CN110551716B - 基因Glu525的制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基因Glu525的制备方法及其用途。是将Pseudoalteromonas carrageenovora ASY5接种至人工海水培养基中，培养后提取菌株基因组DNA；再以该菌株基因组DNA为模板，SEQ ID NO:3和4为上下游引物，进行扩增得到所述基因Glu525。基因Glu525和/或含有基因Glu525的载体用于制备低聚异麦芽糖的用途。

Description

基因Glu525的制备方法和用途

技术领域

本发明涉及基因领域，尤其涉及基因Glu525的制备方法和用途。

背景技术

α-葡糖苷酶在自然界广泛分布，又称葡糖糖基转移酶和葡萄糖转苷酶，它可以从低聚糖类底物的非还原末端切开α-1，4糖苷键，释放出葡萄糖，大多数还可将游离出的葡萄糖残基转移到另一糖类底物形成α-1，6糖苷键，从而得到非发酵性的低聚异麦芽糖或糖酯、糖肽等。α-葡萄糖苷酶广泛分布，几乎存在于所有生物体内，在人类的糖原降解和动物，植物以及微生物的糖代谢中具有重要的生理功能。目前，α-葡萄糖苷酶已广泛应用于基础和开发研究领域，主要包括生产淀粉水解、酒精发酵、代谢机理研究、食品成分分析和医学诊断等方面。

α-葡萄糖苷酶同时具有水解和转苷两种活性，不同的α-葡萄糖苷酶所表现出的这两种活性具有较大的差异.在低聚异麦芽糖生产中，针对不同生产目的，如对低聚异麦芽糖产品不同成分、不同浓度、不同纯度等的要求，需要选择具有不同转苷活性或水解活性的酶。目前关于α-葡萄糖苷酶的研究主要集中在酶基因的克隆及高效表达方面，而针对酶的性质研究及转苷应用分析报道较少，且产α–葡萄糖苷酶较高的微生物主要是黑曲霉。有鉴于此，本发明人研究并克隆得到了一条来源于食鹿角菜假交替单胞菌的基因Glu525，并将其在大肠杆菌中表达，制得一种可用于高效制备低聚异麦芽糖的基因Glu525。本案由此而生。

发明内容

本发明的目的在于提供一种高效制备低聚异麦芽糖的基因Glu525及其制备方法。

为实现上述目的，本发明提供一种基因Glu525的制备方法，其特征在于，从海水中制备得到。

进一步，将Pseudoalteromonas carrageenovora ASY5接种至人工海水培养基中，培养后提取菌株基因组DNA；再以该菌株基因组DNA为模板，SEQ ID NO:3和4为上下游引物，进行扩增得到所述基因Glu525。

进一步，所述扩增的程序为：95℃，5min；94℃，15s；55℃，15s，72℃，1min，30次循环，最后72℃，10min。

进一步，所述人工海水培养基的配置方法为，将牛肉浸膏和胰蛋白胨在蒸馏水中溶解后用NaOH调pH至7.8，加热煮沸10min，冷却后再次加NaOH调pH至7.3，然后和人工海水混合，灭菌即可；其中牛肉浸膏、胰蛋白胨、蒸馏水、人工海水的用量比例为：10g：10g：250mL：750mL；

所述人工海水为NaCl、KCl、CaCl₂、MgCl₂·6H₂O、NaHCO₃、MgSO₄·7H₂O和蒸馏水组成，其中NaCl、KCl、CaCl₂、MgCl₂·6H₂O、NaHCO₃、MgSO₄·7H₂O和蒸馏水的用量比例为：37.51g：1.03g：1.61g：6.4g：0.15g：4.67g：1000mL。

本发明还保护基因Glu525和/或含有基因Glu525的载体用于制备低聚异麦芽糖的用途。

进一步，在制备低聚异麦芽糖时，添加含有基因Glu525和/或含有基因Glu525的载体，通过控制反应时间，得到不同的低聚异麦芽糖。

进一步，所述反应时间为2-4h时，得到的主要是潘糖；当反应时间为5-8h时，得到的主要是异麦芽糖；当反应时间为16-22h时，得到的主要是异麦芽三糖。

本发明通过设计特异性引物，获得基因Glu525的DNA序列(如SEQ ID NO:1的64-2412bp所示)，该基因编码区长2412bp，编码803个氨基酸，其中1-21个氨基酸为信号肽，理论分子量为87.88kDa。大肠杆菌重组表达获得的基因Glu525具有较高酶活性，该酶可以在转苷反应中先水解一部分麦芽糖生成葡萄糖；再将葡萄糖以α-1,6糖苷键转移到麦芽糖分子上，生成潘糖；随着反应时间延长,该酶再水解麦芽糖分子和潘糖分子上的α-1,4糖苷键生成葡萄糖和异麦芽糖；当葡萄糖以α-1,6糖苷键转移到其它异麦芽糖分子上时,形成异麦芽三糖等，可以同时满足几种低聚异麦芽糖的生成需要，并且有着比较高的生成率。

其DNA序列如SEQ ID NO：1所示：

ATGAAAAAATATAACCTTATAACTGCCTCACTCTTAACATTAGGCTTAACTGCCTGTGGTGCACAAAACACAAGCACAGATAATAAAAATACCGCTGCACAGGTTAAATCAGCACCTGGCGCACCTGGTGTAGAGCCATTTTGGGCTTATGCAGGTAAAACAGGGATTGGCACGTCTTACGAGCAATACCAAAAAGGCCAATACAGTGATTCAGCTGCAACGGGCGATGTATCTAAGGTGTGGTTTTCAATTGCTAAAGGCATGATCACCGAAACCATGTTTGGGCTTATCCACCAAGCGCAGATTAAAGACATGCAGTTTGTTGTTACAGGTAAAGACTTTACCGTAACCGAAGCTGATGAATTAGATGTCACCATAGATTACTTATACAAAGATGCGCAAGGGCGCCCACTTTCGCTTGCCTACAAAGTAACAAGCACTGATAAACAAGGGCGCTTTAGCCTAGAAAAACACATATTTACCGACCCAGATGGGCAAACATTATTTGTTCGCAGTGTGTTTAACACTGAACTTGAAGGGTTAAAAGCTTATGTTGTTGTAAACCCTTACATAAATAATAACGGATTAGGTGACTTTGCTAAAACGACAGAGCAAGGGCTTGTGGCATGGGAAGACGATAACTATTTATCACTTCAATCAGCAACCCCTTTTAAAGCTAAAACAGTAGGTTTTACAGGTGAAAGCGATGGTATTAATGCACTTAAAACAACTCAAGCGCTAAACACTCATTATACAAATACTGGCGAAGCTGCAGGTAACGTAAGCATGTTGGCTGAGCTTGGCGAAATAAGCGCTAACACCACCTTCGATGTAGCACTTAGTTTTGGTAAAACACAGCAGCAAAGTATACAACAAGGCGAGCAAAGCTTAGCAAAAGGCTATCAAGCAGTGCTTGATCACTATAACGGTAAAGGTGAAGCGCTCGGCTGGCAAGATTACCTTCAAAGCCTTAAACCACTTAATACCATGGTTGAGCAAACCGCCGATAACGGAAAGCTTTTATACACCAGTGCCATGGTTTTAAAGGCACAAGAAGATAAAACCAATGCCGGTGCGCTTATTGCGTCATTGTCAAACCCTTGGGGCGAAACCGTATCTGCTAAAGAAGGCTCAACCGGTTATAAAGCGGTATGGGTGCGCGATTTTTACCAAGTAGCCATGGCATTTATGGCGCTCGGCGATACCGCCACCGCAAAAACAGCATTCGAATACCTTGAAAAAGTACAAGTAAACAGCAAAACACCGGGTAATAAAGGAGATACAGGCTGGTTTTTACAAAAAACACATGTAGATGGTGAGCTTGAATGGGTAGGTGTACAACTTGATCAAACCGCTATGCCTATTATGCTTGCTTGGAAGTTACATAAGGCCAATGTACTTAGCGACGAAGAGCTAAAAAGTTGGTACGGCAAAATGTTAAAACCAGCGGCTGATTTTTTAGTTGATGGCGGCCTTGCTAAAATTTTATGGAACGACACGCAAATTACACCACCGGCTACCCAACAAGAACGTTGGGAAGAGCAAGAAGGTTACTCGCCTTCGACTACTGCGGCAATAGTAGCTGGCCTTATTACAGCCAGTGATATTGCAACACTAAGTGGCGATGATAAAAACGCAAAGCGCTACTTAAGTACGGCTAGAAAGTACAACAACGATATTGAATCGCACATGTTTACCACTAAAGGCAACTTAAAAGGCGAAAATAGTGATGGTGAATACTTTATTCGCATAGGCCAAGATACCGATGCAAACTCAGACACTAAAATTAACGCTAATAATGGCCGTGAAGGGTTTAATAAAAAGCAAATTTTAGATGGCGGGTTTTTAGAGTTAGTACGCTATGGTGTACGTGGTGCAAATGATGAAAGCATTGTTAAAACACTACCTGAGTACGATGACGAAACGCTTGAAGATAACCTACAAGTTAAATACAGCTTTAGTTTTGACGATGGCAGCGGCACTTTTGCAGGCTACCGCCGCTACGGTAATGATGGCTACGGCGAAGATGAAGTTAAAGGCACAAACTATGCTGAGGGTGGCAGCAATACACCAGGCCAACGTGGTCGTGTATGGCCATTTTTTACAGGTGAACGTGGCCACTATGAAATAGCTGCAGCCAATGCAAACAACGCACTTGATGATGCAAAACAAGCACAAATTAAAAACAGCTATGTTAAAGGCTTAGAGCAATTTGCTAATAATGGCTTAATGCTACCAGAGCAAGTATGGGATGGCGTAGGTGTAAATAAAGCAGGTTACAAGCTAGGTGAGGGCACTAATTCAGCAACACCACTGGCATGGACACATGCTGAGTACGTTAAACTGGTACGTTCATTGAGTGATAAACAAGTATGGGATCATTACCCAGTTGTAGAGAAAGCATTAAAGTAG。

其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示：

MKKYNLITASLLTLGLTACGAQNTSTDNKNTAAQVKSAPGAPGVEPFWAYAGKTGIGTSYEQYQKGQYSDSAATGDVSKVWFSIAKGMITETMFGLIHQAQIKDMQFVVTGKDFTVTEADELDVTIDYLYKDAQGRPLSLAYKVTSTDKQGRFSLEKHIFTDPDGQTLFVRSVFNTELEGLKAYVVVNPYINNNGLGDFAKTTEQGLVAWEDDNYLSLQSATPFKAKTVGFTGESDGINALKTTQALNTHYTNTGEAAGNVSMLAELGEISANTTFDVALSFGKTQQQSIQQGEQSLAKGYQAVLDHYNGKGEALGWQDYLQSLKPLNTMVEQTADNGKLLYTSAMVLKAQEDKTNAGALIASLSNPWGETVSAKEGSTGYKAVWVRDFYQVAMAFMALGDTATAKTAFEYLEKVQVNSKTPGNKGDTGWFLQKTHVDGELEWVGVQLDQTAMPIMLAWKLHKANVLSDEELKSWYGKMLKPAADFLVDGGLAKILWNDTQITPPATQQERWEEQEGYSPSTTAAIVAGLITASDIATLSGDDKNAKRYLSTARKYNNDIESHMFTTKGNLKGENSDGEYFIRIGQDTDANSDTKINANNGREGFNKKQILDGGFLELVRYGVRGANDESIVKTLPEYDDETLEDNLQVKYSFSFDDGSGTFAGYRRYGNDGYGEDEVKGTNYAEGGSNTPGQRGRVWPFFTGERGHYEIAAANANNALDDAKQAQIKNSYVKGLEQFANNGLMLPEQVWDGVGVNKAGYKLGEGTNSATPLAWTHAEYVKLVRSLSDKQVWDHYPVVEKALK。

在低聚异麦芽糖生产中，针对不同生产目的，如对低聚异麦芽糖产品不同成分、不同浓度、不同纯度等的要求，往往需要选择具有不同转苷活性或水解活性的酶。而本发明中的基因通过控制反应时间，可以高效的满足几种低聚异麦芽糖的生成需要，非常有优势。

附图说明

图1为基因Glu525重组表达纯化的SDS-PAGE图谱。

图2为本发明温度对基因Glu525活性影响曲线图；

图3为本发明温度对基因Glu525稳定性影响曲线图；

图4为本发明pH对基因Glu525活性影响曲线图；

图5为本发明pH对基因Glu525稳定性影响曲线图；

图6为本发明基因Glu525制备低聚异麦芽糖产物液相分析图；

图7为本发明基因Glu525制备低聚异麦芽糖的含量变化图。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

Pseudoalteromonas carrageenovora ASY5,中文名称为食鹿角菜假交替单胞菌，分离自厦门红树林土壤腐叶样品，来源于中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)，保藏编号23819。

实施例1：可用于高效制备低聚异麦芽糖的基因Glu525基因的获得

将Pseudoalteromonas carrageenovora ASY5接种至人工海水培养基中，在25℃，180r/min的条件下，震荡培养至OD₆₀₀为1-1.5，取培养菌液1mL，利用东盛生物细菌基因组快速提取试剂盒(硅胶膜离心柱法)提取Pseudoalteromonas carrageenovora ASY5菌株基因组DNA。

上述人工海水培养基配置方法如下：

人工海水培养基：牛肉浸膏10g、胰蛋白胨10g、蒸馏水250mL、人工海水750mL(NaCl37.51g、KCl 1.03g、CaCl₂ 1.61g、MgCl₂·6H₂O 6.4g、NaHCO₃ 0.15g、MgSO₄·7H₂O 4.67g、蒸馏水1000mL)。牛肉浸膏和胰蛋白胨在蒸馏水中溶解后用NaOH调pH至7.8，加热煮沸10min，冷却后再次加NaOH调pH至7.3，然后和人工海水混合，121℃灭菌20min。固体培养基再添加20g琼脂。

实施例2：序列分析

利用NCBI的BLAST程序在GenBank数据库中进行核酸序列及氨基酸序列的同源性搜索，利用SMART数据库的信号肽预测工具SignalP4.0预测α-葡萄糖苷酶是否存在信号肽，利用ExPASy的protparam工具预测蛋白质的理化性质。

用上述生物学软件分析的结果显示，基因Glu525编码区长2412bp，核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。基因Glu525编码的α-葡萄糖苷酶共含803个氨基酸，其氨基酸序列如SEQID NO：2所示。用ExPASy的protparam工具进行分析，显示蛋白质Glu525的理论分子量约为87.88kDa，理论等电点为5.00。信号肽分析结果显示，其N端有1-21个氨基酸为信号肽序列。

实施例3：基因Glu525在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中的中的重组表达和纯化

以实施例1制得的基因组DNA为模板，进行PCR扩增，引物序列如下：

正向引物Glu525-F：

5’-CGCGGATCCCAAAACACAAGCACAGATAA-3’；SEQ ID NO：3；

反向引物Glu525-R：

5’-CCGGAATTCCTACTTTAATGCTTTCTCTA-3’；SEQ ID NO：4。

正向引物Glu525-F下划线标注的是限制性内切酶位点BamHI，反向引物Glu525-R下划线标注的是限制性内切酶EcoR I位点。

所用高保真DNA聚合酶PrimeSTAR HS购自中国大连TaKaRa生物公司，所用PCR反应试剂按照该公司提供的产品说明进行操作。

PCR反应系统为：

PCR条件为：95℃，5min；94℃，15s；55℃，15s，72℃，1min，30次循环，最后72℃，10min。

将PCR产物及pET-28a质粒用限制性内切酶EcoR I和BamHI双酶切，回收酶切后的产物片段。限制性内切酶EcoR I和BamHI购自中国大连TaKaRa生物公司，酶切用到的酶与底物反应的体系、温度和时间，均按照该公司提供的产品说明操作。将经过EcoR I和BamHI双酶切的PCR产物，与同样经过双酶切的pET-28a质粒载体，在T4 DNA连接酶的催化下进行连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α菌株，涂布于含有0.1mg/mL卡那霉素的LB固体培养基上，37℃倒置培养16h后，挑取阳性转化子，将阳性转化子接入含有0.1mg/mL卡那霉素的液体LB培养基中，37℃，180r/min，培养12h，用正向引物Glu525-F和反向引物Glu525-R进行菌液PCR验证。

接着将重组质粒pET-28a-Glu525转化大肠杆菌BL21(DE3)，涂布于含有0.1mg/mL卡那霉素的LB固体培养基上，37℃倒置培养16h后，挑取阳性转化子，将阳性转化子接入含有0.1mg/mL卡那霉素的液体LB培养基中，37℃，180r/min,培养12h，用正向引物Glu525-F和反向引物Glu525-R进行菌液PCR验证，结果得到大小约为2400bp的扩增产物，初步证明构建的重组质粒正确。将重组质粒送至厦门铂瑞生物科技有限公司进行测序，结果表明，在pET-28a的EcoR I和BamHI酶切位点插入SEQ ID NO：1所示的基因Glu525，且插入方向正确，所以进一步证明构建的重组质粒正确，将该重组质粒命名为pET-28a-Glu525。使用异丙基硫代半乳糖甘(IPTG)进行重组基因Glu525的诱导表达。加入异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)至终浓度0.05mmol/L，16℃诱导20h后将菌液收集至200mL的离心管中，6500rpm离心沉淀细菌细胞。将细菌细胞重新悬浮在20mL的溶解缓冲液(溶解缓冲液配方为：0.3mol/LNaCl，15mmol/L咪唑，50mmol/LNaH₂PO₄，pH8.0)中，超声波破碎处理至菌液成半透明(参数设置为300w，超声时间5s，间歇时间5s，总工作时间15min)，11000rpm离心20min，上清与预先用溶解缓冲液平衡的Ni-NTA Agarose混匀，4℃结合1小时，纯化过程按照纯化试剂盒(购自Qiagen公司)说明进行。纯化的蛋白经的SDS-PAGE电泳分析，其分子量约为83kDa，使用Bradford法测定蛋白浓度，得到浓度约为1.0mg/ml的重组酶，结果见图1。其中，泳道M为蛋白Marker，泳道1为纯化时的穿透液，泳道2为空载体pET-28a在E.coliBL21中的表达，泳道3为重组载体pET-28a-Glu525在E.coliBL21中的诱导表达，泳道4为经Ni-NTA纯化所得的目的蛋白Glu525(87.88kDa)。

实施例4：重组基因Glu525酶学性质分析

1.重组酶活力的测定：

将酶液用对硝基酚α-D-葡萄糖苷(pNPG)为底物测定酶活，总酶活反应体系500μL，其中100μLpNPG(浓度为1mmol/L)，200μL0.2mol/L磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液(浓度为50mmol/L，pH7.0)于40℃水浴中保温5min，加入100μL酶液，反应10min，取出放在冰上立即加入500μL1mol/L碳酸钠溶液终止反应，于405nm下测定吸光值。在上述条件下，每分钟水解生成1μmol对硝基苯酚所需的酶量为一个酶活力单位(U)。

2.温度对酶活性及稳定性的影响

在反应温度为25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃条件下反应后测定重组Glu525的酶活，以最高酶活为100％。测定重组Glu525的温度稳定性时，酶液在30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃下分别处理2h，在最适反应温度下测定剩余酶活，以未处理时的酶活为100％。最适温度测定结果见图2。如图2所示，Glu525在40℃时达到最大活力，表明Glu525的最适反应温度为40℃。温度稳定性结果见图3，如图3所示，该酶在30°-45℃下较稳定，在温浴2h后依旧有50％以上的酶活力保留，在40℃温浴2h，酶活力依旧有最初的62％。

3、pH值对酶活性及稳定性的影响

用不同pH的缓冲体系配制底物，在最适反应温度下测定酶活，以最高酶活100％。缓冲液体系分别为50mmol/L磷酸二氢钠-磷酸氢二钠(pH 4-8)、甘氨酸-NaOH(pH8-11)。pH稳定性的研究是通过将酶液与不同pH的缓冲液等比例混合后，并在4℃放置2h，然后测定剩余酶活力，以未处理时酶活力为100％。最适pH结果见图4。如图4所示，在pH7.0时重组基因Glu525的活力最高，表明Glu525的最适pH为7.0。pH稳定性结果如图5所示，基因Glu525在碱性(6.0-9.0)范围内相对稳定，4℃处理2h后仍能保持60％以上的酶活力。

4、金属离子和抑制剂对酶活性的影响

在酶液中分别添加终浓度为1mmol/L或10mmol/L的不同金属离子(Mg²⁺、Mn²⁺、Ba²⁺、Fe³⁺、Ca²⁺)，37℃放置1h后，测定酶的剩余活力，以未添加金属离子的酶活力为100％，研究金属离子对酶活性的影响。如表1所示，结果表明，金属离子Mn²⁺在浓度为1mmol/L和10mmol/L时都对Glu525有明显的促进作用，Fe³⁺在浓度为1mmol/时对酶活有轻微的促进作用，当浓度增加到10mmol/L反而对酶活产生了极大的抑制作用。Mg²⁺、Ca²⁺对Glu525都有轻微的促进作用。在酶液中分别添加终浓度为1mmol/L或10mmol/L抑制剂(EDTA、DTT、巯基乙醇、CTAB、Urea)37℃放置1h后，测定酶的剩余活力，以未添加抑制剂或去垢剂的酶活力为100％，研究抑制剂对酶活性的影响。结果如表1所示，Glu525对EDTA具有很好的抗性，CTAB对Glu525有极强的抑制作用。在浓度为10mM时，Glu525基本失活。

实施例5：基因Glu525制备低聚异麦芽糖

(1)用pH为7.0的磷酸钾缓冲液配制质量浓度为200g/L的麦芽糖溶液50mL装入250mL三角瓶中。重组Glu525的加酶量为15U/mL，封住瓶口，将三角瓶置于40℃水浴摇床中进行反应24h.取样测定各种低聚糖的含量，分析结果。产物成分分析采用高效液相色谱法。色谱条件：Prevail Carbohydrate色谱柱(250mm×4.6mm)，流动相为体积分数75％乙腈水溶液，柱温30℃，流量1mL/min，进样量10μL，蒸发温度90℃，蒸发气体流量2.0L/min。结果如图6，证明该酶可以用于制备低聚异麦芽糖。

(2)用pH为7.0的磷酸钾缓冲液配制质量浓度为200g/L的麦芽糖溶液50mL装入250mL三角瓶中。重组Glu525的加酶量为15U/mL，封住瓶口，将三角瓶置于40℃水浴摇床中进行反应24h。在反应不同反应时间用高效液相色谱仪定量分析反应液各组分,测定结果见图7。该酶在反应中先水解一部分麦芽糖生成葡萄糖；再将葡萄糖以α-1,6糖苷键转移到麦芽糖分子上,生成潘糖；随着反应时间延长,该酶再水解麦芽糖分子和潘糖分子上的α-1,4糖苷键生成葡萄糖和异麦芽糖；当葡萄糖以α-1,6糖苷键转移到其它异麦芽糖分子上时,形成

表1金属离子抑制剂对酶活性的影响表

异麦芽三糖等。可知潘糖含量先增加后减少,在反应4h时生成率达到最大值21.55％；异麦芽糖含量随反应时间延长而逐渐增加，在反应8h时达到24.53％。异麦芽三糖含量随反应时间延长而逐渐增加，反应20h生成率达到27.21％。反应6h时低聚糖的总生成率达到51.86％。因此,可以通过控制反应时间来使产物中相应的低聚异麦芽糖含量达到最高。

在低聚异麦芽糖生产中，针对不同生产目的，如对低聚异麦芽糖产品不同成分、不同浓度、不同纯度等的要求，往往需要选择具有不同转苷活性或水解活性的酶。而本发明中的酶可以高效的满足几种低聚异麦芽糖的生成需要，这也是非常有优势的。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

SEQUENCE LISTING

<110> 集美大学

<120> 基因Glu525的制备方法和用途

<130> JMDXL-19044-CNI

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 2412

<212> DNA

<213> Pseudoalteromonas carrageenovora ASY5

<400> 1

atgaaaaaat ataaccttat aactgcctca ctcttaacat taggcttaac tgcctgtggt 60

gcacaaaaca caagcacaga taataaaaat accgctgcac aggttaaatc agcacctggc 120

gcacctggtg tagagccatt ttgggcttat gcaggtaaaa cagggattgg cacgtcttac 180

gagcaatacc aaaaaggcca atacagtgat tcagctgcaa cgggcgatgt atctaaggtg 240

tggttttcaa ttgctaaagg catgatcacc gaaaccatgt ttgggcttat ccaccaagcg 300

cagattaaag acatgcagtt tgttgttaca ggtaaagact ttaccgtaac cgaagctgat 360

gaattagatg tcaccataga ttacttatac aaagatgcgc aagggcgccc actttcgctt 420

gcctacaaag taacaagcac tgataaacaa gggcgcttta gcctagaaaa acacatattt 480

accgacccag atgggcaaac attatttgtt cgcagtgtgt ttaacactga acttgaaggg 540

ttaaaagctt atgttgttgt aaacccttac ataaataata acggattagg tgactttgct 600

aaaacgacag agcaagggct tgtggcatgg gaagacgata actatttatc acttcaatca 660

gcaacccctt ttaaagctaa aacagtaggt tttacaggtg aaagcgatgg tattaatgca 720

cttaaaacaa ctcaagcgct aaacactcat tatacaaata ctggcgaagc tgcaggtaac 780

gtaagcatgt tggctgagct tggcgaaata agcgctaaca ccaccttcga tgtagcactt 840

agttttggta aaacacagca gcaaagtata caacaaggcg agcaaagctt agcaaaaggc 900

tatcaagcag tgcttgatca ctataacggt aaaggtgaag cgctcggctg gcaagattac 960

cttcaaagcc ttaaaccact taataccatg gttgagcaaa ccgccgataa cggaaagctt 1020

ttatacacca gtgccatggt tttaaaggca caagaagata aaaccaatgc cggtgcgctt 1080

attgcgtcat tgtcaaaccc ttggggcgaa accgtatctg ctaaagaagg ctcaaccggt 1140

tataaagcgg tatgggtgcg cgatttttac caagtagcca tggcatttat ggcgctcggc 1200

gataccgcca ccgcaaaaac agcattcgaa taccttgaaa aagtacaagt aaacagcaaa 1260

acaccgggta ataaaggaga tacaggctgg tttttacaaa aaacacatgt agatggtgag 1320

cttgaatggg taggtgtaca acttgatcaa accgctatgc ctattatgct tgcttggaag 1380

ttacataagg ccaatgtact tagcgacgaa gagctaaaaa gttggtacgg caaaatgtta 1440

aaaccagcgg ctgatttttt agttgatggc ggccttgcta aaattttatg gaacgacacg 1500

caaattacac caccggctac ccaacaagaa cgttgggaag agcaagaagg ttactcgcct 1560

tcgactactg cggcaatagt agctggcctt attacagcca gtgatattgc aacactaagt 1620

ggcgatgata aaaacgcaaa gcgctactta agtacggcta gaaagtacaa caacgatatt 1680

gaatcgcaca tgtttaccac taaaggcaac ttaaaaggcg aaaatagtga tggtgaatac 1740

tttattcgca taggccaaga taccgatgca aactcagaca ctaaaattaa cgctaataat 1800

ggccgtgaag ggtttaataa aaagcaaatt ttagatggcg ggtttttaga gttagtacgc 1860

tatggtgtac gtggtgcaaa tgatgaaagc attgttaaaa cactacctga gtacgatgac 1920

gaaacgcttg aagataacct acaagttaaa tacagcttta gttttgacga tggcagcggc 1980

acttttgcag gctaccgccg ctacggtaat gatggctacg gcgaagatga agttaaaggc 2040

acaaactatg ctgagggtgg cagcaataca ccaggccaac gtggtcgtgt atggccattt 2100

tttacaggtg aacgtggcca ctatgaaata gctgcagcca atgcaaacaa cgcacttgat 2160

gatgcaaaac aagcacaaat taaaaacagc tatgttaaag gcttagagca atttgctaat 2220

aatggcttaa tgctaccaga gcaagtatgg gatggcgtag gtgtaaataa agcaggttac 2280

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gcattaaagt ag 2412

<210> 2

<211> 803

<212> PRT

<213> Pseudoalteromonas carrageenovora ASY5

<400> 2

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Claims (7)

1.基因Glu525的制备方法，其特征在于，从海水中制备得到。

2.如权利要求1所述制备方法，其特征在于，将Pseudoalteromonas carrageenovoraASY5接种至人工海水培养基中，培养后提取菌株基因组DNA；再以该菌株基因组DNA为模板，SEQ ID NO:3和4为上下游引物，进行扩增得到所述基因Glu525。

3.如权利要2所述制备方法，其特征在于，所述扩增的程序为：95℃，5min；94℃，15s；55℃，15s，72℃，1min，30次循环，最后72℃，10min。

4.如权利要2所述制备方法，其特征在于，所述人工海水培养基的配置方法为，将牛肉浸膏和胰蛋白胨在蒸馏水中溶解后用NaOH调pH至7.8，加热煮沸10min，冷却后再次加NaOH调pH至7.3，然后和人工海水混合，灭菌即可；其中牛肉浸膏、胰蛋白胨、蒸馏水、人工海水的用量比例为：10g：10g：250mL：750mL；

所述人工海水为NaCl、KCl、CaCl₂、MgCl₂·6H₂O、NaHCO₃、MgSO₄·7H₂O和蒸馏水组成，其中NaCl、KCl、CaCl₂、MgCl₂·6H₂O、NaHCO₃、MgSO₄·7H₂O和蒸馏水的用量比例为：37.51g：1.03g：1.61g：6.4g：0.15g：4.67g：1000mL。

5.基因Glu525和/或含有基因Glu525的载体用于制备低聚异麦芽糖的用途。

6.如权利要求5所述的用途，其特征在于，在制备低聚异麦芽糖时，添加含有基因Glu525和/或含有基因Glu525的载体，通过控制反应时间，得到不同的低聚异麦芽糖。

7.如权利要求5所述的用途，其特征在于，所述反应时间为2-4h时，得到的主要是潘糖；当反应时间为5-8h时，得到的主要是异麦芽糖；当反应时间为16-22h时，得到的主要是异麦芽三糖。

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