CN110540571B

CN110540571B - 三七皂苷r1衍生物及其应用

Info

Publication number: CN110540571B
Application number: CN201910729322.2A
Authority: CN
Inventors: 田洋; 杨扬; 盛军; 史崇颖; 贺水莲; 杨茗茸; 戴天浥
Original assignee: Yunnan Agricultural University
Current assignee: Yunnan Agricultural University
Priority date: 2019-08-08
Filing date: 2019-08-08
Publication date: 2021-07-06
Anticipated expiration: 2039-08-08
Also published as: CN110540571A

Abstract

本发明公开了一种式I所示的三七皂苷R1的衍生物及其制备方法，本发明通过计算机辅助设计并合成了对几丁质酶具有显著抑制作用的三七皂苷R1的衍生物，表明三七皂苷R1衍生物有潜力成为新型几丁质酶抑制剂应用于相关药物领域。

Description

三七皂苷R1衍生物及其应用

技术领域

本发明涉及医药领域，具体涉及一种三七皂苷R1衍生物及其制备方法，以及作为几丁质酶抑制剂的用途。

背景技术

三七皂苷R1是亚洲地区广泛应用的知名中草药三七中的代表性成分，三七也作为重要的药食同源植物在各种中成药及保健品中作为配方药物使用。研究发现，三七皂苷R1对各种疾病都有较好活性，但确切的作用机制研究仍待完善。特别是三七皂苷R1在降血脂及心脑血管保护、提高免疫力方面的显著活性，有待深入研究。发现其新颖作用靶点，可能对其治疗效果的作用机制阐释及药物开发有重要的参考价值。

几丁质酶虽然与人体疾病没有较直接的药物作用关系，但在感染，慢性验证和各种退行性疾病患者的血液中几丁质酶都有高表达。抑制几丁质酶是否有利于人体慢性疾病的治疗是一个很有潜力的研究领域。最近，关于几丁质酶抑制剂被用于肺纤维化和骨溶解性骨病的活性研究有力证明了上述推测。针对溶骨性骨病的研究发现，多发性骨髓瘤骨病患者细胞系具有高水平的CHIT1活性，利用硼替佐米治疗溶骨性骨病时发现，硼替佐米通过抑制CHIT1和TKL40的活性，从而降低了溶骨性患者细胞细胞系的骨溶性以及骨吸收，其中，CHIT1的活性降低，另外，CHIT1的mRNA的表达水平也降低。表明几丁质酶可以作为多发性骨髓瘤骨病的治疗靶点，开发新的几丁质酶抑制剂对治疗多发性骨髓瘤骨病具有重要意义。

发明人前期通过反向找靶、分子对接及体外试验确证，发现几丁质酶是三七皂苷R1的一个新作用靶标蛋白。三七皂苷R1对几丁质酶的半数抑制剂量IC₅₀值为32μM，但是，三七皂苷R1与天然几丁质酶抑制剂Argifig相比，几丁质酶结合口袋中还有一个疏水性空腔未能充分结合，在Argifig分子中的苯环基团能与几丁质酶中关键的TRP218残基形成π-π芳香基相互力，而在三七皂苷R1与几丁质酶的结合模拟中缺失该作用力。所以可能在三七皂苷R1的活性羟基部位通过化学合成的方法，链接上一个与Argifig相似的苯环类基团，会增加三七皂苷R1与几丁质酶的相互作用力，可能成为新型几丁质酶抑制剂应用于相关药物领域，迄今为止未见三七皂苷R1衍生物的报道，因此，合成用于治疗多发性骨髓瘤骨病等相关医药领域的几丁质酶抑制剂的三七皂苷R1衍生物是极其重要的并且具有显著价值。

发明内容

针对以上问题，本发明通过计算机辅助设计并合成了对几丁质酶具有显著抑制作用的三七皂苷R1的衍生物。

本发明采用的技术方案为：一种三七皂苷R1衍生物，为3,12-O-二苯甲酰基三七皂苷R1，其结构式为(I)：

三七皂苷R1衍生物3,12-O-二苯甲酰基三七皂苷R1的合成:

三七皂苷R1衍生物3,12-O-二苯甲酰基三七皂苷R1的制备方法，包括以下步骤：

S1.将三七皂苷R1和三乙胺加入氩气环境中的干燥DMSO溶液中，然后在0℃下缓慢滴加苯甲酰氯,在恢复室温后继续搅拌12小时。

S2.反应结束后加入200毫升水，用乙酸乙酯3次萃取，合并萃取液，无水硫酸钠干燥后对溶液进行浓缩得到浓缩物。

S3.所述浓缩物用硅胶柱层析分离纯化(氯仿/甲醇＝1:3梯度洗脱)并经半制备高效液相色谱仪(甲醇/水＝5％-100％梯度洗脱)分离纯化后，得到黄色固体即三七皂苷R1衍生物3,12-O-二苯甲酰基三七皂苷R1，得率为15％。

优选地，步骤S1中，所述三七皂苷R1、三乙胺与苯甲酰氯的摩尔比为1：3：2，所述DMSO溶液的体积为50ml。

优选地，所述三七皂苷R1衍生物的光谱信息如下：优选地，所述三七皂苷R1衍生物的光谱信息如下：¹H NMR(500MHz,CD₃OD,ppm):8.02-8.04(4H,m),7.65-7.67(2H,m),7.53-7.55(4H,m),5.10(1H,br t,J＝5.8Hz),4.08(1H,dt,J＝2.8,10.4Hz),3.66(1H,m),3.10(1H,dd,J＝5.1,11.9Hz),2.27(1H,m),1.73(1H,t,J＝10.6Hz),1.66(3H,s),1.62(3H,s),1.34(3H,s),1.32(3H,s),1.09(3H,s),1.00(3H,s),0.99(3H,s),0.95(3H,s),4.35(1H,d,J＝7.8Hz),3.81(1H,br d,J＝12.1Hz)and 3.64(1H,m)(H-6’s),3.33(1H,m),3.27(1H,m),3.26(1H,m),3.19(1H,m),4.60(1H,d,J＝7.7Hz,),3.77(1H,br d,J＝12.1Hz)and 3.64(1H,m),3.33(1H,m),3.30(1H,m),3.20(1H,m),3.08(1H,t,J＝8.5Hz)；¹³C NMR(125MHz,CD₃OD,ppm):165.9,133.0,130.1,129.9,128.6,40.2,27.2,79.8,40.3,61.7,80.9,45.3,41.8,50.6,40.5,30.9,71.8,49.8,52.4,31.5,27.6,53.1,17.6,17.8,84.9,22.8,36.6,24.2,125.8,132.3,25.9,18.0,31.4,16.1,17.1,105.5,75.4,79.0,71.7,77.6,62.9,98.2,75.3,78.2,71.2,77.9,62.5；HRMS:calculated C₆₁H₈₈O₂₀m/z＝1140.5963；found1140.4288。

优选地，所述三七皂苷R1衍生物作为几丁质酶抑制剂的用途。

本发明的有益效果为：本发明通过计算机辅助设计并合成了对几丁质酶具有显著抑制作用的三七皂苷R1的衍生物，这是首次获得三七皂苷R1的衍生物，并且该衍生物作为新化学分子实体对几丁质酶具有较强的抑制作用，经试验比较，该三七皂苷R1衍生物较已有几丁质酶抑制剂Argifin抑制几丁质酶的活性有明显增强，表明三七皂苷R1衍生物有潜力成为新型几丁质酶抑制剂的治疗多发性骨髓瘤骨病等疾病的药物。本发明公布的三七皂苷R1衍生物的制备方法，得率高，可以用于新药品的研发及扩大生产。

附图说明

图1中，a为三七皂苷R1和天然几丁质酶抑制剂Argifig与几丁质酶(1WB0)的分子对接模拟3D图；b图为a的放大图；c图为Argifig与几丁质酶结合对接2D模拟图；d图为三七皂苷R1与几丁质酶结合对接2D模拟图；

图2:其中，a为三七皂苷R1衍生物与几丁质酶的结合模拟3D图，b图为a放大图，c为三七皂苷R1衍生物与几丁质酶的结合模拟2D图；

图3中，a为Argifig、三七皂苷R1与几丁质酶的结合模拟3D图，图b为三七皂苷R1衍生物、Argifig和三七皂苷R1与几丁质酶的结合模拟3D图；其中，Argifig为黑色分子，三七皂苷R1为绿色分子，三七皂苷R1衍生物为红色分子，红圈标注为几丁质酶疏水性空腔。

图4为不同浓度三七皂苷R1衍生物对几丁质酶的抑制情况。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明做进一步说明。

实施例1计算机辅助设计三七皂苷R1衍生物并评价其结合能力

原理：为了提高三七皂苷R1对几丁质酶的结合力及抗病活性，且基于对三七皂苷R1与几丁质酶的结合机制有了解的基础上，三七皂苷R1与天然几丁质酶抑制剂Argifig相比，几丁质酶结合口袋中还有一个疏水性空腔未能充分结合，在Argifig分子中的苯环基团能与几丁质酶中关键的TRP218残基形成π-π芳香基相互力，而在三七皂苷R1与几丁质酶的结合模拟中缺失该作用力(如图1)。所以在三七皂苷R1的活性羟基部位通过化学合成的方法，链接上一个与Argifig相似的苯环类基团，会增加三七皂苷R1与几丁质酶的相互作用力。

方法：1)三七皂苷R1分子中甾环部分的羟基有一定活泼性，根据空腔体积大小和Argifig中的苯环侧链进行设计，将苯甲酰基团链接到三七皂苷R1甾环羟基上,在分子对接中，也刚好可以弥补与Argifig的差别。

2)对三七皂苷R1衍生物进行DS软件分子对接，评价其结合能力(如图2)。

结果：三七皂苷R1衍生物能够结合到几丁质酶的活性口袋中，该结合位点也是目前公认的几丁质酶抑制剂所结合的位点，结合区域(Site Sphere)为19.7498,-0.6556,11.297,12.2。并且，三七皂苷R1衍生物能与几丁质酶活性位点的各个关键氨基酸残基形成多种相互作用力，包括S1糖基侧链中H原子与蛋白的ARG35、TRP31、TRP99、GLU140和ASP213分别形成5个氢键作用力；三七皂苷R1衍生物的甾环部分能与蛋白的TRP99和TRP218残基分别形成2个关键的π-θ相互作用力和5个π-π堆砌作用力。这与三七皂苷R1相比，三七皂苷R1衍生物形成了更多且更稳定的分子相互作用力。上述相互作用表明本三七皂苷R1衍生物能够与几丁质酶形成较强的结合力。

使用SwissDock分子对接平台计算也发现三七皂苷R1衍生物与三七皂苷R1相比，对几丁质酶的结合能明显提高(三七衍生物为-12.29kcal/mol，三七皂苷R1为-11.24kcal/mol)。

如图3所示，在DS软件中的Cdock分子对接模拟中，将三七皂苷R1衍生物、三七皂苷R1和Argifig进行了几丁质酶结合位点疏水性空腔的结合对比模拟试验，三七皂苷R1和Argifig相比，三七皂苷R1衍生物的苯甲酰基团能够填补几丁质酶中更多的疏水性空腔，形成更多的疏水作用力，说明三七皂苷R1衍生物是活性更好的新型几丁质酶抑制剂。

实施例2三七皂苷R1衍生物的合成

方法：如图3所示，

1)将三七皂苷R1(0.05mol)和三乙胺(0.15mol)加入氩气环境中的50毫升干燥DMSO溶液中，然后在0℃下缓慢滴加苯甲酰氯(0.1mol),在恢复室温后继续搅拌12小时。

2)待反应结束后加入200毫升水，用乙酸乙酯3次萃取该反应体系，合并萃取液，无水硫酸钠干燥后浓缩溶液。

3)经硅胶柱层析分离纯化(氯仿/甲醇＝1:3梯度洗脱)并经半制备高效液相色谱仪(甲醇/水＝5％-100％梯度洗脱)分离纯化后，得到黄色固体即化合物3,12-O-二苯甲酰基三七皂苷R1，产率为15％。

实施例3三七皂苷R1衍生物体外几丁质酶活性抑制测定

原理：几丁质酶可水解人工底物pNP-GlcNAc，释放在405nm波长下具有特异性荧光吸收的发光基团。

方法：将几丁质酶、抑制剂和底物一同孵育后，通过检测405nm波长下的吸收值即可几丁质酶抑制剂的活性。试验在96孔酶标板中进行，筛选体系包括：10μM各浓度三七皂苷R1衍生物，0.2mM的pNP-GlcNAc和适量蒸馏水，溶解于60μL含有20％乙醇的Britton-Robinson缓冲液(pH＝6.0)中。30℃孵育1小时后，使用60μL的碳酸钠溶液终止反应。通过检测405nm荧光吸收情况来表征计算相关抑制剂的几丁质酶抑制活性。

以不加三七皂苷R1衍生物和酶的实验组为空白对照，以不加三七皂苷R1衍生物的实验组为阳性对照，根据荧光信号差值与空白信号值的比值计算6个不同浓度三七皂苷R1衍生物的抑制率，用Graphpad prism6拟合IC₅₀曲线并计算IC₅₀值。

结果：经6个浓度的三七皂苷R1衍生物对几丁质酶抑制实验后，计算得到三七皂苷R1衍生物3,12-O-二苯甲酰基三七皂苷R1的IC₅₀＝8.306μM，与三七皂苷R1的IC₅₀值41.837μM相比，有显著提高，表示其具有显著抑制几丁质酶活性，而且，随三七皂苷R1衍生物浓度增加，呈现出明显的剂量依赖性，如图4所示。

综上所述，说明通过计算机辅助设计并合成相应几丁质酶抑制剂的方法确实可靠有效，而且通过该法发现了一个具有显著几丁质酶抑制活性的先导化合物3,12-O-二苯甲酰基三七皂苷R1，为治疗几丁质酶相关疾病药物的研制提供了研究基础。

Claims

1.一种三七皂苷R1衍生物，为3,12-O-二苯甲酰基三七皂苷R1，如结构式(I)所示：

2.权利要求1所述的一种三七皂苷R1衍生物的用途，其特征在于，所述三七皂苷R1衍生物作为制备几丁质酶抑制剂的用途。