CN110590779A

CN110590779A - 3，10二对氯苯基6，12二氮杂四高立方烷类化合物及其合成方法、应用和药物组合物

Info

Publication number: CN110590779A
Application number: CN201910956172.9A
Authority: CN
Inventors: 王晓霞; 庄鹏宇; 张丹阳; 徐嘉乐
Original assignee: North China University of Science and Technology
Current assignee: North China University of Science and Technology
Priority date: 2019-10-10
Filing date: 2019-10-10
Publication date: 2019-12-20
Anticipated expiration: 2039-10-10
Also published as: CN110590779B

Abstract

本发明公开一种3，10‑二对氯苯基‑6，12‑二氮杂四高立方烷类化合物及其合成方法、抗炎活性中应用和药物组合物,涉及化合物合成领域,化合物具备式Ⅰ结构,以1，4‑二氢吡啶衍生物作为[2+2]光环合反应的底物，在低温、液相，氮气保护条件下，采用LED光反应器作为光源，合成一种[2+2]光环合反应产物，并在细胞模型上对式Ⅰ化合物的抗炎作用进行初步研究。通过LPS诱导的RAW264.7细胞炎症模型，以一氧化氮的分泌量为指标，初步探讨式Ⅰ化合物的抗炎活性，结果表明,式Ⅰ化合物在LPS诱导的RAW264.7细胞炎症模型中具有一定的抗炎作用。

Description

3，10二对氯苯基6，12二氮杂四高立方烷类化合物及其合成方法、应用和药物组合物

技术领域

本发明涉及化合物合成领域，特别涉及3，10-二对氯苯基-6，12-二氮杂四高立方烷类化合物及其合成方法、应用和药物组合物。

背景技术

1，4-二氢吡啶(1，4-DHP)类化合物是一类重要的含氮杂环化合物，它的结构骨架广泛存在于天然产物、药物以及具有生物药物活性的分子中。其结构中特有的6π电子体系，令其表现出极其活泼的化学性质，在光诱导下能够发生[2+2]光环合、氧化和异构化等光化学反应。1，4-二氢吡啶的光化学反应产物具有良好的抗HIV和抗肿瘤等生物药理活性，如3，9-二氮杂四星烷类化合物、四氢环丁烷二吡啶类化合物及6，12-二氮杂四高立方烷类化合物等。因此，采用有机光化学的方法，对1，4-二氢吡啶衍生物的光化学反应进行系统的研究，将为其更广泛的应用研究提供理论和实验依据。

炎症为很多急慢性疾病的致病因素之一，如感冒、呼吸系统疾病、风湿性关节炎、肌肉和软组织损伤、心脑血管疾病、各种慢性疼痛等，均有炎症参与，因此，抗炎药物在临床上具有广泛的用途。目前临床普遍使用的非甾体抗炎药具有确切的疗效，但该类药物普遍存在着消化道损害、肝肾损害等不良反应，寻找不良反应小、安全性高的抗炎药物，仍是国内外创新药物发现的热点。目前上市的抗炎药物也大多以天然产物为先导化合物通过结构改造发展而来，如以水杨酸为先导化合物，发展了一系列的非甾体抗炎药物。因此，合成和发现新的具有抗炎活性的化合物，也是抗炎药物发现的重要途径之一。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种新的6，12-二氮杂四高立方烷类化合物。

本发明的目的之二在于提供了一种新6，12-二氮杂四高立方烷类化合物的合成方法。

本发明的目的之三在于提供了一种新6，12-二氮杂四高立方烷类化合物在抗炎活性中的应用。

本发明的目的之四在于提供了一种药物组合物，其含有一个新6，12-二氮杂四高立方烷类化合物。

本发明是通过以下技术方案实现的：3，10-二对氯苯基-6，12-二氮杂四高立方烷类化合物，具有式Ⅰ所示结构：

如式Ⅰ所示化合物的合成方法，其中，每合成式Ⅰ化合物0.21g包括以下步骤：

1、中间产物a的合成步骤

以3-乙酰基吡啶和溴化苄为原料：3-乙酰基吡啶1.5mL溶解于乙腈25mL中，加入溴化苄1.8mL加热回流反应15h，冷却后加入乙醚30mL沉淀，抽滤后得到沉淀物，沉淀物用乙醚10mL洗涤得到吡啶溴化盐的白色粉末a。

2、中间产物b的合成步骤

称取干燥的吡啶溴化盐a 1.5g溶解于四氢呋喃中100mL。在-18℃低温持续搅拌的状态下缓缓加入格氏试剂4-氯苯基氯化镁6mL，以CuI 0.1g为此反应的催化剂，-18℃低温搅拌下反应20min，再转移至常温下反应30min，此过程中持续搅拌，得到产物b。

3、中间产物b的纯化

将以上步骤2中得到的产物，旋干之后用水和二氯甲烷反复萃取(保留二氯甲烷中溶解的，除去水中溶解的未反应完全的吡啶盐)。合并萃取液后旋转蒸发仪旋干，按硅胶：样品＝1：1拌样，1：10上柱。流动相使用石油醚：乙酸乙酯＝2：1，除去杂质，冷冻干燥后得到纯化后的黄色粉末b。

4、目标化合物的合成

称取纯化后的b 0.60g作为光反应底物。将b溶解于甲醇：四氢呋喃＝1:1的混合溶剂中，置于石英试管中。放置在365nm紫外灯下照射，石英试管与光源的距离为60cm，-18℃低温反应。采用薄层色谱分析法监测反应进程。直至b的荧光点消失，表示反应完成，用时21天。

5、目标化合物的纯化

将4中得到的反应产物的混合溶液旋干，称重。采用硅胶柱色谱及Sephadex LH-20色谱纯化，冷冻干燥后得到纯的目标化合物，经核磁及X-Ray单晶衍射鉴定为式Ⅰ结构，0.21g，避光保存。

进一步的如权利要求1所述的化合物在抗炎活性药物中的应用。

进一步的，所述的药理模型为LPS诱导的RAW264.7细胞炎症模型，以一氧化氮的分泌量为指标。

根据本发明的思路，在细胞模型上对式Ⅰ化合物的抗炎作用进行初步研究。通过LPS诱导的RAW264.7细胞炎症模型，以一氧化氮的分泌量为指标，初步探讨式Ⅰ化合物的抗炎活性，结果表明，式Ⅰ化合物IC₅₀值与阳性对照药米诺环素(Mino)相当，说明式Ⅰ化合物在LPS诱导的RAW264.7细胞炎症体外模型中表现出良好的抗炎作用。

采用Criess法检测对LPS刺激下的RAW264.7细胞分泌NO的抑制作用。取对数生长期RAW264.7细胞接种于96孔板中，于37℃、5％CO₂条件下培养24小时后加入不同浓度的待测样品，同时设模型组、阳性对照组、空白组、继续温孵培养24小时。每组重复4次。将上清液与等体积Criess试剂混合，室温反应10min后，用酶联免疫检测仪测定混合物在540nm处的吸收值，计算NO抑制率。

进一步的含有权利要求1中所示的化合物以及药效学上可接受的载体。

本发明有益效果：根据数据分析，该3，10-二对氯苯基-6，12-二氮杂四高立方烷类化合物在LPS诱导的RAW264.7细胞炎症体外模型中显示出了良好的抗炎活性。通过以上细胞抗炎活性实验显示,该类6，12-二氮杂四高立方烷类化合物在抗炎活性药理作用中有一定的研究意义,对于抗炎药物的发现有一定的开发前景，可以进一步开发为潜在的抗炎药物。

附图说明

图1：式Ⅰ结构的3，10-二对氯苯基-6，12-二氮杂四高立方烷类化合物的合成路线图。

具体实施方式

下面的实施例及药理活性实验进一步说明本发明，但并不意味着对本发明的任何限制。

实施例1：3，10-二对氯苯基-6，12-二氮杂四高立方烷类化合物，具有式Ⅰ所示结构

实施例2：合成实验结合附图1说明：以3-乙酰基吡啶和溴化苄为原料：3-乙酰基吡啶1.5mL溶解于乙腈25mL中，加入溴化苄1.8mL加热回流反应15h，冷却后加入乙醚30mL沉淀，抽滤后得到沉淀物，沉淀物用乙醚10mL洗涤得到吡啶溴化盐的白色粉末a：3.7g，产率92.8％。(产率误差范围不超过5％为正常)称取干燥的吡啶溴化盐a 1.5g溶解于四氢呋喃中100mL。在低温(-18℃)持续搅拌的状态下缓缓加入格氏试剂4-氯苯基氯化镁6mL，以CuI0.1g为此反应的催化剂，低温(-18℃)搅拌下反应20min，再转移至常温下反应30min，此过程中持续搅拌，直到反应完成。将得到的产物b旋干后用水和二氯甲烷反复萃取三次，将萃取液合并并用旋转蒸发仪旋干，按硅胶：样品＝1：1拌样，1：10上柱，流动相使用石油醚：乙酸乙酯＝2：1，除去杂质，冷冻干燥后得到纯化后的黄色粉末b：1.45g，产率87.3％(产率误差范围不超过5％为正常)，称取纯化后的b，0.60g作为光反应底物。使其溶解于甲醇：四氢呋喃＝1:1的混合溶剂中，置于石英试管中。放置在365nm紫外灯下照射，石英试管与光源的距离为60cm。采用薄层色谱分析法监测反应进程。直至b的荧光点消失，表示反应完成，用时21天。将所得产物经纯化后冷冻干燥后得到纯的目标化合物0.21g，经核磁及X-Ray单晶衍射鉴定为式Ⅰ结构，避光保存。

式Ⅰ结构的3，10-二对氯苯基-6，12-二氮杂四高立方烷类化合物的理化、波谱数据如下：

白色粉末，ESI-MS m/z 648[M+H]⁺。分子式为C₄₀H₃₆Cl₂N₂O₂。¹H-NMR(CDCl₃,600MHz)δH:2.11(s,6H,-Me×2),3.23(brd,2H,J＝6Hz,H-1,5),3.33(brd,2H,J＝6Hz,H-3,10),3.32(d,2H,J＝6Hz,H-4,11),3.52(d,2H,J＝12Hz,H-7,8),3.62(brs,2H,Ph-CH₂-N-,空间远Cl端),5.07(s,2H,Ph-CH₂-N-,空间近Cl端)，以下低场区信号峰为4个苯环上的氢原子信号峰，6.34(d,4H,J＝6Hz),7.02(d,4H,J＝12Hz),7.06(m,4H),7.12(m,2H),7.24(d,4H,J＝6Hz)。¹³C-NMR(CDCl₃,150MHz)δC:211.4(羰基×2),139.9(苯环上与Cl对位的碳×2),137.8(单取代苯上的季碳×2),130.6(苯上与Cl相连的碳×2)；128.9(C×4),128.6(C×4),128.1(C×2)为两个单取代苯环上的碳原子信号；128.0(C×4),127.0(C×4)为两个对位双取代苯上的碳原子信号；70.2(C-1,5),69.9(C-7,8),67.8(C-Ph-CH₂-N-×2),55.7(C-2,9),49.4(C-3,10),45.8(C-4,11),27.0(-Me×2)。

药理实验

实验材料：1、受试药：本发明单体化合物；2、细胞株：RAW264.7细胞(由北京协和医科大学提供)；3、培养基：10％特优级胎牛血清(FBS,Hyclone)的DEME培养基，美国Gibco公司生产；4、阳性对照药：米诺环素(Mino)

将实验化合物配制成浓度为10mM的DMSO溶液。上述细胞株培养与10％特优级胎牛血清(FBS,Hyclone)的DEME培养基中,培养液添加青霉素(100U/mL)和链霉素(100μg/mL),并置于37℃、5％CO₂的培养箱中培养。实验用细胞处于对数生长期。培养液中NO含量测定使用一氧化氮测试盒(南京建成生物工程研究所),根据说明书使用亚硝酸钠标准液制备标准曲线。

NO极不稳定,遇氧及水生成硝酸盐及亚硝酸盐,后二者遇硝酸盐显色剂可生成淡红色偶氮化合物,故采用Griess法测定样品中NO₂的浓度,间接测定NO浓度。Griess试剂A：0.1％N-萘乙二胺盐酸盐；Griess试剂B：5％H₃PO₄含1％对氨基苯磺酸酰胺,使用前等体积混合试剂A和B。

用培养液(即含10％FBS的DEME培养基)稀释被测试的化合物溶液,使化合物溶液的浓度为50μM(初筛浓度)。取对数生长期细胞,用胰蛋白酶-EDTA消化液消化后,配制成单细胞混悬液,将其接种于96孔板,每孔加100μL RAW264.7细胞,接种密度为5×10⁵cells/mL,CO₂培养箱中培养1小时后,每孔加入LPS(100ng/mL)、IFN-γ(100units/mL)和不同浓度的测试样品0.4μL,以0.4μL DMSO作为空白对照组,同时设LPS/IFN-γ组(不介入测试样品),重复测试4次。于37℃、5％CO₂条件下培养24小时后洗去培养液上清100μL至酶标板中,加入等体积的Griess试剂,室温反应10min后测定540nm处的吸收值(OD值)。根据NO测试盒说明书,用浓度分别为50μM,25μM,20μM,12.5μM,6.25μM,3.125μM的亚硝酸钠标准液绘制标准曲线,根据标准曲线计算细胞培养上清液中NO₂的浓度以及对NO释放的抑制率。

在初筛结果的基础上,将化合物配制成50μM、25μM、12.5μM和6.5μM的溶液,分别测定各浓度下的NO抑制率,按照中效方程计算化合物对NO抑制的IC₅₀值。

据数据分析，该3，10-二对氯苯基-6，12-二氮杂四高立方烷类化合物在LPS诱导的RAW264.7细胞炎症体外模型中显示出了良好的抗炎活性。

通过以上细胞抗炎活性实验显示,该类6，12-二氮杂四高立方烷类化合物在抗炎活性药理作用中有一定的研究意义,对于抗炎药物的发现有一定的开发前景，可以进一步开发为潜在的抗炎药物。

实施例3：本发明还涉及以本发明化合物作为活性成分的药物组合物。该药物组合物可根据本领域公知的方法制备。可通过将本发明化合物与一种或多种药学上可接受的固体或液体赋形剂和/或辅剂结合，制成适于人或动物使用的任何剂型。本发明化合物在其药物组合物中的含量通常为0.1-95重量％。

本发明的化合物或含有它的药物组合物可以单位剂量形式给药，给药途径可为肠道或非肠道，如口服、鼻腔、口腔粘膜、皮肤、腹膜、直肠等。

给药剂型可以是液体剂型、固体剂型或半固体剂型。液体剂型可以是溶液剂(包括真溶液和胶体溶液)、乳剂(包括o/w型、w/o型和复乳)、混悬剂、注射剂(包括水针剂、粉针剂和输液)、滴眼剂、滴鼻剂、洗剂和搽剂等；固体剂型可以是片剂(包括普通片、肠溶片、含片、分散片、咀嚼片、泡腾片、口腔崩解片)、胶囊剂(包括硬胶囊、软胶囊、肠溶胶囊)、颗粒剂、散剂、微丸、滴丸、栓剂、膜剂、贴片、气(粉)雾剂、喷雾剂等；半固体剂型可以是软膏剂、凝胶剂、糊剂等。

本发明的化合物可以制成普通制剂、也可以是缓释制剂、控释制剂、靶向制剂及各种微粒给药系统。

为了将本发明化合物制成片剂，可以广泛使用本领域公知的各种赋形剂，包括稀释剂、黏合剂、润湿剂、崩解剂、润滑剂、助流剂。稀释剂可以是淀粉、糊精、蔗糖、葡萄糖、乳糖、甘露醇、山梨醇、木糖醇、微晶纤维素、硫酸钙、磷酸氢钙、碳酸钙等；湿润剂可以是水、乙醇、异丙醇等；粘合剂可以是淀粉浆、糊精、糖浆、蜂蜜、葡萄糖溶液、微晶纤维素、阿拉伯胶浆、明胶浆、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、乙基纤维素、丙烯酸树脂、卡波姆、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇等；崩解剂可以是干淀粉、微晶纤维素、低取代羟丙基纤维素、交联聚乙烯吡咯烷酮、交联羧甲基纤维素钠、羧甲基淀粉钠、碳酸氢钠与枸橼酸、聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸钠等；润滑剂和助流剂可以是滑石粉、二氧化硅、硬脂酸盐、酒石酸、液体石蜡、聚乙二醇等。

还可以将片剂进一步制成包衣片，例如糖包衣片、薄膜包衣片、肠溶包衣片，或双层片和多层片。

为了将给药单元制成胶囊剂，可以将有效成分本发明化合物与稀释剂、助流剂混合，将混合物直接置于硬胶囊或软胶囊中。也可将有效成分本发明化合物先与稀释剂、黏合剂、崩解剂制成颗粒或微丸，再置于硬胶囊或软胶囊中。用于制备本发明化合物片剂的各稀释剂、黏合剂、润湿剂、崩解剂、助流剂品种也可用于制备本发明化合物的胶囊剂。

为将本发明化合物制成注射剂，可以用水、乙醇、异丙醇、丙二醇或它们的混合物作溶剂并加入适量本领域常用的增溶剂、助溶剂、pH调剂剂、渗透压调节剂。增溶剂或助溶剂可以是泊洛沙姆、卵磷脂、羟丙基-β-环糊精等；pH调剂剂可以是磷酸盐、醋酸盐、盐酸、氢氧化钠等；渗透压调节剂可以是氯化钠、甘露醇、葡萄糖、磷酸盐、醋酸盐等。如制备冻干粉针剂，还可加入甘露醇、葡萄糖等作为支撑剂。

此外，如需要，也可以向药物制剂中添加着色剂、防腐剂、香料、矫味剂或其它添加剂。

为达到用药目的，增强治疗效果，本发明的药物或药物组合物可用任何公知的给药方法给药。

本发明化合物药物组合物的给药剂量依照所要预防或治疗疾病的性质和严重程度，患者或动物的个体情况，给药途径和剂型等可以有大范围的变化。一般来讲，本发明化合物的每天的合适剂量范围为0.001-150mg/Kg体重，优选为0.1-100mg/Kg体重，更优选为1-60mg/Kg体重，最优选为2-30mg/Kg体重。上述剂量可以一个剂量单位或分成几个剂量单位给药，这取决于医生的临床经验以及包括运用其它治疗手段的给药方案。

本发明的化合物或组合物可单独服用，或与其他治疗药物或对症药物合并使用。当本发明的化合物与其它治疗药物存在协同作用时，应根据实际情况调整它的剂量。

Claims

1.3，10-二对氯苯基-6，12-二氮杂四高立方烷类化合物，其特征在于具有式Ⅰ所示结构

2.如权利要求1所示化合物的合成方法，其特征在于，每合成式Ⅰ化合物0.21g包括以下步骤：

(1)中间产物a的合成步骤

(2)中间产物b的合成步骤

称取干燥的吡啶溴化盐a 1.5g溶解于四氢呋喃中100mL，在-18℃低温持续搅拌的状态下缓缓加入格氏试剂4-氯苯基氯化镁6mL，以CuI 0.1g为此反应的催化剂，-18℃低温搅拌下反应20min，再转移至常温下反应30min，此过程中持续搅拌，得到产物b。

(3)中间产物b的纯化

将(2)中得到的产物b旋干后用水和二氯甲烷反复萃取，将萃取液合并并用旋转蒸发仪旋干，按硅胶：样品＝1：1拌样，1：10上柱，流动相使用石油醚：乙酸乙酯＝2：1，除去杂质，冷冻干燥后得到纯化后的黄色粉末b。

(4)目标化合物的合成

称取纯化后的b 0.60g作为光反应底物，将b溶解于甲醇：四氢呋喃＝1:1的混合溶剂中，置于石英试管中，放置在365nm紫外灯下照射，石英试管与光源的距离为60cm，-18℃低温反应，采用薄层色谱分析法监测反应进程，直至b的荧光点消失，表示反应完成。

(5)目标化合物的纯化

将(4)中得到的反应产物的混合溶液旋干，称重，采用硅胶柱色谱及Sephadex LH-20色谱纯化，冷冻干燥后得纯目标化合物，经核磁及X-Ray单晶衍射鉴定为式Ⅰ结构，0.21g，避光保存。

3.如权利要求1所述的化合物在抗炎活性药物中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征为，所述的药理模型为LPS诱导的RAW264.7细胞炎症模型，以一氧化氮的分泌量为指标。

5.一种药物组合物，其特征在于，含有权利要求1中所示的化合物以及药效学上可接受的载体。