6-BA(5.0mg L^-1)对仙掌藻有明显的抑制作用，下降了27.92％。4种植物激素可以促进仙掌藻新叶形成，其中，低浓度IAA(0.5–2.0mg L^-1)和NAA(0.5–1.5mg L^-1)促进作用最显著，仙掌藻新叶产生率为44.44–59.42％。

4.2钙化作用

低IAA浓度(0.5–2.0mg L^-1)和NAA浓度(0.5–1.5mg L^-1)培养下，仙掌藻的G_net比对照组提高了46.67–60.79％；GA(0.5–1.5mg L^-1)和6-BA(1.0–3.5mg L^-1)对仙掌藻的G_net提高5.56–38.94％；低IAA浓度(0.5–2.0mg L^-1)和NAA浓度(0.5–1.5mg L^-1)培养下，仙掌藻的CaCO₃％提高了1.73–6.57％；实验末期，高浓度的IAA(5.0mg L-1)下，仙掌藻CaCO₃％下降了4.86％(图2)。

4.3光合作用

如图3所示，4种植物激素均表现出低浓度下促进、高浓度抑制仙掌藻光合作用的特征。仙掌藻初始P_net-O₂为8.702±0.156nmol O₂ g^-1s^-1，经IAA浓度2.0mg L^-1、NAA浓度0.5–1.5mg L^-1、GA浓度0.5–1.5mg L^-1和6-BA浓度为1.0–3.5mg L^-1培养下，仙掌藻的净光合产氧速率提高到8.812–9.173nmol O₂ g^-1s^-1；高浓度NAA(4.0mg L^-1)、GA(4.0mg L^-1)和6-BA(5.0mg L^-1)抑制仙掌藻光合作用，其净光合产氧速率下降到8.398–8.693nmol O₂ g^-1s^-1。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。

Claims (9)

1.植物激素在促进大型钙化海藻生长速率、钙化作用、光合作用中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的植物激素在促进大型钙化海藻生长速率中的应用是植物激素在促进大型钙化海藻新叶形成中的应用。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述的植物激素为吲哚乙酸、萘乙酸、赤霉素或6-苄氨基腺嘌呤。

4.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述的大型钙化海藻为仙掌藻(Halimeda opuntia)。

5.一种大型钙化海藻人工快速培育方法，其特征在于：在海水中添加植物激素，然后培育大型钙化海藻。

6.根据权利要求5所述的大型钙化海藻人工快速培育方法，其特征在于，所述的植物激素为吲哚乙酸、萘乙酸、赤霉素或6-苄氨基腺嘌呤。

7.根据权利要求6所述的大型钙化海藻人工快速培育方法，其特征在于，当植物激素为吲哚乙酸时，其在海水中的浓度为0.5-2.0mg/L；当植物激素为萘乙酸时，其在海水中的浓度为0.5-1.5mg/L；当植物激素为赤霉素时，其在海水中的浓度为0.5-1.5mg/L；当植物激素为6-苄氨基腺嘌呤时，其在海水中的浓度为1.0-3.5mg/L。

8.权利要求5所述的大型钙化海藻人工快速培育方法，其特征在于，所述的培育大型钙化海藻，其培育条件为：海水盐度33-34ppt，水温26-28℃，pH 7.9-8.1，光暗周期12L：12D，光照强度150μmol photons m^-2s^-1，培养时间为42天，每周更换两次海水。

9.权利要求5所述的大型钙化海藻人工快速培育方法，其特征在于，所述的大型钙化海藻为仙掌藻(Halimeda opuntia)。