CN110551664B

CN110551664B - 一种根瘤促生菌微杆菌属x-18及其应用

Info

Publication number: CN110551664B
Application number: CN201910938194.2A
Authority: CN
Inventors: 庄家尧; 刘超; 王阳阳
Original assignee: Nanjing Forestry University
Current assignee: Nanjing Forestry University
Priority date: 2019-09-29
Filing date: 2019-09-29
Publication date: 2020-11-10
Anticipated expiration: 2039-09-29
Also published as: CN110551664A; WO2021057441A1

Abstract

本发明公开了一种根瘤促生菌微杆菌属X‑18及其应用，属于微生物技术领域。所述根瘤促生菌的分类命名为微杆菌属(Microbacterium sp.)X‑18，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期：2019年4月8日，保藏编号CCTCC No：M2019236，保藏地址：中国武汉武汉大学。本发明的微杆菌属X‑18应用于豆科植物刺槐中，能够促进刺槐有效固氮，提供刺槐生长所需的氮素，使根瘤促生菌与植物共生固氮能力得到明显发挥，从而促进刺槐植株的生长发育，发展前景可期。

Description

一种根瘤促生菌微杆菌属X-18及其应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种根瘤促生菌微杆菌属(Microbacterium sp.)X-18及其应用。

背景技术

客土喷播技术是将土壤生长基质材料的混合物和植物种子均匀、高压喷播在岩土坡面上的绿化技术。该技术的生长基质材料混合物中配制有筛选好的土壤菌，主要是针对岩石等硬质边坡以及为植物能够在硬质边坡营造适宜生长环境研发的一种绿化技术。所筛选的土壤菌作为该技术生长基质材料的重要成分之一发挥着两个作用：一是能对土壤生态机制变化和环境胁迫做出反应，加速岩体的侵蚀，有效提高岩壁与喷播基质界面融合性；二是促进植物的生长发育，保证植物在胁迫环境中碳素、氮素等营养的供应。然而在实际工程中，这一技术的利用受到很多的限制，一方面是喷播基质难以长久在岩面维持，另一方面针对喷播树种能够起到促生作用的土壤微生物的发现很少。

土壤微生物在生命活动中将空气中的惰性氮素转化为植物可直接吸收的离子态氮素，保证植物的氮素营养；同时，经具有促生作用的微生物处理过的植物气孔导度升高加快植物细胞的气体交换，且胞间CO₂浓度增加，使光合作用所需的CO₂充备，进而更提高了植物的光合速率，促进植物光合作用；此外，微生物在其生命活动过程中可分解土壤中难容的矿物降解无机和有机污染物。这些都保证了植物在微环境中所需各营养成分的供应以及植物各生命活动的正常进行。明显的，有针对性的筛选特定植物的促生菌是客土喷播绿化技术能够广泛应用的关键之一。目前，国内针对不同植物，筛选适宜的根瘤促生菌株鲜有报道。

发明内容

发明目的：针对现有技术存在的问题，本发明的目的是提供一种根瘤促生菌微杆菌属X-18，为护坡植物促生菌菌库的建立提供菌种支持。本发明的另一目的是提供上述微杆菌属X-18在促进刺槐结瘤固氮中的应用。能够提供高水平的氮素，促进刺槐结瘤固氮。本发明的再一目的是提供上述微杆菌属X-18在促进刺槐生长中的应用。能有效促进地径、苗高与叶面积的增长，长势良好。

技术方案：为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：

一种根瘤促生菌，其分类命名为微杆菌属(Microbacterium sp.)X-18，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期：2019年4月8日，保藏编号CCTCC No：M2019236，保藏地址：中国武汉武汉大学。

微杆菌属X-18在促进刺槐结瘤固氮中的应用。

所述的应用，将微杆菌属X-18的发酵菌液稀释后直接在刺槐幼苗的根际土壤浇施。

所述的应用，包括以下步骤：

1)从斜面上取微杆菌属X-18，在营养琼脂固体培养基上，35℃活化24h；

2)将活化后的菌株用接种环挑取一环菌泥加入到LB液体培养基中，35℃，200r/min恒温震荡24h制备种子液；

3)按3％的接种量取种子液接种于液体培养基，35℃，200r/min摇床振荡培养36h，得到发酵菌液；

4)使用前，用无菌水将步骤3)得到的发酵菌液稀释后，添加到栽植好的刺槐幼苗盆栽中，60mL/盆。

步骤3)中，液体培养基为蛋白胨10g；酵母粉3g；氯化钠5g；无菌水1000mL；pH 5.6。

微杆菌属X-18在促进刺槐生长中的应用。

所述的应用，包括以下步骤：

4)用无菌水将步骤3)得到的发酵菌液稀释后，添加到栽植好的刺槐幼苗盆栽中，60mL/盆。

步骤3)中，液体培养基为蛋白胨10g；酵母粉3g；氯化钠5g；无菌水1000mL；pH5.6。

有益效果：与现有技术相比，本发明筛选出的根瘤促生菌微杆菌属X-18，能够促进刺槐有效固氮，提供刺槐生长所需的氮素，使根瘤促生菌与植物共生固氮能力得到明显发挥，发展前景可期。

附图说明

图1是营养琼脂固体培养基上的微杆菌属X-18菌落图。

具体实施方式

下面结合具体实施例进一步说明本发明，但这些实例并不用来限制本发明。下述实施例中所使用的方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1菌株的获得和鉴定

在岳阳市岳阳大道两侧坡地表面5cm下根际土壤中采集土样，采用稀释涂布平板法，在35℃培养箱中，以营养琼脂固体培养基(NA培养基：蛋白胨10g；牛肉粉3g；氯化钠5g；琼脂15g；无菌水1000mL)培养2～3d，肉眼观察挑取不同菌落，反复划线纯化得到不同种单菌落。

选单一菌落做成平板，送上海金域医学检验所测序，得16S rDNA基因序列，见SEQID NO.1所示。将所测16S rDNA基因序列与GenBank数据库中的序列进行BLAST比对。结果表明，该菌株与Microbacterium chocolatum的相似度为99.75％。结合形态特征及16S rDNA基因序列分析，鉴定为微杆菌属(Microbacterium sp.)X-18。

该微杆菌属X-18的主要生物学特征为：在营养琼脂培养基(NA固体培养基)35℃条件下培养24h，如图1所示；菌落特征：棕色，湿润光滑，圆形，革兰氏染色为蓝紫色阳性，形态为短杆状；葡萄糖发酵实验：-、无气泡；乳糖发酵实验：-无气泡；淀粉水解实验：-；吲哚试验实验：-；甲基红试验：-；V.P.实验：-；柠檬酸盐实验：-；硫化氢实验：-。

实施例2菌株促进刺槐结瘤固氮的能力

1、发酵液的制备：1)从斜面上取微杆菌属X-18，在营养琼脂固体培养基上，35℃活化24h；2)将活化后的菌株用接种环挑取一环菌泥加入到20mL LB液体培养基中，35℃，200r/min恒温震荡24h制备种子液；3)按3％的接种量取种子液接种于液体培养基，35℃，200r/min摇床振荡培养至OD₅₆₀为0.8-1.2，得到发酵菌液；4)使用前，用无菌水将步骤3)得到的发酵菌液稀释100倍，直接在栽植好的刺槐幼苗盆栽中喷施。

2、盆栽实验：按60mL/盆，取稀释后的发酵菌液添加到栽植好的刺槐幼苗周围(实际种植期是4个月，第一个月为间苗期，未施菌，间苗期后施菌开始计算)。并设置无菌水为空白对照组(CK)，经过一个季度观测分析刺槐的结瘤固氮能力。

对盆栽进行观测统计，于第8周开始将植株小心挖出，简单清理刺槐根部土壤并记录根瘤数量后复栽回花盆中；于第16周进行最后一次根瘤统计，记录根瘤个数和重量。结果如表1所示。

表1刺槐的根瘤数、根瘤重、根干重结果

从表1可知，与空白组对照相比，加入微杆菌属X-18后刺槐的结瘤数量和结瘤重量有明显增加，其处理的刺槐根干重也有显著增加，相对空白组平均增长量为121.74％。可见该菌株能够促进刺槐结瘤固氮，促加速其根部生长发育，是很有前景的刺槐促生菌菌株。

3、促生实验：按60mL/盆，取稀释后的发酵菌液添加到栽植好的刺槐幼苗周围。一个月之后对刺槐幼苗进行间苗，保证每盆幼苗数量的整齐度。从第一次间苗之后，每隔30d使用游标卡尺测量刺槐幼苗的地径；使用皮尺测量幼苗的苗高；于终止日，从每盆植株选取上中下位叶片共计10片采集，利用根系扫描仪测量叶面积。结果如表2所示。

表2刺槐幼苗一个季度生长指标

注：P＜0.05。

地径用来表示树木的规格，长势好的植物一般地径都比较大。由表2可知，加菌处理组的地径相对对照组增加了22.32％。

苗高是植物形态学最基本的指标之一，可直观反映植物的生长状况，一般情况下，长势好的植物，其苗高都比较高。由表3可知，加菌处理组的苗高相对对照组增加了27.87％。

叶面积是与产量关系最密切的指标之一，植株的增产可由叶面积直观反映，一般情况下，适当大小的叶面积，既可以充分利用光照条件，又不影响光合作用。由表2可知，加菌处理组的叶面积相对对照组增加了17.87％。

序列表

<110> 南京林业大学

<120> 一种根瘤促生菌微杆菌属X-18及其应用

<130> 1

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1040

<212> DNA

<213> Microbacterium sp.

<400> 1

tagcaatggc ggcgtgctta ccatgcagtc gaacggtgaa agagagcttg ctctctggat 60

cagtggcgaa cgggtgagta acacgtgagc aacctgcccc ggactctggg ataacagctg 120

gaaacagctg ctaataccgg atacgagctg cgaaggcatc ttcggcagct ggaaagaatt 180

tcggtccggg atgggctcgc ggcctatcag ctagttggtg aggtaatggc tcaccaaggc 240

gtcgacgggt agccggcctg agagggtgac cggccacact gggactgaga cacggcccag 300

actcctacgg gaggcagcag tggggaatat tgcacaatgg gcgaaagcct gatgcagcaa 360

cgccgcgtga gggatgacgg ccttcgggtt gtaaacctct tttagcaggg aagaagcgaa 420

agtgacggta cctgcagaaa aagcgccggc taactacgtg ccagcagccg cggtaatacg 480

tagggcgcaa gcgttatccg gaattattgg gcgtaaagag ctcgtaggcg gtttgtcgcg 540

tctgctgtga aaacccgagg ctcaacctcg ggcctgcagt gggtacgggc agactagagt 600

gcggtagggg agattggaat tcctggtgta gcggtggaat gcgcagatat caggaggaac 660

accgatggcg aaggcagatc tctgggccgt aactgacgct gaggagcgaa agggtgggga 720

gcaaacaggc ttagataccc tggtagtcca ccccgtaaac gttggaacta gttgtggggt 780

ccattccacg gattccgtga cgcagctaac gcattaagtt ccccgcctgg ggagtacggc 840

cgcaggctaa actcaaggaa ttgacgggga cccgcacagc ggcggagcat gcggattaat 900

tcgatgcaac gcgaagacct taccaaggct tgacatatac gagaccgggc cagaatgtca 960

actctttgga cacctcgtaa caggtgtgca tgttgtcgtc agctcgtgtc gtgagaatgt 1020

tggttaagtt cccgcaacga 1040

Claims

1.一种根瘤促生菌，其分类命名为微杆菌属（Microbacteriumsp.）X-18，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期：2019年4月8日，保藏编号CCTCC No:M 2019236，保藏地址：中国武汉武汉大学。

2.权利要求1所述的微杆菌属X-18在促进刺槐结瘤固氮中的应用。

3.权利要求2所述的应用，其特征在于，将微杆菌属X-18的发酵菌液稀释后直接在刺槐幼苗的根际土壤浇施。

4.权利要求3所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：

1）从斜面上取微杆菌属X-18，在营养琼脂固体培养基上，35℃活化24h；

2）将活化后的菌株用接种环挑取一环菌泥加入到LB液体培养基中，35℃，200r/min恒温震荡24h制备种子液；

3）按3%的接种量取种子液接种于液体培养基，35℃，200r/min摇床振荡培养36h，得到发酵菌液；

4）使用前，用无菌水将步骤3）得到的发酵菌液稀释后，添加到栽植好的刺槐幼苗盆栽中，60mL/盆。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，步骤3）中，液体培养基为蛋白胨10g；酵母粉3g；氯化钠5g；无菌水1000mL；pH 5.6。

6.权利要求1所述的微杆菌属X-18在促进刺槐生长中的应用。

7.权利要求6所述的应用，其特征在于，将微杆菌属X-18的发酵菌液稀释后直接在刺槐幼苗的根际土壤浇施。

8.权利要求7所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：

4）用无菌水将步骤3）得到的发酵菌液稀释后，添加到栽植好的刺槐幼苗盆栽中，60mL/盆。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，步骤3）中，液体培养基为蛋白胨10g；酵母粉3g；氯化钠5g；无菌水1000mL；pH 5.6。