CN110547416B - 包含黑萝卜乳酸菌发酵产物的肝功能改善用组合物及黑萝卜乳酸菌发酵产物的制造方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供包含黑萝卜乳酸菌发酵产物的肝功能改善用组合物及黑萝卜乳酸菌发酵产物的制造方法。肝功能改善用组合物包含黑萝卜乳酸菌发酵产物的肝功能改善用组合物，上述组合物包含乳酸杆菌属(Lactobacillus spp.)乳酸菌的黑萝卜发酵产物。

Description

包含黑萝卜乳酸菌发酵产物的肝功能改善用组合物及黑萝卜 乳酸菌发酵产物的制造方法
技术领域
本发明要求基于2018年5月31日的韩国专利申请第10-2018-0062300号的优先权权益，包括该韩国专利申请文献中公开的所有内容作为本说明书的一部分。
本发明涉及包含黑萝卜乳酸菌发酵产物的肝功能改善用组合物，上述组合物是包含乳酸杆菌属(Lactobacillus spp.)乳酸菌的黑萝卜发酵产物的肝功能改善用组合物。
背景技术
肝是将在小肠吸收的养分等合成为代谢物质或者发挥将有毒物质变更为用于分解或排出为对人体无害的物质的成分的作用而排毒作用的重要的脏器之一。尤其是，肝发挥乳化脂肪而生成胆汁的作用，以便在小肠容易吸收脂肪，并且还发挥将吸收的脂肪成分再次合成为脂肪的作用，所以在代谢(Metabolism)方面起到最重要的作用。
在肝出现异常而导致脂肪合成以及代谢不平衡的情况下，肝细胞内堆积脂肪组织，不仅导致脂肪肝、肝硬化，还有可能变成作为代谢综合症的一种的肥胖、2型糖尿病等的发病原因。
另一方面，活性氧类(Reactive oxygen species，ROS)是化学反应性较高的分子，一般情况下，由于分解该活性氧类的分解酶，变为没有毒性后消失，但是，一部分变形为羟基(Hydroxyl radical)。活性氧类在氧的正常的代谢过程中生成，从而对细胞信号和稳态起到重要的作用，但是，包含未配对电子的羟基的反应性非常大，所以具有毒性非常强的特征。
尤其是，当由于紫外线或老化等导致的环境压力活性氧类的浓度激增而非正常地过量存在时，无法正常分解，变形为大量的自由基，作用于蛋白质、脂质、DNA等，从而带来氧化损伤。这样的损伤进一步促进肝细胞脂肪堆积以及细胞纤维化，从而进一步恶化脂肪肝或肝硬化，从这一方面看，当暴露在外部刺激环境的时间变长、随着老化人体的活性氧的分解功能下降时，进一步加速肝损伤导致的健康恶化。
另一方面，黑萝卜被称为黑色萝卜或者黑颜色萝卜(Black Radish，OrientalRadish)等，是做为十字花科的根菜的萝卜的一种，学名为Raphanus sativusL.var.niger。表面呈黑色，但是内部具有白色的心，具有抗高血脂、抗炎症、抗氧化、去除毒素等各种生理活性。
最近，得到了黑萝卜具有肝功能改善效果的研究结果，如上所述，随着由于刺激的外部环境和自然的老化现象，引发肝功能障碍的可能性逐渐提高，积极地进行着利用黑萝卜可以以各种方式摄入的健康功能食品的开发。
但是，与十字花科的其它的植物相同地，蔬菜中包含的葡糖异硫氰酸盐(Glucosinolate)随着黑萝卜组织受损，被米罗辛酶(Mirosinase)所分解而形成异硫氰酸酯(Isothiocyanate)，由此显示出辣味，尤其是，与其它的萝卜种类相比，该辣味特别强，所以存在不容易摄入的问题。
由此，虽然如上所述具有优秀的肝功能改善效果，但是无法实现利用黑萝卜的健康功能改善食品的开发的多样化，被限定为仅开发成腌萝卜等通过外部佐料覆盖辣味的形式。并且，包含在黑萝卜中的具有肝功能改善效果的有效成分无法简单地与表现辣味的成分分离，黑萝卜提取物也表现出辣味，所以以提取物的方式摄入也存在问题。
因此，对于实现黑萝卜的肝功能改善效果最大化的同时消费者容易摄入的新技术的需求在增加。
发明内容
要解决的技术问题
本发明的目的在于解决如上所述的现有技术中的问题和从以前开始要求的技术问题。
本发明的目的在于提供肝功能改善用组合物，其比黑萝卜提取物提高了功效，感官效果比黑萝卜至黑萝卜提取物得到了改善，从而消费者的摄入变为容易，并且包含黑萝卜乳酸菌发酵产物。
而且，目的在于提供肝功能改善用组合物，进一步提高了黑萝卜的肝功能改善效果，并且包含黑萝卜具有的抗氧化功效也出色，从而具有肝功能改善和抗氧化功效的黑萝卜乳酸菌发酵产物。
本发明的目的在于提供包含黑萝卜乳酸菌发酵产物的健康食品。
并且，本发明的目的在于提供制造黑萝卜乳酸菌发酵产物的方法。
解决课题的手段
本发明中使用的黑萝卜利用了以济州岛为原产地的济州岛产黑萝卜。
因此，用于实现上述目的的根据本发明的包含黑萝卜乳酸菌发酵产物的肝功能改善用组合物，上述组合物包含乳酸杆菌属(Lactobacillus spp.)乳酸菌的黑萝卜发酵产物。
上述乳酸杆菌属乳酸菌可以是选自由植物乳酸杆菌(Lactobacillusplantarum)、干酪乳酸杆菌(Lactobacillus casei)、瑞士乳酸杆菌(Lactobacillushelveticus)以及罗伊氏乳酸杆菌(Lactobacillus reuteri)构成的群的一种以上。
上述乳酸杆菌属乳酸菌可以是植物乳酸杆菌(Lactobacillus plantarum)。
特征在于上述组合物可以是抑制肝组织的脂肪球形成而改善肝功能的肝功能改善用组合物。
本发明的肝功能改善用组合物中包含的黑萝卜发酵产物可以以50至1500ug/ml(微克/毫升)的浓度包含。
在本发明中，上述肝功能改善用组合物可以是药学性组合物或者食品组合物。
本发明还包括包含根据本发明的肝功能改善用组合物的健康食品。
另一方面，根据本发明的黑萝卜乳酸菌发酵产物的制造方法是制造在黑萝卜(黑色萝卜)接种乳酸杆菌属(Lactobacillus spp.)乳酸菌后发酵的黑萝卜乳酸菌发酵产物的方法，包括：捣碎黑萝卜的捣碎过程；在捣碎的黑萝卜上接种乳酸杆菌属乳酸菌后发酵的发酵过程；以及将发酵后的黑萝卜杀菌后粉末化的粉末化过程。
上述捣碎过程还可以包括在捣碎的黑萝卜中混合净化水而杀菌的杀菌过程，上述杀菌过程可以在50至150℃的温度下进行，上述发酵过程可以在杀菌的捣碎的黑萝卜以5×102至5×1010CFU/100g接种乳酸杆菌属乳酸菌。
上述发酵过程可以是在20至50℃的温度下发酵12至120小时的工序，上述粉末化过程可以是将发酵后的黑萝卜冻结干燥后粉末化的工序。
发明效果
本发明的组合物具有作为一个肝损伤抑制指标的肝细胞中的脂肪球形成抑制功效，所以有效地改善肝功能。
本发明的组合物提高了具有肝功能改善功效的黑萝卜的对肝功能改善有效的成分的吸收力，从而具有进一步提高的肝功能改善效果。
进一步地，本发明的组合物具有比黑萝卜提取物或黑萝卜营养源更出色的肝功能改善效果的效果。
并且，本发明的组合物减弱黑萝卜提取物的辣味而提高了感官效果，从而具有消费者容易摄入的效果。
本发明的组合物具有肝损伤抑制效果的同时具有出色的抗氧化效果的效果。
附图说明
图1是示出各试料的细胞生存率的曲线。
图2是示出各试料的ALT数值的曲线。
图3是示出各试料的AST数值的曲线。
具体实施方式
下面，更加详细地说明各构成，但是，这些说明只是一个示例，本发明的保护范围并不限定于下面的内容。
肝发挥将在小肠分解吸收的脂肪分解成分再次合成为脂肪或者将吸收的碳水化合物的一部分变形为脂肪后储存的作用，并且发挥分解从外部吸收的毒素或者将在人体中产生的氮废物变形为对人体无害的元素成分的作用，所以是在物质代谢和解毒中非常重要的器官。
饮酒过量、过食或者频繁饮酒不利于肝，损害肝，随着反复伤肝，肝的功能进一步恶化时，无法顺利地实现物质代谢或解毒作用，所以加重肝的负担，出现加速肝的损伤的问题。
与此同时，被认为老化原因的活性氧作用于蛋白质、脂质以及细胞的DNA等，引发氧化损伤，当活性氧作用于肝细胞从而引起氧化损伤时，进一步加快肝损伤。
尤其是，在老化中的成人，由于自然的老化，很容易引发肝细胞的损伤导致的肝功能恶化，在危害肝功能的饮酒过量、过食或者频繁饮酒等导致的氧化损伤引发肝细胞的损伤时，肝损伤速度非常快，引发例如脂肪肝或肝硬化等肝功能异常导致的各种疾病的可能性增加。
本发明利用被认为对肝功能改善有效的黑萝卜，并且发现在发酵黑萝卜时，尤其是，利用乳酸菌的发酵产物具有肝功能改善以及肝损伤抑制效果，而且具有抗氧化效果，从而具有更加出色的肝损伤抑制效果，提高了感官效果，从而完成了本发明。
具体地，根据本发明的包含黑萝卜乳酸菌发酵产物的肝功能改善用组合物包含乳酸杆菌属(Lactobacillus spp.)乳酸菌的黑萝卜发酵产物。
如通常的公知常识，发酵是指利用微生物或者菌，分解有机物的过程，在食品领域，利用发酵食物或提取物的发酵食品或发酵产物。
发酵是分解有机物的过程，所以包括将巨大分子拆分成微细分子的过程，所以可以预测到动物或人体中的吸收性会得到提高，但是，与蛋白质或糖类等时高分子链断裂而形成更小尺寸的聚氨基酸或者二糖类等不同，黑萝卜乳酸菌发酵提取物具有黑萝卜的肝功能改善效果的同时具有防止氧化老化的抗氧化效果和肝功能抑制效果，所以带来比黑萝卜或黑萝卜提取物提高的效果的同时带来了抗氧化效果带来的增效效应，从而具有更加有效的肝功能改善效果。
具体地，上述乳酸杆菌属乳酸菌可以是选自由植物乳酸杆菌(Lactobacillusplantarum)、干酪乳酸杆菌(Lactobacillus casei)、瑞士乳酸杆菌(Lactobacillushelveticus)以及罗伊氏乳酸杆菌(Lactobacillus reuteri)构成的群的一种以上，更加详细地，可以是植物乳酸杆菌(Lactobacillus plantarum)。
优选地，植物乳酸杆菌(Lactobacillus plantarum)还具有出色的抗氧化功效，从而发现与其它的乳酸菌相比，尤其是对于肝功能改善的增效效应更加出色。
另一方面，在本发明中，肝功能改善效果可以是通过减少肝细胞炎症或者抑制肝组织的脂肪球形成来改善肝功能，优选地，可以是通过抑制脂肪球形成来改善肝功能。
包含在本发明的肝功能改善用组合物中的黑萝卜发酵产物可以以50至1500ug/ml的浓度包含。优选地，可以是75至1400ug/ml的浓度，更加优选地，可以是90至1300ug/ml，最优选地，可以是550至1200ug/ml。
当以比上述浓度更低的含量添加时，L.plantarum(植物乳酸杆菌)发酵产物的AST抑制效果不大，当超过上述含量添加时，存在有可能引发细胞毒性的问题。尤其是，L.plantrum发酵产物在最优选的范围内具有显著的AST抑制效果，其肝功能改善功效比其它乳酸菌菌株的发酵产物更加优秀。
本发明的肝功能改善用组合物可以是药学性组合物或者食品组合物，更加详细地，可以以包含该组合物的健康食品的方式提供，具体的方式有营养剂、健康汁、健康粉、生食组合物等健康食品。
另一方面，根据本发明的制造在黑萝卜(黑色萝卜)接种乳酸杆菌属(Lactobacillus spp.)乳酸菌后发酵的黑萝卜乳酸菌发酵产物的方法包括将黑萝卜捣碎的捣碎过程、在捣碎的黑萝卜接种乳酸杆菌属乳酸菌后发酵的发酵过程以及将发酵的黑萝卜杀菌后粉末化的粉末化过程。
上述捣碎过程可以是对洗涤后的黑萝卜进行杀菌处理后进行捣碎，具体地，用于进行杀菌处理的温度可以是在70至120℃的温度下热处理5至25分钟。优选地，可以是在80至110℃进行热处理，最优选地，可以是在90至100℃的温度进行热处理。
当在比上述温度更低的温度下进行热处理时，有可能无法完全去除细菌，当在比上述温度更高的温度下进行热处理时，有可能出现用于改善黑萝卜的肝功能的有效成分从黑萝卜流失的问题。
上述捣碎过程还可以包括在捣碎的黑萝卜中混合净化水而杀菌的杀菌过程，具体地，可以在捣碎的黑萝卜中以1:0.5至3重量比添加净化水后，在50至150℃下加压灭菌5至60分钟。
优选地，在上述杀菌过程中以1:0.7至2重量比向捣碎的黑萝卜中添加净化水，更加优选地，以1:0.85至1.5重量比向捣碎的黑萝卜添加净化水。净化水的添加量超过上述比例时，在杀菌过程之后进行的发酵过程中每1LOT投入的原物的量减少，从而存在无法顺利地进行发酵工序的问题，当净化水的添加量少于上述比例时，在之后的发酵过程中存在因流动性不足而无法顺利地进行发酵工序的问题。
优选地，上述杀菌过程可以在70至140℃下进行灭菌，最优选地，在90至130℃的温度下进行灭菌。当在比上述温度更低的温度下进行热处理时，降低灭菌效果，在更高的温度进行热处理时，黑萝卜组织受损，从而有可能不适合通过乳酸菌进行发酵。
上述发酵过程可以是在杀菌的捣碎的黑萝卜以5×102至5×1010CFU/100g接种乳酸杆菌属乳酸菌。优选地，可以以5×105至5×109CFU/100g接种，最优选地，可以以5×106至5×108CFU/100g接种。
当接种低于上述时，不能充分地发酵，所以难以制造出具有比黑萝卜或黑萝卜提取物有意义程度的肝损伤抑制效果和抗氧化效果的发酵产物，当接种超过上述时，存在显著降低肝损伤抑制效果的问题。
上述发酵过程可以是在20至50℃的温度下发酵12至120小时。
优选地，可以在25至45℃温度下发酵，最优选地，在32至40℃的温度下发酵。当在比该温度更低的温度下发酵时，有可能不发生发酵本身，当在比该温度更高的温度发酵时，由于是比用于乳酸菌发酵的最佳温度更高的条件，所以有可能不发酵。
优选地，发酵时间可以是在上述温度条件下发酵24至100小时，最优选地，可以是发酵30至72小时。
当发酵比上述时间更短的时间时，无法充分地形成抗氧化有效成分，乳酸菌发酵产物不会表现出比黑萝卜或黑萝卜提取物更加有意义程度的优秀的肝功能改善效果，当发酵比上述时间更长的时间时，由于过度发酵，从而出现有效成分和黑萝卜成分的分解，从而存在显著降低肝功能改善效果的问题。
本发明中使用的菌株是在韩国微生物保藏中心(KCCM)通过微生物购买申请自由购买的菌株。
下面，通过实施例详细说明本发明。需要说明的是，实施例只是用于示例性示出本发明的，不是用于通过其内容来限定本发明的内容。
黑萝卜营养源的制造
将济州岛产黑萝卜用净化水洗涤后，在95℃进行15分钟的杀菌，之后捣碎，将捣碎的黑萝卜与净化水按照1:1的重量比混合，之后在121℃加压灭菌15分钟。
黑萝卜乳酸菌发酵产物的制造
1)乳酸菌购买
从韩国微生物保藏中心(Korea Culture Center of Microorganisms，KCCM)购买植物乳酸杆菌(Lactobacillus plantarum，KCCM 12116)、干酪乳酸杆菌(Lactobacilluscasei，KCCM 12452)、瑞士乳酸杆菌(Lactobacillus helveticus，KCCM 40989)以及罗伊氏乳酸杆菌(Lactobacillus reuteri，KCCM 40717)用于实验。
2)种菌培养
将购买的菌株在斜面培养基和液体培养基中传代培养后用于实验。具体地，将购买的菌株接种于斜面培养基，在恒温箱中在37℃下培养24小时后，一旦形成菌落，则接种于液体培养基，在恒温箱中在37℃下培养48小时，从而制造出种菌培养液。种菌培养中使用了MRS培养基(Difco公司、美国)。
3)黑萝卜乳酸菌发酵产物的制造
将济州岛产黑萝卜用净化水洗涤后，在95℃进行15分钟的杀菌，之后捣碎，将捣碎的黑萝卜与净化水按照1:1的重量比混合，之后在121℃加压灭菌15分钟后冷却到常温。
之后将在上述2)中事先培养的种菌培养液以5×108CFU/100g接种在杀菌的捣碎黑萝卜混合物中。在37℃恒温箱中振荡培养48小时，从而进行了液体发酵。在结束发酵后，在95℃下杀菌15分钟后，将发酵产物冻结干燥进行粉末化。
黑萝卜提取物制造
将济州岛产黑萝卜用净化水洗涤后，添加15倍量的净化水，在95℃下进行了4小时的一次提取。
向洗涤后的黑萝卜添加30％、50％、70％(百分比浓度)的混合酒精，以此代替15倍量的净化水，在70℃下进行了4小时的一次提取。
在一次提取后，进行过滤，向剩下的残留物添加10倍量的与一次提取相同的提取溶剂，在相同的温度下进行了2小时的二次提取，之后进行过滤。将一次提取物和二次提取物混合浓缩，之后冻结干燥并进行了粉末化。
实验例1-抗氧化功效评价
在本实验中，为了评价黑萝卜乳酸菌发酵产物的抗氧化功效，测量了ABTS自由基阳离子去除活性、总多酚以及总黄酮化合物含量。
<1-1>黑萝卜乳酸菌发酵产物预处理
为了评价粉末状态的试料的抗氧化功效，添加10％的DMSO，进行30分钟的超声波提取，之后将上澄液用于实验。作为各实验的对照群，使用了10％DMSO。
<1-2>ABTS自由基阳离子去除活性
该实验方法是测量通过试料去除ABTS自由基阳离子从而试剂的颜色变浅的程度的方法。作为ABTS试剂，将2.45mM potassium persulfate和7mM 2，2`-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)diammonium salt(ABTS，Sigma Co.，USA)试剂溶于三蒸水(triple distilled water)，之后在室温的暗室中放置12小时后使用。将50ug/ml、250ug/ml、500ug/ml浓度的试料10ul与ABTS试剂190ul混合后，使其在室温下反应7分钟，在734nm测量了吸光度。将测量到的吸光度代入下面的公式，计算出活性。实验反复进行了三次，通过Duncan分析，在p<0.05程度下确认了显著性，并且在表1中示出。
参照表1可以得知，L.plantarum发酵产物在所有的实验浓度中为2.83％、11.29％、19.87％，比黑萝卜提取物和营养源以及其它的菌株的发酵产物相比表现出更高的活性，在250ug/ml、500ug/ml浓度，L.plantarum发酵产物表现出比其它的发酵产物最高的活性。
ABTS自由基阳离子去除活性(％)＝100×(对照群的吸光度-试料的吸光度)/(对照群的吸光度)
【表1】
Figure BDA0001973469680000091
<1-3>总多酚化合物以及总黄酮化合物含量
测量了可以视为抗氧化功效的间接指标的总多酚化合物以及总黄酮化合物的含量。总多酚含量是按照Folin-denis方法(9)，在试料20ul中混合Folin-denis试剂(Sigma，USA)100ul，在40℃下反应1分钟后，添加7.5％的Na2CO3溶液80ul，在40℃下反应15分钟。结束反应后，在765nm测量了吸光度。将吸光度代入事先利用gallic acid标准产品按照相同的方法制作的标准曲线，总多酚含量以gallic acid equivalent(GAE)表示。反复进行三次实验，通过Duncan分析，在p<0.05程度下确认了显著性。
总黄酮化合物的含量是按照Davis(10)的方法测量。在试料20ul中混合diethylene glycol 200ul和1N NaOH 20ul后，在37℃反应1小时，之后，在420nm测量了吸光度。将试料的吸光度代入事先利用naringin标准产品按照相同的方法制作的标准曲线，总黄酮含量以naringin equivalent(NE)表示。反复进行三次实验，通过Duncan分析，在p<0.05程度下确认了显著性。
表2示出了总多酚含量以及总黄酮含量。测量总多酚化合物含量的结果，净化水提取物表现出最高的含量。大体上，黑萝卜乳酸菌发酵产物表现出比黑萝卜酒精提取物更高的总多酚化合物含量，与黑萝卜营养源相比，含量显著增加。另外，在总黄酮化合物中检测到净化水以及酒精提取物低于检测阈值，但是，黑萝卜乳酸菌发酵产物均检测到黄酮化合物。从中可以得知黄酮化合物通过发酵过程增加，其中，L.plantarum发酵产物表现出0.450mg/g的最高含量。
考虑总多酚化合物和总黄酮化合物的总含量，可以得知黑萝卜乳酸菌发酵产物具有比黑萝卜营养源或黑萝卜提取物试料更优秀的抗氧化效果。
【表2】
Figure BDA0001973469680000101
实验例2-肝细胞保护功效评价
在本实验中，为了评价黑萝卜乳酸菌发酵产物的肝功能改善功效，进行了用于设定试料的适当浓度的细胞毒性测量和Hep G2细胞的脂肪球形成抑制功效和对于乙醇处理后的细胞的ALT、AST生成抑制功效的评价。
<2-1>细胞毒性测量
进行实验之前，作为MTT试剂，将Thizolyl blue tetrazolium bromide(Sigma，USA)溶于1xPBS，使得最终浓度达到5mg/ml，之后阻挡光线来使用。为了测量细胞毒性，使细胞以1×105cells/ml分株96-well plate后培养24小时，按照各浓度(100ug/ml、500ug/ml、1000ug/ml)处理溶于培养基的各试料，培养了24小时。培养之后，添加MTT试剂，使得比率达到约10:1，反应3小时。去除培养液后，将DMSO各分株100ul，溶解MTT formazan，在540nm测量吸光度，之后，将吸光度代入下面的公式，测量出细胞生存率。反复进行了三次实验，通过Dunnett，在p<0.05程度下确认了显著性。图1示出了测量结果。
测量结果，各试料浓度100ug/ml、500ug/ml、1000ug/ml浓度下，没有表现出对于Hep G2细胞的显著的毒性。
细胞生存率(％)＝试料的吸光度/对照群的吸光度×100
<2-2>脂肪球形成抑制功效评价
首先，将Hep G2细胞以2×105cells/ml分株在24-well plate后培养了24小时。将各试料处理为100ug/ml、500ug/ml浓度，1小时后，将oleic acid(OA)(Sigma，USA)处理为600uM浓度，培养了24小时。作为阳性对照群使用了500ug/ml浓度的个别认证的功能性原料水飞蓟提取物(Milk Thistle)。去除培养液后，以1xPBS洗涤两次，之后在常温下稀释formaldehyde solution(Sigma，USA)制备的10％formalin中处理1小时以上，去除Formalin后，利用蒸馏水洗涤两次，之后在Oil-Red O(ORO)(Sigma，USA)溶液、室温下反应1～2小时。去除ORO溶液后，利用蒸馏水洗涤四次，利用isopropanol(Sigma，USA)溶解被脂肪球染色的色素，转入96-well plate，在490nm测量了吸光度。将吸光度代入下面的公式从而计算出脂肪球形成率。反复进行了三次实验，通过Dunnett，在p<0.05程度下确认了显著性。表3记载了测量结果。
发现与未处理群相比，OA处理群形成了约2.21倍的脂肪球。作为阳性对照群使用的水飞蓟提取物500ug/ml抑制了125.25％的脂肪球，形成了比未处理群高一点程度的脂肪球。在100ug/ml浓度的处理群中，黑萝卜营养源和酒精提取物表现出比OA处理群显著的脂肪球形成抑制效果，在黑萝卜乳酸菌发酵产物中，L.plantarum发酵产物、L.helveticus发酵产物表现出显著的脂肪球形成抑制效果。其中，发现L.plantarum发酵产物表现出与未处理群(100.00％)几乎类似程度的脂肪球形成率(117.77％)，发现脂肪球形成抑制效果非常出色。
在500ug/ml浓度的处理群中，除了50％酒精提取物和L.casei发酵产物之外的试料表现出显著的功效。表现出显著的功效的试料中，L.plantarum发酵产物表现出了最优秀的功效，还发现了即使在比作为阳性对照群的水飞蓟提取物更低含量的100ug/ml的浓度，所有的试料中表现出唯一较低的脂肪球形成率，发现脂肪球形成抑制效果非常出色。
脂肪球形成率(％)＝试料的吸光度/对照群的吸光度×100
【表3】
Figure BDA0001973469680000121
<2-3>ALT以及AST抑制效果
ALT(Alanine aminotransferase：丙氨酸转氨酶)和AST(Aspartateaminotransferase：天冬氨酸转氨酶)检查是肝病诊断中通常使用的检查，ALT和AST的上升暗示肝损伤，在本实验中，针对各实验群和对照群，确认ALT和AST的抑制效果，由此进行了用于确认肝功能改善功效的实验。
首先，将Hep G2细胞以2×105cells/ml分株在6-well plate后培养了24小时。对上述细胞进行乙醇(40ul/ml)处理后，将各试料处理为100ug/ml、500ug/ml、1000ug/ml浓度。24小时后，为了测量ALT以及AST活性，利用各kit(
Figure BDA0001973469680000122
cat#ab105134以及ab105135)的缓冲器，取下细胞，之后的过程按照kit的协议进行。
作为阳性对照群使用了500ug/ml浓度的个别认证的功能性原料水飞蓟提取物。反复进行了三次实验，通过ANOVA分析，在p<0.05程度下确认了显著性。图2示出了ALT测量结果，图3示出了AST测量结果。
首先，根据ALT测量结果，ALT在对照群(乙醇处理前细胞)中测量到20.6mU/ml，乙醇处理后增加到33.8mU/ml。作为阳性对照群使用的水飞蓟提取物处理群为24.6mU/ml，与乙醇处理群相比，显著减少了27％。测量出处理了100以及500ug/ml的浓度的净化水提取物以及酒精提取物的细胞的ALT数值为27.56mU/ml～28.54mU/ml，该数值是ALT数值比乙醇处理群降低了15.6～18.5％的数值，发现具有比水飞蓟提取物处理群的ALT抑制效果低的功效。
相对于此，相同的浓度的黑萝卜乳酸菌发酵产物处理群中测到到21.02mU/ml～25.96mU/ml。该数值是比乙醇处理群减少了23.3～37.9％的数值，与净化水或酒精提取物相比，具有接近约2倍的ALT减少效果，发现黑萝卜乳酸菌发酵产物具有与水飞蓟提取物类似程度的ALT抑制功效。
根据处理了作为最高浓度的提取物的1000ug/ml浓度的试料的细胞的ALT实验结果，处理了净化水以及酒精提取物的细胞的ALT数值是25.41～26.26mU/ml，具有比乙醇处理群减少了22.4～24.9％的ALT抑制效果。相反，从处理了1000ug/ml浓度的黑萝卜乳酸菌发酵提取物的细胞中，测量到的ALT数值为18.66(L.plantrum发酵产物处理)～24.19mU/ml，比乙醇处理群减少了28.5～44.8％，与单纯的黑萝卜提取物处理群相比，发现黑萝卜乳酸菌发酵产物具有特别出色的ALT抑制效果。
其中，与乙醇处理之后相比，L.plantarum发酵产物按照浓度分别抑制了34.0％、37.9％、44.8％的ALT，发现与作为阳性对照群的水飞蓟提取物处理群以及其它的黑萝卜乳酸菌发酵产物相比，具有最出色的功效。
具体地，根据黑萝卜乳酸菌的各种类的发酵产物试料的ALT测量值发现，L.reuteri发酵产物、L.casei发酵产物和L.helveticus发酵产物在所有的浓度的试料中均表现出与水飞蓟提取物同等程度的ALT抑制效果，L.plantrum发酵产物在所有的浓度的试料中均表现出比水飞蓟提取物更加出色的ALT抑制效果。
在将L.plantarum发酵产物处理为最高浓度1000ug/ml的试料中，与乙醇处理后的细胞相比，表现出几乎接近50％的ALT抑制效果，即使与作为阳性对照群的水飞蓟提取物处理群对比，可以发现具有明显的ALT抑制效果。
另一方面，根据与作为阳性对照群的水飞蓟提取物处理群相同的浓度的500ug/ml的黑萝卜乳酸菌发酵产物的处理结果发现，在对比黑萝卜提取物和水飞蓟提取物以及其它的黑萝卜乳酸菌发酵产物时，最出色的ALT抑制效果在500ug/ml的L.plantrum发酵产物中产生，肝功能改善功效比基于其它菌株得到的黑萝卜乳酸菌发酵产物出色。
关于AST，在对照群(乙醇处理前的细胞)测量出7.57mU/ml，乙醇处理后增加到10.88mU/ml。作为阳性对照群的水飞蓟提取物处理群为8.71mU/ml，AST数值比乙醇处理群减少了19.9％。
黑萝卜营养源处理群在各浓度得到了10.53mU/ml、7.77mU/ml、8.88mU/ml的数值，只有在500以及1000ug/ml浓度的处理群，与对照群相比显著减少。净化水提取物处理群只有在1000ug/ml以上的处理群、酒精提取物处理群只有在500ug/ml以上的处理群中测量到具有显著效果的AST数值、即7.72mU/ml～9.50mU/ml。发现单纯的黑萝卜提取物处理群只有在使用相对高浓度的试料时，才具有AST抑制功效。
黑萝卜乳酸菌发酵产物在所有的浓度中显著减少了AST数值。L.casei、L.helveticus以及L.reuteri发酵产物与浓度无关地，在所有的浓度的试料中表现出相似程度的AST抑制效果。L.casei发酵产物处理群测量出6.92mU/ml，L.helveticus发酵产物处理群测量出6.61mU/ml，L.reuteri发酵产物处理群测量出6.71mU/ml，测到了与乙醇处理群相比，AST分别减少了36.3％、39.2％、38.3％的结果。
L.plantarum发酵产物在500以及1000ug/ml浓度的处理群中分别得到6.12mU/ml、5.52mU/ml的数值，发现与乙醇处理群相比，AST数值分别减少到43.8％、49.3％，具有几乎逼近50％的AST抑制效果，在黑萝卜乳酸菌发酵产物中，L.plantarum发酵产物的肝功能改善功效最出色。
与基于其它的菌株得到的黑萝卜发酵产物的处理结果相比，具有约10％左右的AST减少效果，与处理了水飞蓟提取物的细胞中AST数值减少19.9％的结果对比时，也可以发现L.plantrum发酵产物的AST抑制效果比包括阳性对照群在内的所有的群中最出色。

Claims (10)

1.一种肝功能改善用组合物，其包含黑萝卜Raphanus sativus L.var.niger乳酸菌发酵产物，其中，
上述组合物是乳酸杆菌属乳酸菌的黑萝卜发酵产物，
上述乳酸杆菌属乳酸菌是植物乳酸杆菌。
2.根据权利要求1所述的肝功能改善用组合物，其特征在于，
上述组合物抑制肝组织的脂肪球形成而改善肝功能。
3.根据权利要求1所述的肝功能改善用组合物，其特征在于，
上述黑萝卜发酵产物对组合物以50至1500ug/ml的浓度包含其中。
4.一种健康食品，其包含权利要求1至3中的任意一项所述的肝功能改善用组合物。
5.一种权利要求1所述的肝功能改善用组合物的制造方法，上述肝功能改善用组合物中包括的黑萝卜乳酸菌发酵产物是通过如下过程制造的：
捣碎黑萝卜的捣碎过程；
在捣碎的黑萝卜中接种乳酸杆菌属乳酸菌后发酵的发酵过程；以及
将发酵后的黑萝卜杀菌后粉末化的粉末化过程。
6.根据权利要求5所述的肝功能改善用组合物的制造方法，其中，
上述捣碎过程还包括在捣碎的黑萝卜中混合净化水而杀菌的杀菌过程。
7.根据权利要求6所述的肝功能改善用组合物的制造方法，其中，
上述杀菌过程在50℃至150℃的温度下进行。
8.根据权利要求5所述的肝功能改善用组合物的制造方法，其中，
在上述发酵过程，在捣碎后的黑萝卜中以5×102至5×1010CFU/100g接种乳酸杆菌属乳酸菌。
9.根据权利要求5所述的肝功能改善用组合物的制造方法，其中，
上述发酵过程是在20℃至50℃的温度下进行了12至120小时的发酵的。
10.根据权利要求5所述的肝功能改善用组合物的制造方法，其中，
上述粉末化过程是冻结干燥后进行了粉末化的。
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