CN110526412B - 基于微藻培养的含铬废水的处理方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供基于微藻培养的含铬废水的处理方法，属于水生生物培养领域，该方法利用含铬废水培养微藻；向废水中加入3‑5mg/L吡硅酮。本发明还提供了一种光‑膜生物反应器，该反应器中的膜为PVA/PVDF共混膜制成的中空纤维超滤膜；其中，PVDF接枝2‑甲基‑4‑氯苯氧乙酸。本发明能够促进植物络合素合成酶基因(PCS)表达，促进植物络合素的大量生成，提高微藻对Cr(Ⅵ)的解毒作用；能够抑制藻细胞生长，抑制生物膜的形成，增加与PVA的相容性，提高PVDF的亲水性。

Description

基于微藻培养的含铬废水的处理方法

技术领域

本发明属于水生生物培养领域，具体涉及基于微藻培养的含铬废水的处理方法。

背景技术

随着人类工业文明的不断发展，环境中的重金属污染日趋严重。重金属铬与汞、镉、铅、砷合称五毒元素，是环境中极具威胁的污染物之一。研究表明，环境中的铬主要有Cr(Ⅵ)和Cr(Ⅲ)两种存在形态，其中低浓度的Cr(Ⅲ)在生物的生长发育过程中起着重要的作用，是机体所必需的微量元素之一，而Cr(Ⅵ)则对生物有较强的毒性作用，具有明显的三致效应。在环境中，土壤只对Cr(Ⅲ)有较强的吸附作用，而Cr(Ⅵ)则具有较强的流动性，这使得Cr(Ⅵ)的污染范围更广，更易于进入自然水体。目前我国的Cr(Ⅵ)污染主要来源于电镀、皮革等工业生产的废水排放，具有分布广、排放量大、污染渠道多等特点，因此对于废水中Cr(Ⅵ)的污染治理刻不容缓。

现行主要的重金属废水处理方法有三类，分别为化学处理法、物理处理法和生物处理法。化学方法指的通过是在废水中添加化学药剂使重金属离子在该药剂的影响下发生沉淀或氧化还原反应从而达到去除效果的方法。物理方法指的是利用物理手段在不改变废水中重金属离子化学存在形态的前提下通过吸附、浓缩、离子交换、渗析等技术去除重金属离子的方法。生物方法则是采用生物细胞的某些性质或生理特性来处理重金属离子。

现有技术如授权公告号为CN 104129860B的中国发明专利，公开了一种利用小球藻净化碱性重金属废水的方法，属于小批量工业废水处理技术领域。收集Fe²⁺含量为10-80mg/L以及pH为10-13的废水，将其混合后，向其中添加种子液和小球藻，控制培养温度和光照条件，连续光照与连续黑暗交替进行培养至小球藻生长的对数期后，小球藻回收再利用，而废水则直接排放。将本发明净化方法应用于单次排放量小、但排放频率高、收集困难的碱性重金属废水的处理，具有处理方式灵活、操作方便等优点。

发明内容

本发明的目的在于提供基于微藻培养的含铬废水的处理方法，该方法能够促进植物络合素合成酶基因(PCS)表达，促进植物络合素的大量生成，提高微藻对Cr(Ⅵ)的解毒作用；能够抑制藻细胞生长，抑制生物膜的形成，增加与PVA的相容性，提高PVDF的亲水性。

本发明为实现上述目的所采取的技术方案为：

提供一种含铬废水的处理方法，包括：在所述含铬废水中培养微藻；其中，所述废水中加入3-5mg/L吡硅酮。植物络合素是一类具有(γ-Glu-Cys)_n-Gly(n＝2-11)常规结构的热稳定重金属螯合多肽，在废水中加入吡硅酮能够促进微藻的植物络合素合成酶基因(PCS)表达，从而促进植物络合素的大量生成，与重金属Cr(Ⅵ)结合形成金属-植物络合素(CrPCs)复合物，从而阻止重金属与其他的靶位点非特异性结合，并将Cr(Ⅵ)转运到液泡中储存，从而提高微藻对Cr(Ⅵ)的解毒作用，提高微藻生长量、提高微藻对废水中Cr(Ⅵ)和氮磷的去除率。

在一些实施方式中，上述微藻为小球藻，上述小球藻在膜-光生物反应器中进行培养。膜法截留微藻的污水处理技术是最佳的污水资源化利用的方式，能够达到污水高效资源化利用和回收微藻再利用的双重目的。

在一些实施方式中，上述含铬废水中六价铬胁迫对小球藻生长的半抑制浓度为3.43mg/L。通过在废水中加入3-5mg/L吡硅酮，提高小球藻对Cr(Ⅵ)的解毒作用，从而提高六价铬胁迫对小球藻生长的半抑制浓度。

在一些实施方式中，上述微藻采用连续培养的方式。连续培养的操作方式比批次培养更适于应用在基于微藻培养的含铬废水处理工艺中。

在一些实施方式中，上述膜-光生物反应器中的膜为中空纤维超滤膜。长期运行条件下，超滤膜仅会在表面形成污染，而对于微滤膜，随着过滤时间的延长，部分微藻细胞体和胞外聚合物会附着在膜内部，微滤膜表面和内部都存在严重的污染，导致微滤膜的通量恢复率低于超滤膜。

在一些实施方式中，上述中空纤维超滤膜为PVA/PVDF共混膜。PVDF是疏水性膜材料，PVA为亲水性有机物，将PVDF和PVA进行共混改性后，PVDF材料的本体发生改性，PVDF的亲水性明显增强。

在一些实施方式中，上述PVDF接枝2-甲基-4-氯苯氧乙酸。在膜-光生物反应器培养微藻的过程中，容易造成膜的不可逆污染，其中，藻细胞是不可逆污染的主要成分。用2-甲基-4-氯苯氧乙酸对PVDF进行接枝改性，能够破坏微藻的细胞结构，抑制藻细胞生长，抑制藻体细胞在膜上的附着，抑制生物膜的形成，同时能够提高PVDF的亲水性，增加与PVA的相容性，提高膜的抗污染能力。

在一些实施方式中，上述膜-光生物反应器中水力停留时间为2-4d，固体停留时间为38-42d。在一定范围内缩短反应器的水力停留时间有利于反应器污染物去除速率的提升，在水力停留时间(HRT)为2-4d，固体停留时间(SRT)为38-42d的组合工艺下，小球藻对于废水中氮、磷和Cr的去除率较高。

本发明提供一种膜-光生物反应器，其特征在于：所述膜-光生物反应器中的膜为PVA/PVDF共混膜制成的中空纤维超滤膜；其中，所述PVDF接枝2-甲基-4-氯苯氧乙酸。

本发明还提供一种膜-光生物反应器在微藻处理含铬废水中的用途。

本发明的有益效果为：

1)本发明通过对含铬废水中加入3-5mg/L吡硅酮进行处理，能够促进微藻的植物络合素合成酶基因(PCS)表达，促进植物络合素的大量生成，与重金属Cr(Ⅵ)结合形成金属-植物络合素(CrPCs)复合物，转运到液泡，阻止重金属与其他的靶位点非特异性结合，提高微藻对Cr(Ⅵ)的解毒作用，提高微藻生长量、提高微藻对废水中Cr(Ⅵ)和氮磷的去除率；

2)本发明通过对膜-光生物反应器中的膜进行优化，对PVDF接枝2-甲基-4-氯苯氧乙酸改性，抑制藻细胞生长，抑制生物膜的形成，同时提高PVDF的亲水性，增加与PVA的相容性，减少成膜后脱落的发生，提高膜的抗污染能力；

3)本发明通过对水力停留时间和固体停留时间进行优化，提高小球藻对于废水中氮、磷和Cr的去除率。

附图说明

图1为本发明的膜上表面接触角、上下表面接触角的代数差、致密生物膜活细胞数图；

图2为本发明的膜污染前水通量、膜污染后水通量、阻力增大系数图；

图3为本发明的PCS基因的相对表达量图；

图4为本发明的微藻生长量、TIN去除率、TIP去除率、Cr⁶⁺去除率图。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明作进一步详细描述：

实施例1：

一种含铬废水的处理方法，包括：

构建膜-光生物反应器：聚偏氟乙烯(PVDF)接枝2-甲基-4-氯苯氧乙酸：在四口烧瓶中加入40mL N,N-二甲基甲酰胺，将2g PVDF粉末溶于N,N-二甲基甲酰胺中，加热，通入N₂30min，加入质量分数为2％的2-甲基-4-氯苯氧乙酸溶液，水浴加热70℃，30min后，加引发剂过氧化苯甲酰(BPO)0.1g，反应3.5h，室温下冷却，加入50mL乙醇沉淀，除去杂质，重复3次，真空干燥24h，得到接枝后的PVDF。

改性PVDF/PVA共混中空纤维膜超滤膜的制备：分别将改性PVDF与PVA真空烘干，以PEG-600为添加剂，将改性PVDF，PVA按80:20的共混质量比溶于二甲基亚砜(DMSO)中，聚合物浓度为20％，98℃水浴搅拌6h，得到均匀铸膜液。将铸膜液倒入搅拌釜中，真空脱泡12h后，在0.2-04MPa的压力下纺丝，喷丝头外径2mm，内径1.2mm，空气层高20cm，温度20℃，湿度65％，挤出速度为2-2.5mL/min，拉伸速度7-8m/min，湿法挤出中空纤维后，立即浸入凝固浴中固化成形，内外凝固浴均为20℃水，流动速度为2-2.5mL/min，纤维成形后进行拉伸，拉伸速度为7-8m/min，纺得的中空纤维放入水中停留24h，用水冲洗干净，取出，浸泡在甘油水溶液中12h，取出，自然干燥，得到中空纤维膜超滤膜。

将制得的中空纤维膜制备成膜组件，膜表面的有效面积为0.02m²，构建膜-光生物反应器(MPBR)，MPBR反应器为圆柱形有机玻璃容器，反应器的总体积和工作体积分别为3.0L和1.5L。

基于微藻培养的含铬废水的处理：先将小球藻预培养在装有BG11培养基的锥形瓶中，放置在光照恒温震荡培养箱中培养，震荡频率100rpm，温度25℃，光照强度161.1μmol/m² s，将培养至对数生长期的小球藻接种至MPBR反应器中。接种完成后连续向反应器内供应模拟的含Cr(Ⅵ)生活废水，废水的成分为：154.3mg/L NH₄Cl，22mg/L KH₂PO₄，125mg/LNaHCO₃，2.5mg/L CaCl₂，27.5mg/L MgSO₄·7H₂O，2.86mg/L H₃BO₃，1.81mg/L MnCl₂·4H₂O，0.22mg/L ZnSO₄·7H₂O，4.99mg/L FeSO₄·7H₂O，0.4mg/L(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O，6.4mg/LK₂Cr₂O₇，4mg/L吡硅酮。进水流量和出水流量相等，反应器内的水力停留时间(HRT)控制为3.0d。待微藻生长到稳定期后，控制小球藻的固体停留时间为40d，每天从反应器中收获藻液总量的1/40，培养过程中光照周期设定为12h/d，反应器表面最大光照强度为180μmol/m²s，曝气量均为0.5L/min。

对比例1：

PVDF未接枝2-甲基-4-氯苯氧乙酸，其余部分和实施例1完全一致。

对比例2：

含铬废水中未加入吡硅酮，其余部分和实施例1完全一致。

对比例3：

PVDF未接枝2-甲基-4-氯苯氧乙酸，含铬废水中未加入吡硅酮，其余部分和实施例1完全一致。

试验例1：

膜亲水性能测试：

用接触角测量仪测定中空纤维膜在多个不同位置上的接触角，取其平均值即得到共混膜的接触角，读数时间统一为水滴落在膜上10s。测试膜上表面接触角、上表面接触角，计算膜上下表面接触角的代数差，差值越大，说明分层现象越严重，相容性越差。

膜抗微生物性能测试：

微藻培养结束后，取出一张化学膜，置于40mL PBS中，标为总生物膜；取出另外一张化学膜，用40mL PBS冲洗表面生长的生物膜，收集PBS于离心管中，标为松散生物膜，振荡5min后，超声3min，弃掉化学膜，将液体振荡2min混匀，迅速取出1mL，分别稀释5000倍和7000倍，得到稀释后的藻液；分别取出200μL置于灭菌后的离心管中，加入等量2X

Bac Light TM Bacterial Viability and Counting Kit混匀，黑暗环境下染色15min；取出200μL染色后的藻液，置于96孔平板中；流式细胞仪以35μL/min注入50μL藻液，计数，总生物膜和松散生物膜的活细胞数量之差即为致密生物膜活细胞数。膜上表面接触角、上下表面接触角的代数差、致密生物膜活细胞数见图1。

由图1可以看出，实施例1和对比例2的膜上表面接触角、上下表面接触角的代数差、致密生物膜活细胞数均明显低于对比例1和对比例3，这说明，PVDF接枝2-甲基-4-氯苯氧乙酸后与PVA的相容性增加，制备的中空纤维膜的亲水性能提高，并且能够较好的抑制藻细胞的生长。

膜抗污染能力测试：

用常规膜通量测试仪器于室温在下测定中空纤维膜的水通量。将膜在工作压力下预压15min，使水通量保持稳定，根据下式计算水通量：

J＝V/(S×t)

其中，V为通过水的体积(mL)，S为膜面积(cm²)，t为测试时间(h)。

测定膜的耐污染性能：

根据下式计算阻力增大系数：

M＝(J₀-J)/J

其中，m为阻力增大系数，J₀为膜污染前水通量，J为膜污染后水通量。膜污染前水通量、膜污染后水通量、阻力增大系数的测试结果见图2。

由图2可以看出，实施例1和对比例2的阻力增大系数明显低于对比例1和对比例3，这说明，用2-甲基-4-氯苯氧乙酸对PVDF进行接枝改性，能够增加与PVA的相容性，提高膜的亲水性能和抗藻细胞生长能力，从而抑制生物膜的形成，提高膜的抗污染能力。

试验例2：

植物络合素合成酶基因(PCS)表达水平的测定：

参照Promega公司的SV Total RNA Isolation Kit操作手册，提取采收的小球藻的总RNA，在PCR管中加入1.5μg RNA，0.5μL Olig(dT)18，0.5μL随机引物，补加无RNA酶水至12μL。70℃保温10min后，迅速置于冰上冷却2min，在该PCR管中加入以下试剂：12μL RNA/引物变性溶液，0.5μL 10mM dNTP Mixture，0.25μL 40U的RNA酶抑制剂，4μL 200U/μL的5×M-MLV buffer，补加无RNA酶水至20μL。反应条件：42℃保温60min，72℃保温15min，得到的cDNA在-20℃保存。

以cDNA为模板，以α-tubulin为内参基因，qPCR扩增引物包括：

α-tubulin基因的引物：

F：GCTATTCGATGTAGTCTGGTGA

R：CAGCTGGACGCTGGTGGTCGAT

PCS基因的引物

F：ACTGCTATCGCTCCATCAGACT

R：GCAGATGTGCCTATCTCCGGTT

反应体系：5μL cDNA，0.5μL上游引物，0.5μL下游引物，10μL 2×Taq PCR MasterMix，4μL ddH₂O。反应条件：95℃30S；95℃3S，60℃34S；45个循环。溶解曲线分析：温度60-95℃，每分钟读一次。进行荧光定量结果分析。PCS基因的相对表达量见图3。

由图3可以看出，实施例1和对比例1PCS基因的相对表达量明显高于对比例2和对比例3，这说明，含铬废水中加入吡硅酮能够促进微藻PCS基因表达。

试验例3：

废水中Cr(Ⅵ)浓度采用酸性二苯碳酰二肼分光光度法测定，总无机磷(TIP)、氨氮(NH₄ ⁺-N)、亚硝酸盐氮(NO₂ ^--N)、硝酸盐氮(NO₃ ^--N)的测定采用国家标准方法，总无机氮(TIN)浓度为NH₄ ⁺-N、NO₂ ^--N和NO₃ ^--N浓度之和。藻浓度采用分光光度法测定，实验中通过干重法准确确定了不同稀释度的藻液浓度，对照其在680nm波长处的吸光度，得到了藻密度-OD₆₈₀标准曲线，方程为：藻密度(g/L)＝0.194×OD₆₈₀-0.04(R²＝0.998)。微藻生长量、TIN去除率、TIP去除率、Cr⁶⁺的去除率见图4。

由图4可以看出，实施例1和对比例1的微藻生长量、TIN去除率、TIP去除率、Cr⁶⁺的去除率明显高于对比例2和对比例3，这说明，含铬废水中加入吡硅酮能够促进微藻的PCS基因表达，促进植物络合素的大量生成，与Cr⁶⁺结合形成CrPCs复合物，提高微藻对Cr⁶⁺的解毒作用，从而提高微藻生长量、提高微藻对Cr⁶⁺和氮磷的去除率。

上述实施例中的常规技术为本领域技术人员所知晓的现有技术，故在此不再详细赘述。

以上实施方式仅用于说明本发明，而并非对本发明的限制，本领域的普通技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，还可以做出各种变化和变型。因此，所有等同的技术方案也属于本发明的范畴，本发明的专利保护范围应由权利要求限定。

序列表

<110> 浙江海洋大学

<120> 基于微藻培养的含铬废水的处理方法

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gctattcgat gtagtctggt ga 22

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

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<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

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<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gcagatgtgc ctatctccgg tt

Claims (5)

1.一种含铬废水的处理方法，其特征在于：包括：在所述含铬废水中培养微藻；

其中，所述废水中加入3-5mg/L吡硅酮；

所述微藻为小球藻，所述小球藻在膜-光生物反应器中进行培养；

所述微藻采用连续培养的方式；

所述膜-光生物反应器中的膜为中空纤维超滤膜；

所述中空纤维超滤膜为PVA/PVDF共混膜；

所述PVDF接枝2-甲基-4-氯苯氧乙酸；

所述PVDF接枝2-甲基-4-氯苯氧乙酸：在四口烧瓶中加入40mL N,N-二甲基甲酰胺，将2g PVDF粉末溶于N ,N-二甲基甲酰胺中，加热，通入N₂ 30min，加入质量分数为2％的2-甲基-4-氯苯氧乙酸溶液，水浴加热70℃，30min后，加引发剂过氧化苯甲酰(BPO)0.1g，反应3.5h，室温下冷却，加入50mL乙醇沉淀，除去杂质，重复3次，真空干燥24h，得到接枝后的PVDF；

所述废水中加入4mg/L吡硅酮。

2.根据权利要求1所述的处理方法，其特征在于：所述含铬废水中六价铬胁迫对小球藻生长的半抑制浓度为3.43mg/L。

3.根据权利要求1所述的处理方法，其特征在于：所述膜-光生物反应器中水力停留时间为2-4d，固体停留时间为38-42d。

4.一种膜-光生物反应器，其特征在于：所述膜-光生物反应器中的膜为PVA/PVDF共混膜制成的中空纤维超滤膜；

其中，所述PVDF接枝2-甲基-4-氯苯氧乙酸。

5.权利要求4所述的膜-光生物反应器在微藻处理含铬废水中的用途。

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